基于DNA提取方法优化转基因小鼠基因分型研究

Optimization of DNA extraction method for genotyping in transgenic mice

摘要

目的 探讨DNA提取方法优化后对转基因小鼠基因分型结果的影响，并比较分析与业内常用试剂盒基因型鉴定结果的差异。 方法 在团队前期专利基础上，改进了DNA裂解液的配方和实验流程，并以新型转录因子Musculin和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）转基因小鼠为例，对基因分型结果进行了比较研究和验证。 结果 DNA提取时现配裂解液配方为100 μL 0.025 N NaOH工作液、160 μL 0.5 M EDTA工作液和40 mL超纯水；每个样本加入180 μL裂解液，100 ℃ 30 min。与相关领域常用的基因分型试剂盒相比，该DNA提取优化方案能够在确保鉴定准确的前提下有效缩短基因分型时间，而且裂解液配置方法简单，反应次数多，步骤更简便，可大幅降低试剂成本和工作量。 结论 本研究提供1种适用于转基因小鼠基因分型的经济、简单、可靠的DNA提取技术，具有较好的应用和推广价值。

Abstract

Objective To explore the influence of optimized DNA extraction on genotyping of transgenic mice，and to compare it with commonly used reagent kits in the field of scientific research. Methods Based on our previous patent，we modified the DNA lysis buffer formula and experimental protocol. Genotyping and validation were carried out using musculin （a novel transcription factor）-transgenic mice and enhanced green fluorescent protein-transgenic mice. Results The DNA lysis solution was prepared immediately before use，and was composed of 100 μL 0.025 N NaOH，160 μL 0.5 M EDTA，and 40 mL ultrapure water. Each sample was mixed with 180 μL DNA lysis solution，at 100 ℃ for 30 min. Compared with the commonly used genotyping kits in relevant fields，the optimized DNA extraction method effectively shortened the genotyping time while ensuring the accuracy of identification，and moreover，the DNA lysis buffer preparation was simple and convenient，enabling more reaction times，and reducing reagent costs and workload considerably. Conclusion This study provides an economical，simple，and reliable DNA extraction technique for genotyping in transgenic mice，which deserves application and promotion.

Graphical abstract

关键词

转基因小鼠 / DNA提取 / 基因分型 / 优化

Key words

transgenic mice / DNA extraction / genotyping / optimization

作为分子机制探讨和研究水平提升的重要工具，转基因动物尤其是转基因小鼠已广泛应用于医学和生命科学研究领域^[1-2]。由于转基因小鼠研发周期相对较长，价格昂贵，大多数实验室选择自行繁育的方式维护种群（特别是条件性敲除基因小鼠），这使得转基因小鼠基因型鉴定即基因分型成为长期、大量并频繁的常态化工作。因此，采用经济可靠、快速便捷、操作简便的基因分型技术将有效降低工作负荷，提升工作效率，是业内实验人员面临的重要应用课题，实用价值明显^[3-5]。

转基因小鼠基因分型的实验流程由DNA提取、聚合酶链式反应（poly-enzyme chain reaction，PCR）和琼脂糖凝胶电泳等3个步骤组成^[6]。由于PCR参数和时间基本固定，相对而言，DNA提取方法的优化可能是降低基因分型成本和时长的关键途径。目前常用的DNA提取方法包括苯酚-氯仿提取、醇沉法、以前2种方法为基础的试剂盒法和煮沸法。前3种方法虽然能够得到较高纯度的样本DNA，但步骤繁琐，试剂过多，成本偏高，不适于长期、大量、高频的基因分型工作；煮沸法虽然简单，但针对裂解液配方改进并获得有效结果的研究还少有报道^[7-8]。

本研究立足前期获得的授权发明专利^[9]，通过10年不同类型转基因小鼠的基因分型实践，进一步对裂解液的配置和实验流程进行了优化，并以新型转录因子Musculin敲除（knock out，KO，-/-）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）敲入（knock in，KI，+/+）小鼠为例，采用相关领域常用的2种试剂盒法为对照，对基因分型结果进行比较研究，旨在为转基因小鼠基因分型提供1种更经济、便捷、准确的实用方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

所用转基因小鼠皆为C57BL/6背景：Musculin杂合子（heterozygote，+/-）小鼠由美国Antagen Phamaceuticals 高闻达教授设计，委托北京百奥赛图基因生物技术有限公司研发；EGFP^+/+小鼠购自江苏华创信诺医药科技有限公司。所有小鼠均在无特定病原（specific pathogen free，SPF）级环境饲养。室内温度控制在20~26 ℃，湿度在50%~60%，照明采取12 h昼夜交替方式。将成年Musculin^+/-小鼠雌雄同笼交配（雄雌比例为1∶1或1∶2），正常繁育获得Musculin野生型（wild type，WT，+/+）、Musculin^+/-和Musculin^-/-小鼠；EGFP^+/+成年小鼠同样雌雄配对，正常繁育。所有仔鼠出生21 d后离乳，种鼠继续交配繁殖。另外，验证实验中作为对照的C57BL/6小鼠购自陆军军医大学大坪医院实验动物中心。本研究获陆军军医大学实验动物福利伦理委员会批准，动物伦理审批编号：AMUWEC20237369。

1.1.2 主要试剂

本研究所用DNA提取试剂来自上海生物工程公司，比较用DNA提取试剂盒购自北京天根公司和南京诺唯赞公司，PCR试剂盒系美国Promega公司产品，PCR引物由重庆柯柏公司合成，Musculin一抗来自美国Novus公司，蛋白质印迹法（western blot，WB）相关试剂购自上海碧云天公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计

分别采集Musculin^+/+、Musculin^+/-、Musculin^-/-、EGFP^+/+和EGFP^-/-基因型小鼠各5只脚趾，长度约3 mm，置于1.5 mL干净EP管内作为检测样本。利用本研究优化方案获得总DNA，最终通过PCR验证样本对应基因型。将上述小鼠样本分别用北京天根公司和南京诺唯赞公司相关试剂盒进行基因分型，比较本研究优化方案与常用试剂盒法的异同；选择基因分型获得的Musculin^+/+和-/-小鼠，常规取脾脏和肌肉组织，采用WB验证Musculin^-/-小鼠中Musculin的表达；选择EGFP转基因小鼠和作为对照的C57BL/6野生型小鼠，常规取脾脏，采用荧光激活细胞分选（fluorescence activated cell sorting，FACS）法（即流式细胞分析）验证EGFP转基因小鼠中的荧光信号，最终确定本研究优化方案是否具有准确性和便捷性。

1.2.2 DNA提取优化方案

预先配制10 N NaOH储存液和0.5 M EDTA（2 mmol/L）工作液，4 ℃保存；DNA提取时现配裂解液（工作液），配方为100 μL 0.025 N NaOH工作液、160 μL 0.5 M EDTA工作液和40 mL超纯水；每个样本加入180 μL裂解液，100 ℃ 30 min。降至室温后，置于4 ℃保存。

1.2.3 北京天根公司试剂盒DNA提取方法

将离心管内小鼠脚趾剪碎制成细胞悬液，10 000 r/min离心1 min，弃上清，加入200 μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；加入20 μL Proteinase K溶液，混匀，56 ℃水浴振荡放置过夜，直至组织溶解；加入200 μL缓冲液GB，颠倒混匀，70 ℃放置10 min，溶液变澄清，短暂离心去除管盖内壁水珠；加入200 μL无水乙醇，充分震荡15 s，可能出现絮状沉淀，简短离心去除管壁水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入1个吸附柱CB3（吸附柱放置收集管内），12 000 r/min离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管；向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，12 000 r/min离心30 s，倒废液，吸附柱放回收集管；向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min离心30 s，倒废液，吸附柱放回收集管；重复上一步操作，离心2 min，将吸附柱置于室温放置数分钟，以晾干残余漂洗液；将吸附柱转入一个干净离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2~5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集至离心管中；弃掉吸附柱，将DNA保存于4 ℃。

1.2.4 南京诺唯赞公司试剂盒DNA提取方法

该公司试剂盒DNA提取步骤与北京天根公司类似，只是所用溶剂与剂量有所区别：剪碎1.5 mL离心管内的小鼠脚趾，加入230 μL Buffer GA和20 μL Proteinase K，混匀置55 ℃水浴过夜至组织完全酶解；加入250 μL Buffer GB，涡旋混匀，70 ℃水浴10 min；加入180 μL无水乙醇吹打混匀；转移混合液至吸附柱内，12 000 r/min离心1 min；弃废液，加入500 μL Washing Buffer A至吸附柱，12 000 r/min离心1 min；弃废液，加入650 μL Washing Buffer B至吸附柱，12 000 r/min离心1 min；重复上一步操作；弃废液，空管离心12 000 r/min，2 min；将吸附柱置于新的EP管，加入预热的30~100 μL的Elution Buffer至吸附柱的膜中央，室温放置3 min，12 000 r/min离心1 min；弃掉吸附柱，将DNA保存于4 ℃。

1.2.5 PCR引物和目的条带

本研究根据前期工作基础^[10]，采用野生型引物P1、普通型引物P2和突变型引物P3鉴定Musculin^+/-亲本后代，P1、P2置于同一PCR反应体系，P2、P3置于另一PCR反应体系，以获得更为清晰的基因分型结果。虽然EGFP^+/+亲本后代只有1种基因型（带绿色荧光），但稳妥起见，本研究仍采用EGFP野生型正向引物、EGFP野生型反向引物、EGFP突变型正向引物和EGFP突变型反向引物用于研究，前2种引物置于同一PCR反应体系，后两种引物置于另一PCR反应体系。待测基因引物序列及目的条带，见表1。

1.2.6 PCR反应体系及参数

Musculin转基因小鼠基因分型所用PCR反应体系为20 μL，包括：样本DNA模板1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，ddH₂O 8 μL，P2 0.5 μL，P1（或P3） 0.5 μL。其中，P1和P2用于鉴定Musculin野生型条带，P2和P3用于鉴定Musculin突变型条带。

EGFP转基因小鼠基因分型所用PCR反应体系也为20 μL，包括：样本DNA模板1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，ddH₂O 8 μL，EGFP野生型（或突变型）正向引物0.5 μL，EGFP野生型（或突变型）反向引物0.5 μL。其中EGFP野生型正、反向引物检测无荧光条带，EGFP突变型正、反向引物检测有荧光条带。

采用美国Bio-Rad公司C1 000^TM Thermal Cycler型PCR仪完成PCR反应，相关参数，见表2。

1.2.7 琼脂糖凝胶电泳

制备2%琼脂糖凝胶，置于电泳缓冲液中，以Super Gel Red为显影剂，吸取各品系转基因小鼠通过不同方法获得的PCR产物9 μL加入电泳孔中，DNA marker为BM 2 000，电泳仪系北京六一产品，参数为180 V、20 min。电泳结束后，观察各品系转基因小鼠待测基因目的条带。

1.2.8 WB验证Musculin^-/-小鼠Musculin表达

选取通过本研究DNA提取优化方案获得的Musculin^+/+和Musculin^-/-小鼠，常规处死后取适量脾脏和肌肉组织，按WB试剂盒要求制备蛋白样品，完成十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳、转膜、封闭、Musculin一抗孵育、二抗孵育、显影等步骤。明确本研究优化方案获得的基因分型结果能否得到WB实验验证。

1.2.9 FACS验证EGFP^+/+小鼠荧光信号

选取通过本研究DNA提取优化方案获得的EGFP突变型小鼠和作为对照的C57BL/6野生型小鼠，常规处死后取适量脾脏组织，磨碎制备细胞悬液，裂解红细胞后离心去上清，PBS清洗1~2次，离心，重悬，最后通过美国ACEA NovoCyte流式细胞仪（选择FITC通道）检测样本是否带有EGFP信号，以此验证本研究优化方案获得的基因分型结果。

2 结 果

2.1 Musculin转基因小鼠基因分型

结果显示，DNA样本上样量相同的条件下，针对Musculin转基因小鼠+/+、+/-和-/-基因分型的各种方法得到的结果一致，而且条带清晰，易于分辨（图1）。图1A：上两排1~15号使用北京天根公司试剂盒，下两排1~5号使用南京诺唯赞试剂盒；图1B：16-30号使用本研究优化方案；Musculin^+/+：11~15号、26~30号，Musculin^+/-：1~5号、16~20号，Musculin^-/-：6~10号、21~25号。

其中，作为阳性对照的各公司试剂盒方法获得的目的条带（图1A）都比本研究优化方案（图1B）略亮，杂带也相对较多。

2.2 EGFP转基因小鼠基因分型

与Musculin转基因小鼠基因分型结果相似，各种方法获得的目的条带清晰可辨，基因型鉴定准确（图2）。图2A：1~5号使用北京天根公司试剂盒，6~10号使用南京诺唯赞试剂盒；图2B：11-15号使用本研究优化方案。其中，各公司试剂盒方法获得的2条目的条带都比较宽亮，突变型均有杂带（图2A）；本研究优化方案获得的2条目的条带清晰且无杂带，突变型条带亮度略弱于野生型（图2B）。

2.3 Musculin蛋白水平在Musculin转基因小鼠中的表达

WB结果显示，Musculin^-/-小鼠脾脏和肌肉组织中无Musculin蛋白表达，而Musculin^+/+小鼠表达Musculin正常（图3）。GAPDH在上述基因型小鼠中均有表达，说明WB实验体系稳定。

2.4 EGFP信号在EGFP转基因小鼠中的检测

FACS结果显示，同等条件（主要为脾脏淋巴细胞）圈取目标细胞并设门，EGFP转基因小鼠脾脏细胞中带有EGFP信号细胞比例为94.01%，而作为对照的C57BL/6小鼠相应阳性细胞仅为0.01%（图4）。

3 讨 论

随着医学和生命科学研究的深入，转基因小鼠在探讨分子机制、提升研究水平中的作用日益凸显，已成为高等院校、科研院所和研究型医院不可或缺的研究工具。例如，Musculin转基因小鼠能够探讨新型转录因子Musculin在创伤和疾病中的作用^[11-13]，尤其是与炎症和免疫的关系^[14-15]，Musculin敲除或条件性敲除研究研究能够直观展示Musculin在上述生命活动和医学实践中的作用机制，科学性强，EGFP小鼠则为细胞追踪提供可能，促进组织发育过程和细胞治疗机制的探讨^[16-17]。可见，转基因小鼠品系不断增加、种群日益扩大的发展趋势已经形成。

随之而来的工作就是长期、大量、频繁地转基因小鼠基因分型，这是顺利开展后续科研工作的前提。基于转基因小鼠基因分型的科研需求将长期存在，操作简便、成本低廉、结果可靠的基因型鉴定方法将有效提升工作效率，势必受到广大科研人员的认可，并在科研市场占据明显优势。另一方面，由于基因分型实验涉及的PCR和琼脂糖凝胶电泳时长和参数与设备相关，相对固定，因此，基因分型的另一流程-DNA提取方案的优化则成为实验室提升基因型鉴定效率的主要手段。

传统DNA提取法包括前述苯酚-氯仿提取、醇沉法等，步骤多、试剂杂、不安全，对于需长期大量的转基因小鼠基因型的鉴定工作而言，耗时耗力^[18-19]。科研市场上常用的基因分型试剂盒虽然使用方便，但流程偏长、价格偏高，对于经费有限且有转基因小鼠实验需求的实验室而言仍有改进空间。考虑到基因分型对DNA纯度要求相对不高，结合本团队前期工作和煮沸法相关报道^[9,20-21]，本研究对DNA提取法的优先方案重点考虑配置合适的DNA裂解液和简化处理时间。

本研究以Musculin和EGFP转基因小鼠为例，并选取业内普遍使用、来自2家公司的基因分型试剂盒作为阳性对照^[22-23]，开展基因分型效果对比实验。结果发现，3种方法都能得到可靠结果：采用2种试剂盒的目的条带都比较亮但易有杂带，采用本研究优化方案的目的条带亮度略弱，但无杂带。前者出现杂带的原因可能是提取DNA的过程中没有加入RNase溶液以去除RNA干扰，后者条带暗可能是由于煮沸法本身提取的纯度低和DNA量少的缘故^[24]，但并不影响最终结果。另外，在上样量一致的条件下，图1中1~2泳道条带（试剂盒法）相对弱于16~17泳道（本研究优化方案），排除系统误差，可能与试剂盒法和本研究优化方案在总DNA获取中采取不同的处理方法有关，但不会影响基因分型结果判读。这主要是因为用于基因分型的常规PCR本身属于定性结果，有条带即可证明阳性，而且该结果还反证本研究优化方案更精准、更易判读。图2中11~15泳道多余明带可能与其样本是EGFP转基因小鼠有关。该品系改造过程中，可能存在基因敲入和修饰等操作，有可能发生其他基因错配，而鉴定该品系的阳性条带是图2中下排泳道，即代表有荧光条带的565Kb条带，因此部分样本上排多余明带不会影响基因型鉴定结果。3种方法中，采用本研究优化方案的DNA提取时间最短，仅仅需30 min，而采用2种试剂盒均需消化过夜。而且，本研究优化方案针对裂解液的配置方法简单，反应次数（检测样本数量）远多于2种试剂盒，从而大幅度降低了试剂成本。但是，运用本研究优化方案时要注意试剂配置时间，若长时间未使用（3个月以上）需重新配置，否则会影响基因分型的准确性。需要说明的是，本研究优化方案在定性鉴定转基因小鼠基因型方面优势明显，但对于样本目的基因丰度有特别要求（例如目的基因丰度特别低的样本）的检测，仍建议采用更精确的定量检测方法，例如实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）。

本研究涉及的DNA提取优化方案是经过十余年实践、立足前期工作基础并加以改进而获得，可为转基因小鼠基因分型提供1种经济、简单、可靠的DNA提取技术，具有较好的应用和推广价值。但是，该研究还需在样本例数、转基因品系和动物种类方面加以拓展，以进一步证实其广泛性和实用性。

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基金资助

重庆市自然科学基金资助项目(CSTB2023NSCQ-MSX0014)