回顾性分析染色体核型分析和CMA在产前诊断中的应用价值

A retrospective analysis of the application value of chromosome karyotyping and chromosomal microarray analysis in prenatal diagnosis

摘要

目的 探讨羊水细胞染色体核型分析和染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）在产前诊断中的应用价值。 方法 回顾性分析1 575例羊水染色体核型分析结果和CMA结果。 结果 ①染色体核型分析和CMA异常检出率分别为5.84%和11.68%，联合应用2种方法异常检出率为13.65%；②核型分析正常样本中，超声结构异常、超声软指标（ultrasound soft markers，USM）提示和超声未见异常病例，致病性和可能致病性拷贝数变异（copy number variations，CNVs）检出率分别为3.03%、1.54%和1.10%。 结论 在产前诊断中联合应用染色体核型分析和CMA可有效提高染色体异常检出率，尤其是超声结构异常人群。嵌合体病例需根据具体情况选择适宜的检测技术和样本。特殊微结构变异位点应当进行长期有效的病例随访。

Abstract

Objective To investigate the application value of chromosome karyotyping and chromosomal microarray analysis（CMA） in prenatal diagnosis. Methods We retrospectively analyzed the karyotyping and CMA results of 1 575 amniotic fluid samples. Results The detection rates of abnormalities by karyotyping，CMA，and their combination were 5.84%，11.68%，and 13.65%，respectively. In the samples of normal karyotypes， for cases of sonographic structural anomalies，ultrasound soft markers，and normal structure on ultrasonography，the detection rates of pathogenic/likely pathogenic copy number variations were 3.03%，1.54%，and 1.10%，respectively. Conclusion Prenatal abnormality detection rate can be improved effectively by combining karyotyping and CMA，especially for cases of sonographic structural anomalies. The detection of chimerism should select appropriate technologies and samples. Special microstructural variations should be monitored for a long term.

Graphical abstract

关键词

染色体核型分析 / 染色体微阵列分析 / 产前诊断 / 基因组拷贝数变异

Key words

chromosomal karyotyping / chromosomal microarray analysis / prenatal diagnosis / copy number variation

据2012年我国出生缺陷防治报告，我国出生缺陷的发生率约为5.6%^[1]，其中染色体畸变约占出生缺陷遗传学病因的80%以上^[2]，主要包括染色体数目异常和结构异常。羊水细胞染色体核型分析能够检出染色数目异常和易位、倒位、插入及较大片段缺失/重复等结构异常。随着产前诊断技术的发展及对人类全基因组拷贝数变异（copy number variations，CNVs）的分析，由CNVs所致的染色体微缺失/微重复综合征（microdeletion/microduplication syndromes，MMS）已明确300余种，综合发病率近1/600，占染色体畸变所致出生缺陷的一半^[2-5]。染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）基于固态芯片平台，能对微量DNA样本进行分析，检出>100 kb的CNVs。本研究联合应用羊水细胞染色体核型分析和CMA对1 575例高危单胎孕妇羊膜腔穿刺羊水标本进行检测，并对检测结果进行回顾性分析，以评估两者在产前诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2017年1月至2018年10月在重庆市妇幼保健院产前诊断中心就诊的高危单胎孕妇1 575例，年龄（33±5）岁（范围19~47岁），孕周（19.6±2.6）周（范围15~33周）。病史资料记录完整，符合卫生部产前诊断指征，至少满足以下１项：①高龄妊娠（妊娠年龄≥35岁）；②唐氏综合征血清学筛查高风险；③无创产前筛查（noninvasive prenatal testing，NIPT）高风险；④超声筛查异常；⑤不良孕产史或遗传性疾病家族史（图1）。

1.2 方法

1.2.1 羊水标本采集

孕妇和家属均签署《羊膜腔穿刺术及羊水染色体产前诊断知情同意书》和《经腹羊膜腔穿刺术后注意事项知情同意书》，经重庆市妇幼保健院医学伦理委员会批准，1 575例入选孕妇在B超引导下经腹行羊膜腔穿刺术，抽取30 mL羊水。

1.2.2 染色体核型分析

按细胞遗传实验室羊水细胞培养及染色体核型分析标准操　作程序：20 mL羊水离心，弃上清，双线培养7~9 d（37 ℃，5%二氧化碳），收获细胞、制片、G显带。至少计数20个中期分裂相，分析5个核型，参考《人类细胞遗传学国际命名体制》（ISCN2013）描述核型分析结果。

1.2.3 CMA

按照Illumina Human CytoSNP-12芯片操作手册10 mL羊水离心，弃上清，DNeasy核酸提取试剂盒（DNeasy Blood & Tissue Kit，Qiagen）提取羊水细胞DNA，美国Illumina CytoSNP-12芯片，ISCAN扫描系统采集数据，应用Karyostudio软件，结合国际常用基因组与表型公共数据库，包括OMIM（https://www.omim.org/）、ClinGen（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen/index.shtml/）、DGV（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/）、DECIPHER（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/）等分析结果。按照CNVs临床意义界定指南^[6]对>100 kb的CNVs进行分类：①致病性（pathogenic，P）；②可能致病性（likely pathogenic，LP）；③临床意义不明确（variants of unknown significance，VOUS）；④可能良性（likely benign，LB）；⑤良性（benign，B）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行配对卡方检验，比较2种方法在不同指征分组中的差异。统计输出Kappa值，Kappa≥0.75，说明2种方法诊断结果一致性较好；0.4≤kappa<0.75，说明2种方法诊断结果一致性一般；Kappa<0.4，说明2种方法诊断结果一致性较差。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 染色体核型分析结果

针对所有样本染色体核型分析检出染色体多态性变异68例，染色体异常92例，异常检出率5.84%（92/1 575），其中染色体数目异常51例，包括21三体29例、18三体7例、性染色数目异常15例；染色体结构异常35例，包括平衡易位25例、倒位4例、缺失3例、重复1例、衍生染色体2例；嵌合体6例，包括2例性染色体嵌合，2例平衡易位嵌合，1例21三体嵌合和1例标记染色体嵌合（表1）。

2.2 CMA结果

针对所有样本CMA检出异常184例，异常检出率11.68%（184/1 575），其中非整倍体51例，嵌合体4例，杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）11例，CNVs 118例，包括致病性CNVs（pCNVs）18例，可能致病性CNVs（lpCNVs）9例，VOUS 91例（表2）。

2.3 联合应用核型分析和CMA结果分析

针对所有样本联合2项技术共检出异常215例，异常检出率13.65%。其中核型分析和CMA均异常61例，核型异常而CMA正常31例，核型分析额外检出率1.97%；核型分析正常而CMA异常123例，CMA额外检出率7.81%，其中pCNVs和lpCNVs共21例，检出率为1.33%（表3）。

2.4 染色体核型分析未见异常病例CMA检出结果分析

染色体核型分析正常病例共计1 483例，其中超声检查结构异常132例，软指标（ultrasound soft markers，USM）提示259例，超声检查未见异常1 092例。核型分析正常样本中共检出pCNVs和lpCNVs 20例，检出率1.35%，其中超声检查结构异常病例pCNVs和lpCNVs共4例，检出率3.03%，USM提示病例pCNVs和lpCNVs共4例，检出率1.54%，超声检查未见异常病例pCNVs和lpCNVs共12例，检出率1.10%（表4）。

2.5 不同临床指征组间核型分析与CMA检出结果分析

根据产前诊断指征不同1 575例样本可分为6组：高龄组、唐筛高风险组、NIPT高风险组、超声异常组、USM提示组（包括NT增厚、单脐动脉、鼻骨发育不良等）和不良孕产史及遗传性疾病家族史组（包括夫妇染色体异常）。通过对各组核型分析和CMA检出结果分析，除NIPT高风险组和不良孕产史及遗传性疾病家族史组外，核型分析与CMA检出率均有明显差别。NIPT高风险组两种方法检出结果一致性好（Kappa=0.828，P<0.001）；不良孕产史及遗传性疾病家族史组2种方法检出结果一致性较差（Kappa=0.102，P>0.05）；其他各组2种方法检出结果一致性较好（表5）。

2.6 妊娠结局

2.6.1 染色体数目异常

羊水细胞染色体核型分析染色体数目异常55例，54例涉及18、21和性染色体数目异常，均终止妊娠；1例标记染色体嵌合体（母亲轻微智力障碍，外院外周血染色体检查异常，拒绝提供报告）顺产未见明显异常，随访至4⁺岁，监护人述语言和智力发育迟缓（表6 case 1）。

2.6.2 染色体结构异常

羊水细胞染色体核型分析染色体结构异常37例，6例非平衡性结构异常与CMA检出结果一致，终止妊娠（表6 case 2~7）。染色体易位或倒位31例继续妊娠，其中17例染色体结构异常遗传自表型正常的亲本。

2.6.3 部分CNVs

CMA检出pCNVs 18例，6例染色体部分缺失或重复，包含较多基因，与核型分析结果一致，均终止妊娠。12例MMS，分别为DiGeorge综合征3例，16p11.2微重复综合征2例和微缺失综合征2例，16p13.11微缺失综合征1例，Potocki-Lupski综合征1例（17p11.2微重复），腓骨肌萎缩综合征（charcot-marie-tooth syndrome type 1A，CMT1A）1例（17p12微重复），肾囊肿与糖尿病综合征（Renalcysts and Diabetes syndrome，RCAD）1例（17q12微缺失），血小板减少伴桡骨缺失综合征（Thrombocytopenia with Absent Radii syndrome，TAR）1例（1q21.1q21.2微重复）（详见表7）。

另case 2、case 10、case 16、case 18同时进行了全外显子组高通量测序（whole exome wequencing，WES）检测，结果均与CMA一致，临床表型相符。

CMA检出lpCNVs 9例，携带剂量敏感基因，或公共数据库中有相关片段的致病性报道等。6例孕妇及家属行外周血CMA验证，其中1例遗传自轻微智力障碍的母亲（表6 case 1），5例遗传自无表型的亲本，继续妊娠，随访至出生，新生儿外观无异常；3例未验证选择继续妊娠，随访至3⁺岁，生长发育正常。

CMA检出VOUS 91例，40例孕妇及家属行外周血CMA验证，其中38例遗传自无表型的亲本，继续妊娠，随访至出生，新生儿外观无异常；2例为新发突变，1例终止妊娠，1例继续妊娠，随访至3⁺岁，生长发育正常。

3 讨论

传统的染色体核型分析技术从20世纪70年代早期发展以来，目前普遍应用分裂中期细胞染色体G显带400~500条带，可明确检出>10 Mb的缺失、重复、易位、倒位等较大片段的结构重排和染色体数目异常，但核型分析有赖于工作人员的经验，细胞培养时间和检测周期长且存在细胞培养失败的风险。CMA分为比较基因组杂交微阵列（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）和单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array），具备高分辨率、高通量、高灵敏度、高自动化等优势，可精确定位异常片段，显示受累基因，利于识别并鉴定疾病相关基因^[7]，但CMA不能检出平衡性结构重排和芯片探针未覆盖的染色体区域异常如异染色质区和随体区域，不能分辨易位型三体，还有可能检出大量VOUS^[8-9]，导致孕妇及家属焦虑担忧，甚至错误终止妊娠。

本研究以1 575例高危单胎孕妇羊膜腔穿刺羊水标本为研究对象，同时应用核型分析和CMA进行检测，结果显示在染色体数目异常方面，核型分析与CMA检出结果一致性高。其中核型分析48,X?,+21,+mar 1例，CMA结果仅显示21三体，未显示其他染色体片段重复，提示该标记染色体可能位于芯片探针覆盖区域以外而漏检。核型分析46,X?,t（13;21）（p10;q10）mat 1例，经验证遗传自罗伯逊易位的母亲，但CMA无法区分易位型21三体也不能验证亲本的罗伯逊易位。提示对于胎儿21三体的孕妇及家属建议行外周血染色体核型分析，为再次妊娠提供临床指导。

在嵌合体方面核型分析与CMA检出结果一致性差。有研究表明^[10-11]羊水细胞体外培养过程中染色体单体细胞增值率和存活率高于三体细胞，因此羊水染色体核型分析基于培养后的羊水标本无法反映其真实嵌合比例；而CMA检测的基因拷贝数会被同一染色体拷贝数的增加或减少所平衡，因而不能精确地描述单体和三体并存的嵌合水平^[12]。核型分析mos 47,XXX[21]/45,X[6] 1例，CMA结果显示性染色体三体，并未提示嵌合现象，可能与体外培养过程中单体细胞优势生长以及CMA检测X染色体单体拷贝数被三体平衡相关^[12-13]。提示对于染色体单体和三体同时存在的嵌合体，建议采用未培养的羊水标本行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH），以明确嵌合比例。核型分析45,X 2例CMA结果显示为嵌合体，可能与母体细胞污染相关，羊水细胞培养贴壁生长，可在一定程度上排除母体细胞干扰。核型分析mos 46,X?,t（7;8）（q21;q23）[5]/46,X?[45] 1例和mos 46,X?,t（4;5）（q12;q35）[8]/46,X?[22] 1例，为平衡性结构重排且嵌合比例低，CMA不能检出，孕妇及家属验证外周血染色体核型，均正常，推断该嵌合体为假性嵌合，异常核型由胎儿脱落细胞或非胚胎细胞体外培养发生畸变并继续增殖产生。据文献报道^[14]，产前羊水细胞诊断中嵌合体发生概率为3.4%~8.6%，但大部分属于假性嵌合。提示当羊水核型分析发现结构异常嵌合体时应首先进行胎儿脐带血染色体复查以验证结果，同时采用其他检测手段如FISH等辅助验证，但应警惕在某些特殊情况下脐血染色体不能完全代表胎儿的真实核型。核型分析mos 47,X?,+mar[11] /46,X?[16] 1例，结合CMA检测结果分析该标记染色体为15号染色体部分片段，遗传自有轻微智力障碍的母亲，随访至4⁺岁，患儿语言和智力发育迟缓。提示对于核型分析无法确定来源和性质的片段，CMA可准确提示亚显微水平的信息，对遗传咨询和产前诊断具有指导意义。由此可见，产前诊断嵌合体病例建议结合染色体核型分析、CMA、FISH、临床超声检查等多种检测手段，采用培养和未培养羊水、脐血、绒毛等多种检测样本，综合分析检测结果，为产前诊断提供科学准确的信息。

针对所有样本联合2项技术共检出异常215例，异常检出率13.65%，高于核型分析的异常检出率5.84%和CMA的异常检出率11.68%。核型分析额外检出率1.97%；CMA额外检出率7.81%，其中pCNVs和lpCNVs检出率1.33%。由此可见，核型分析在可及的分辨率范围内可发现染色体数目异常和结构异常，而CMA能够实现全基因组水平扫描，准确反映变异区带、变异类型、基因数目，在染色体微结构变异方面具有突出优势^[15]。有报道核型分析未见异常但超声提示结构异常的胎儿中有3.1% ~ 7.9%存在pCNVs或lpCNVs^{[4，8，16-17]}；核型分析和超声均未发现异常的胎儿中，有1.0%~1.7%存在pCNVs或lpCNVs^[4][8]。本研究核型分析未见异常病例中，超声检查异常者共检出pCNVs和lpCNVs 4例，检出率3.03%，超声检查未发现异常者共检出pCNVs和lpCNVs 12例，检出率为1.10%，与文献报道基本一致。2014年我国专家共识即提出，产前超声检查异常而染色体核型分析正常是CMA的主要临床应用指征之一^[18]。2016年美国妇产科医师学院（american college of obstetricians and gynecologists，ACOG）及母胎医学会society for maternal-fetal medicine，SMFM）发布的指南明确提出，超声发现胎儿结构异常时，CMA可作为一线产前诊断方法^[19][20]。目前比较明确，可直接进行CMA检测的超声结构异常包括心脏、泌尿系统、中枢神经系统、胃肠道畸形等^[21-25]。本研究核型分析正常病例中检出pCNVs和lpCNVs共20例，其中5例有USM，3例超声结构异常，包括1例室间隔缺损、1例肾发育不良和1例重度脑积水，涉及心脏、泌尿系统和中枢神经系统。提示将染色体核型分析未发现异常病例进一步行CMA检测可明确染色体微结构变异的致病风险，尤其是对于超声检查结构异常者，pCNVs和lpCNVs检出对精准产前诊断具有重要意义。另有研究提示^[26]，鉴于非整倍体基础风险高，高龄孕妇不论超声检查是否提示异常，建议同时行羊水核型分析和CMA检测，避免浪费时间造成孕晚期脐穿验证。

不同临床指征组间结果分析显示在高龄、NIPT高风险、超声异常、USM提示等分组中CMA均显著提高了异常检出率。NIPT高风险组2种方法结果一致性好且具有统计学意义，这与NIPT的实验性质相关，NIPT以筛查非整倍体为主，2种方法在染色体非整倍体方面检出结果一致好，提示在NIPT高风险的人群中，2种方法具有同等优势，可综合考虑时间、花费等多方面因素选择合适的检测方法。在不良孕产史及遗传性疾病家族史组中，2种方法检出结果一致性较差，与该组包含较多夫妇染色体结构异常人群的分组依据相关，平衡性结构重排是核型分析的优势和CMA的盲点，但CMA可以检出核型分析无法发现的染色体微缺失和微重复，提示对于该组人群建议同时行羊水染色体核型分析和CMA检测，确认染色体结构异常的同时进一步明确微结构变异的致病风险。

本研究中CMA检出12例MMS，其中3例DiGeorge综合征，该综合征是智力发育迟滞最常见的病因之一，仅次于唐氏综合征，也是先天性心脏病的第二大遗传学病因，其症状差异大，常累及全身多个脏器^[27]。5例MMS累及16号染色体，16号染色体富含低拷贝重复序列（low copy repeats，LCRs），LCRs易发生非等位基因同源重组，从而造成拷贝数的重复或缺失^[26]。16p11.2区域包含TBX6基因，16p13.11区域包含NDE1基因，均涉及神经发育表型，临床表现多样，主要为孤独症、智力障碍、语言障碍、发育迟缓、脊柱畸形等，且存在临床外显不全的情况^[28-29]。提示对于明确致病的MMS，建议行亲本CMA验证，但应当明确告知致病性及外显率和表现度等情况，为再次生育作遗传风险评估。

本研究中CMA检出11例LOH和91例VOUS，经验证38例VOUS遗传自无表型的亲本，初步判读为家族性良性CNVs，随访至出生，新生儿外观无异常；1例新发突变随访至3⁺岁，生长发育正常。提示对于VOUS应该向孕妇及家属充分告知该检测结果的局限性，建议夫妇行外周血CMA检测以明确是否新发突变，结合超声检查及家族谱系综合分析，更合理的遗传咨询指导胎儿预后的判断。

4 结论

在产前诊断中联合应用染色体核型分析和CMA可有效提高染色体异常检出率，尤其是超声结构异常人群。嵌合体病例需根据具体情况选择适宜的检测技术和样本，综合分析检测结果。特殊微结构变异位点应当进行有效的病例随访，指导临床咨询，完善染色体疾病谱，最终为遗传咨询和生育指导提供临床依据。

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基金资助

重庆市科技局面上资助项目(cstc2016shmszx130026)