建立腰椎动静力不稳山羊模型用于椎间盘退变研究

Establishment of a goat model of lumbar static and dynamic instability for the research on intervertebral disc degeneration

摘要

目的 建立有应用价值的腰椎动静力不稳的山羊模型，模拟人体局部因素的影响和病理生理的应力负荷对椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）的作用。 方法 通过腰椎动静力不稳手术（lumbar dynamic and static instability，LDSI）破坏山羊脊柱的后柱结构，包括离断竖脊肌、背阔肌、腰最长肌、棘肌等破坏腰椎动态力学稳定，离断腰椎棘突、棘上韧带、棘间韧带等破坏腰椎静态力学稳定，使腰椎产生动态力和静态力的失衡，造成脊柱后柱稳定性的丧失。以生物力学稳定性为突破点，而不破坏椎间盘结构的完整性，建立腰椎动静力不稳的山羊模型，并通过52周的术后随访，利用腰椎X线片、磁共振以及组织病理学变化等技术手术评估山羊的椎间盘高度指数 （disc height index，DHI），Pfirrmann MRI分级和Masuda组织学评分等。 结果 LDSI组山羊腰椎的DHI在术前0周（0.184±0.015），术后26周（0.105±0.006）和术后52周（0.075±0.007）存在差异（0周vs. 26周，P<0.05；26周vs. 52周，P<0.05）。LDSI组山羊腰椎的Pfirrmann分级在术前0周（1.167±0.408），术后26周（2.333±0.516）和术后52周（3.667±0.817）存在差异（0周vs.26周，P<0.05；26周vs.52周，P<0.05）。LDSI组山羊腰椎的Masuda组织学评分在术前0周（3.500±0.577），术后26周（6.250±0.957）和术后52周（8.000±0.816）存在差异（0周vs. 26周，P<0.05；26周vs. 52周，P<0.05）。 结论 LDSI能够造成山羊椎间盘高度降低、终板边界模糊和含水量降低，在不破坏椎间盘结构完整的基础上模拟了人体长期反复劳损而导致的IVDD，更符合人体实际，有助于其发病机制的研究。

Abstract

Objective To establish a practical large animal model of intervertebral disc degeneration（IVDD） for the simulation of the influence of local factors in the human body and the role of pathophysiological stress load on IVDD. Methods In this study，lumbar dynamic and static instability（LDSI） surgery was performed to damage the posterior column structure of the goat spine； the muscles including erector spinae，latissimus dorsi，longissimus lumborum，and spinalis were ligated to destroy the dynamic stability of the lumbar spine，and the spinous process，supraspinous ligament，and interspinous ligament were ligated to destroy the static stability of the lumbar spine，resulting in the imbalance of dynamic and static forces of the lumbar spine and the loss of the stability of the posterior column. With biomechanical stability as the breakthrough point，a goat model of lumbar dynamic and static instability was established without destroying the structural integrity of the intervertebral disc，and during 52 weeks of postoperative follow-up，lumbar spine X-ray，magnetic resonance imaging（MRI），and histopathological changes were used to evaluate disc height index（DHI），Pfirrmann MRI grade，and Masuda histological score. Results In the LDSI group，the DHI of goat lumbar spine was 0.184±0.015 at week 0 before surgery，0.105±0.006 at 26 weeks after surgery，and 0.075±0.007 at 52 weeks after surgery （0 week vs. 26 weeks：P<0.05；26 weeks vs. 52 weeks：P<0.05）. In the LDSI group，the Pfirrmann grade of goat lumbar spine was 1.167±0.408 at week 0 before surgery，2.333±0.516 at 26 weeks after surgery，and 3.667±0.817 at 52 weeks after surgery（0 week vs. 26 weeks：P<0.05；26 weeks vs. 52 weeks：P<0.05）. In the LDSI group，the Masuda histological score of goat lumbar spine was 3.500±0.577 at week 0 before surgery，6.250±0.957 at 26 weeks after surgery，and 8.000±0.816 at 52 weeks after surgery（0 week vs. 26 weeks：P<0.05；26 weeks vs. 52 weeks：P<0.05）. Conclusion LDSI can cause the reduction in the height of the intervertebral disc，the blurring of endplate boundary，and the reduction in water content in goats. It simulates the process of IVDD caused by long-term repeated strain of human body without destroying the structural integrity of the intervertebral disc，which is more in line with the real condition of human body and may provide help for research on the pathogenesis of IVDD.

Graphical abstract

关键词

椎间盘退变 / 山羊模型 / 腰椎动静力不稳

Key words

intervertebral disc degeneration / goat model / lumbar static and dynamic instability

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）是指在一系列复杂的分子机制和机械应力作用下的IVD衰老和损伤，可导致腰痛、神经受压甚至残疾^[1-2]。随着全球人口老龄化加重，IVDD患者急剧增多，严重者通常需要手术治疗，并且手术治疗可能会加剧邻近健康椎间盘的退变，已在世界范围内造成了巨大的社会经济负担^[3-5]。然而，少见合适的动物模型和造模方式能较真实地模拟人体局部因素的影响和病理生理的应力负荷对IVDD的作用^[6-7]。因此，有必要探索能模拟人类长期反复劳损而自然诱发IVDD的理想实验动物模型用于其机制与治疗的研究。

山羊来源充足，寿命较长而可供长期研究，性格温顺而容易圈养，拥有与人类脊柱相似的尺寸与构造，能获取大量血、尿以及骨标本^[8-9]。成年山羊的脊索细胞基本消失，其髓核的蛋白多糖含量和整个IVD的力学结构与人类相似^[10]。山羊IVD的厚度、高度、前后径、纤维环的水分含量、胶原含量和胶原纤维的取向角度等与人体IVD结构均相似^[11-12]，可以较真实反映人体IVDD的客观规律，较全面模拟人体IVDD的病理过程，是一种贴近临床、经济实用的用于IVDD研究的理想动物模型。

当前，在大型和小型动物模型中都采用了多种诱导IVDD的方法，包括化学溶核（以酶促诱导髓核降解）、髓核抽吸、纤维环损伤（撕裂或针刺）或改变机械负荷^[13-17]。但目前尚无具有可操作性强、可靠性好、可重复性强的山羊造模方式在保持IVD不受过多的外力干扰的同时，可以成功诱导IVDD。因此，本课题拟以椎间盘及脊柱相关结构的生物力学稳定性为突破点，干扰腰椎动态力与静态力的平衡，以此建立腰椎动静力不稳的山羊IVDD模型。

1 材料与方法

1.1 动物

山羊购自上海甲干生物科技有限公司，共12只山羊用于本研究（雌性，36月龄）。所有山羊术前均健康，并通过了防疫检查。所有山羊术前均接受了脊柱X线和磁共振成像 （magnetic resonance imaging，MRI）扫描，以确保不存在IVDD相关疾病。山羊饲养在标准实验室条件下（22 ℃恒温，12 h光/暗循环的通风环境），被允许自由饮水和进食。

1.2 手术及分组

随机选取6只山羊作为手术处理组，进行腰椎动静力不稳手术（lumbar dynamic and static instability，LDSI），其余6只为对照组，进行SHAM。术前禁食禁水24 h。山羊术前麻醉用药采用肌肉注射舒泰^®50（盐酸替来他明盐酸唑拉西泮复合剂，10 mg/kg），维持术中麻醉采用3 mg/kg舒泰^®50联合吸入式全身麻醉气体（异氟烷，3%，1 L/min）。所有山羊接受围术期静脉注射抗生素（头孢唑肟钠，2 mg/kg）。对于SHAM组山羊，麻醉后置于手术台上，俯卧位，备皮、描绘手术标志并常规用碘伏消毒手术区域。根据棘突触诊，使用腰后正中线入路，起自L₁棘突纵行向尾端制作15 cm的纵向切口。使用电刀烧灼止血，逐层解剖皮下层、腰背筋膜直至棘上韧带。对于LDSI组山羊，在上述操作后，继续钝性分离肌筋膜，使用牵开器将竖脊肌向外侧牵开，暴露腰椎后柱视野后，离断竖脊肌、背阔肌、腰最长肌、棘肌、棘上韧带和棘间韧带，利用咬骨钳剪除腰椎棘突。2组山羊完成相应手术后，严密止血，将肌肉、筋膜、皮肤分别逐层缝合。术中始终保持严格的无菌操作。定期更换敷料，直至切口部位完全愈合。兽医人员每天至少观察1次动物的总体健康状况和外观，并仔细监测疼痛、不适、步态或姿势的迹象。手术后对山羊进行52周的随访。

1.3 X线片分析

术前0周、术后26周及术后52周在全身麻醉下对山羊进行腰椎X线检查（上海吉米，S320）。IVD高度的变化通过椎间盘高度指数（disc height index，DHI）进行评估^[18-19]。在中线上及距中线两侧椎间盘宽度的25%处测量椎间盘高度和相邻椎体高度。DHI 表示为从中线到椎间盘中央50%宽度边界的3个测量值的平均值除以2个相邻椎体高度的平均值。DHI的计算公式^[20]为：DHI=2（DH1+DH2+DH3）/[（PV1+ PV2+PV3）+（DV1+DV2+DV3）]。

1.4 MRI分析

术前、术后26周及术后52周在全身麻醉下对山羊进行腰椎MRI检查（上海联影，UMR580）。使用以下设置获得正中矢状面中的T2加权切片：快速自旋回波序列，重复时间为3 200 ms，回波时间为100 ms，切片厚度为1 ms，间隙为0.3 mm。根据Pfirrmann MRI分级系统^[21]评估IVD变性分级，MRI图像分为I级至V级。

1.5 组织学分析

两组分别各自随机选择3只山羊的L_3/4、L_4/5、L_5/6椎间盘，分别做未脱钙骨硬组织切片和脱钙骨组织切片。未脱钙骨硬组织切片与染色：在4%多聚甲醛中固定120 h后，梯度酒精依次脱水，随后浸塑、包埋，切成10 μm的切片。每个切片均用苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）和Masson染液进行染色。脱钙骨组织切片：在4%多聚甲醛中固定120 h后，用10% EDTA脱钙6个月，随后包埋在石蜡中，切成5 μm的切片。每个切片均用H&E和Masson染液进行染色，对IVD整体结构、髓核、纤维环以及软骨终板进行综合分析。使用光学显微镜（Nikon，Japan）观察图像，运用Koichi Masuda等^[15]建立的Masuda组织学评分系统和先前发表的组织学分级系统^[22-23]分别评估椎间盘退变程度。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 20.0软件对数据进行分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 建立山羊LDSI动物模型

术前，先对山羊拍摄腰椎侧位X线片（图1A），以确保不存在IVDD相关疾病。山羊麻醉后置于手术台上，备皮后根据山羊肋骨、髂骨和棘突等骨性标志描绘手术标志（图1B）。严格遵守无菌操作原则下，采取腰后正中线入路，起自L₁棘突纵行向尾端制作15 cm的纵向切口（图1C）。使用电刀烧灼止血，逐层解剖皮下层、腰背筋膜直至棘上韧带，钝性分离肌筋膜，使用牵开器将竖脊肌向外侧牵开，暴露腰椎后柱视野（图1D）。随后，离断竖脊肌、背阔肌、腰最长肌、棘肌、棘上韧带和棘间韧带，并利用咬骨钳剪除腰椎棘突（图1E）。手术后2周，再对山羊拍摄腰椎侧位X片以确认手术成功（图1F）。

2.2 LDSI诱发山羊腰椎间盘间隙狭窄

为了比较SHAM组和LDSI组山羊术前和术后26周和52 周的椎间盘退变程度，本研究测量了各组山羊的L_3/4腰椎间盘的DHI。X线片结果显示（图2A、B），SHAM组山羊腰椎的术前0周，术后26周和术后52周的DHI（0.189±0.014，0.185±0.009，0.178±0.007）并不存在差异（图2E，F=1.922，P>0.05）。随着年龄的增长，椎间盘只是发生了缓慢的退变。然而，LDSI组山羊的X线片结果显示（图2C、D），其腰椎的术前0周（0.184±0.015），术后26周（0.105±0.006）和术后52周（0.075±0.007）的DHI差异均有统计学意义（图2F，0周vs. 26周，F=84.830，P<0.001；26周vs. 52周，F=84.830，P=0.032）。在LDSI组山羊中，术后26周的DHI高于术前0周，而52周的DHI也高于26周。这些结果表明，腰椎动静力不稳会加速椎间盘高度降低和软骨终板边界模糊。

2.3 LDSI诱发山羊腰椎间盘MRI信号变化

为了更清晰地展现椎间盘的变化，本研究进一步测量了SHAM组和LDSI组山羊术前0周和术后26周和52周的椎间盘MRI T2加权信号强度的变化。根据MRI结果显示（图3A、B），SHAM组山羊腰椎的术前0周，术后26周和术后52周的Pfirrmann分级（1.167±0.408，1.501±0.548，1.833±0.753）并不存在差异（图3E，F=1.935，P>0.05）。3个时间段的椎间盘信号均匀，呈明亮的白色高强度信号，随着年龄增长，椎间盘只有缓慢的信号变化。然而，LDSI组山羊的MRI结果显示（图3C、D），其腰椎的术前0周（1.167±0.408），术后26周（2.333±0.516）和术后52周（3.667±0.817）的Pfirrmann分级差异均有统计学意义（图3F，0周vs.26周，F=25.610，P=0.012；26周vs.52周，F=25.610，P=0.005）。尤其是术后52周的LDSI组山羊椎间盘信号完全变暗，椎间盘结构塌陷（图3D）。这些结果表明，腰椎动静力不稳会加速椎间盘含水量降低和椎间盘老化，诱发IVDD。

2.4 LDSI诱发山羊腰椎间盘组织病理学变化

为了进一步观察山羊IVD在微观组织学上的病理学变化，本研究在LDSI术前0周、术后26、52周分别对LDSI组的山羊IVD进行了切片分析。如图4A、B所示，IVD的变化在H&E染色与Masson染色上呈现出一致的结果。简而言之，在LDSI术后26周，山羊的髓核组织逐渐被混乱的纤维组织所取代，而纤维环逐渐出现破碎和扭曲，部分软骨终板消失。随着时间的推移，在LDSI术后52周，山羊的髓核组织体积减小并出现了明显的结构性空洞，纤维组织非常混乱，髓核和纤维环之间的边界出现了中断，软骨终板出现明显的钙化。此外，山羊IVD的Masuda评分结果（图4C、D）表明，LDSI组山羊腰椎的Masuda组织学评分在术前0周（3.500±0.577），术后26周（6.250±0.957）和术后52周（8.000±0.816）存在差异（图3F；0周vs. 26周，F=32.220，P=0.002；26周vs. 52周，F=32.220，P=0.031）。山羊IVD的组织学分级结果也符合这一变化。这些结果表明，腰椎动静力不稳会诱发IVD椎间盘髓核基质的纤维化、椎间盘纤维环组织的崩解以及软骨终板边界的破坏，最终导致IVDD。

3 讨论

IVDD会引起多种体征和症状，例如腰痛、椎间盘突出和椎管狭窄，造成高昂的社会和经济成本。目前，IVDD可根据患者症状采取非手术治疗和手术治疗。但这些都只能缓解疼痛，并不能逆转疾病进展和重建脊柱生物力学功能^[5]。建立合适的临床前动物研究模型是将新兴疗法从实验室转化为临床人体应用的重要步骤。近年来，许多学者通过不同种类动物与造模方法建立IVDD动物模型，用于退变机制和治疗方法的探索与研究^[24]。然而，这些动物模型设计在动物种类、相似性、可靠性、可重复性、可控性与造模周期等方面均有不足之处，未有能较真实模拟人类椎间盘退变过程的理想模型。例如，鼠、兔等小型动物椎间盘体积较小，模型制作过程损伤较大，解剖结构、生理学特点及脊柱负荷情况与人类差异明显，相似性较低^[25-26]；恒河猴、猕猴等灵长类动物的伦理复杂、实验成本极高，很难广泛应用^[27-28]；沙鼠与狒狒等自发出现椎间盘退变倾向的特殊动物种属特异性强，退变率不稳定^[29-30]。然而，山羊IVD的解剖结构、大小、生物力学特性和生化成分与人类IVD相对接近^[31]，这使得山羊成为更好的模型来模拟人类IVDD的病理生理学。

脊柱生理功能的维持主要依靠椎体、椎间盘、小关节、韧带及肌肉等结构的协同作用，脊柱稳定性是实现其正常生理功能的先决条件。目前在大型和小型动物模型中采用了多种诱导IVDD的造模方法，但都各有优缺。例如，结构损伤模型通过物理方法损伤纤维环、髓核或终板，其中纤维环穿刺法的应用较为广泛。通过穿刺导致纤维环结构发生不可逆的破坏，急性椎间盘突出，髓核压力降低引起机械和生化的级联反应，最终发展为IVDD^[25，32]。尽管纤维环穿刺法操作简单且重复性好，但退变的程度严重，进展较快，不符合人类椎间盘缓慢退变的规律，并且研究之间的破坏程度差异较大，难以标准化。相比而言，化学诱导模型通过将化学试剂注射到IVD来诱导IVDD，主要包括完全弗氏佐剂、软骨素酶ABC和木瓜凝乳蛋白酶等^[17，33]。化学试剂可以增加蛋白多糖的分解，从而引起髓核变性，纤维环结构紊乱，模拟了人类椎间盘中蛋白多糖的丢失，并且药物的剂量易于控制。然而注射的化学药物影响了生化检测与干预治疗的结果，注射的过程也造成了结构损伤。此外，机械压缩模型通过对脊柱施加轴向载荷，可以直接损伤椎间盘的结构^[34]。然而，该方法仅模拟了单一力学因素，并且过度载荷容易导致椎体结构与脊髓损伤。基因敲除模型通过敲除特定基因导致椎间盘关键物质合成代谢障碍，从而影响椎间盘组成^[35]。但由于基因敲除仅证实了单一基因的作用，并且操作难度高及费用较大，不适用于广泛研究。总而言之，目前尚无具有可操作性高、可靠性好、可重复性强的大型动物造模方式在保持IVD不受过多的外力干扰的同时，可以成功诱导IVDD，较好地模拟人体中的IVDD。

综上所述，本研究中构建的腰椎动静力不稳山羊模型可以较成功地模拟人类IVDD的过程。该模型在未暴力破坏IVD的条件下，在长达1年的随访周期内缓慢呈现出从轻度到重度的一系列退行性变化，包括椎间盘高度、骨终板变化、MRI评分和组织学分级等。随着退变严重程度的增加，山羊IVD的Pfirrmann等级增加，这也与在老化和退变的人类IVD中观察到的MRI变化一致。在组织学上，该模型中实现的退变范围涵盖了在人类IVDD中观察到的结构和成分的变化范围，包括椎间盘高度逐渐降低、髓核基质的纤维化以及椎间盘纤维环组织的破坏。该动物模型构建时保持了IVD的结构完整性，具有良好的可操作性，与人类IVDD相似性高、可靠性好、可重复性强，较真实地模拟了人类脊柱局部生物载荷对IVDD的作用。此外，腰椎动静力失衡诱发IVDD的进程相对较缓，可控性较好，为缓解或逆转退变进程的药物研发提供了足够的时间窗口，有待进一步研究验证。

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基金资助

国家自然科学基金面上资助项目(8187109)

上海市科学技术委员会“科技创新行动计划”实验动物研究领域资助项目(21140904600)

上海市卫生健康委员会面上资助项目(202340081)