SF3B1/FOXM1信号通路调控细胞周期干预宫颈癌进展的机制研究

Mechanism of the splicing factor 3B subunit 1/forkhead box protein M1 signaling pathway regulating cell cycle and intervening against the progression of cervical cancer

摘要

目的 基于剪接因子3B亚单位1（splicing-factor-3B-subunit-1，SF3B1）/叉头框蛋白M1（Forkhead Box M1，FOXM1）轴探讨调控细胞周期宫颈癌进展的作用机制。 方法 通过转染SF3B1过表达质粒（SF3B1 overexpression plasmid，pSF3B1）和2个SF3B1特异性短发夹RNA（short hairpin RNA）（shSF3B1-1、shSF3B1-2）过表达HeLa细胞或敲低SiHa细胞SF3B1。通过试验和乙炔基-2′-脱氧尿苷分析细胞的增殖活力和增殖率。流式细胞术分析细胞周期分布。应用细胞周期聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）阵列分析、流式细胞术、染色质免疫共沉淀-定量聚合酶链式反应（chromatin immunoprecipitation -quantitative polymerase chain reaction，ChIP-qPCR）和荧光素酶实验明确SF3B1和FOXM1的靶向关系。 结果 SF3B1过表达后，HeLa细胞的生长率和增殖能力均显著增加（P<0.05）。此外，SF3B1敲低后，SiHa细胞的生长率和增殖能力均显著降低（P<0.05）。在HeLa细胞中，与pENTER组相比，pSF3B1组细胞在细胞周期的G₀/G₁期降低。然而，在SiHa细胞系中，敲低SF3B1提高了G₀/G₁期比率。此外，SF3B1过表达促进了HeLa细胞中G₁期相关蛋白细胞周期蛋白D1表达，而敲低SF3B1抑制了SiHa细胞中周期蛋白D1表达。上调SF3B1表达明显增强FOXM1的表达，而下调SF3B1导致FOXM1的明显抑制。ChIP-qPCR分析进一步显示SF3B1在HeLa细胞系中与FOXM1启动子位点结合。在野生型FOXM1启动子中，与shNC组相比，荧光素酶活性在SF3B1敲低组中受到抑制（1.30±0.08 vs. 0.73±0.02、0.70±0.04，均P<0.01），突变型FOXM1启动子不能在SiHa细胞中引发对shSF3B1的应答。HeLa细胞的增殖能力通过SF3B1过表达而增强（shNC+pENTER vs. shNC+pSF3B1：25.1±1.9 vs. 61.2±3.8，P<0.01），并被shFOXM1降低（shNC+pSF3B1 vs. shFOXM1+pSF3B1：61.2±3.8 vs. 18.5±1.9，P<0.001），并且SF3B1过表达诱导的细胞G0/G1周期降低通过敲低FOXM1而部分逆转（shNC+pSF3B1 vs. shFOXM1+pSF3B1：35.0±1.5 vs. 58.0±1.8，P<0.05）。 结论 SF3B1可以作为宫颈癌中的潜在肿瘤促进基因，其可能通过上调FOXM1的表达来促进宫颈癌细胞增殖并扰乱细胞周期。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of cell cycle regulation in intervening against the progression of cervical cancer based on the splicing factor 3B subunit 1（SF3B1）/forkhead box protein M1（FOXM1） axis. Methods SF3B1 overexpression in HeLa cells or SF3B1 knockdown in SiHa cells was achieved by transfection of SF3B1 overexpression plasmid（pSF3B1） and two SF3B1-specific short hairpin RNA（shSF3B1-1 and shSF3B1-2）. CCK-8 test and ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU） were used to measure cell proliferation activity and proliferation rate；flow cytometry was used to observe cell cycle distribution；cell cycle PCR array，flow cytometry，chromatin co-immunoprecipitation-quantitative polymerase chain reaction（ChIP-qPCR），and luciferase experiments were used to clarify the targeting relationship between SF3B1 and FOXM1. Results After SF3B1 overexpression，there were significant increases in the growth rate and proliferation ability of HeLa cells（P<0.05）. In addition，there were significant reductions in the growth rate and proliferation ability of SiHa cells after SF3B1 knockdown（P<0.05）. In HeLa cells，compared with the pENTER group，the pSF3B1 group had a significant reduction in the G₀/G₁ ratio，while in SiHa cells，SF3B1 knockdown significantly increased the G₀/G₁ ratio. Furthermore，SF3B1 overexpression significantly promoted the expression of the G₁ phase-related protein cyclin D1 in HeLa cells，while SF3B1 knockdown significantly inhibited the expression of cyclin D1 in SiHa cells. Upregulation of SF3B1 significantly enhanced the expression of FOXM1，while downregulation of SF3B1 significantly inhibited FOXM1. ChIP-qPCR analysis showed the binding of SF3B1 to FOXM1 promoter site in HeLa cells. In the wild-type FOXM1 promoter，compared with the shNC group，the SF3B1 knockdown group had inhibition of luciferase activity（1.30±0.08 vs. 0.73±0.02 and 0.70±0.04，P<0.01），and the mutant FOXM1 promoter could not trigger a response to shSF3B1 in SiHa cells. The proliferation ability of HeLa cells was enhanced by SF3B1 overexpression（shNC+pENTER vs. shNC+pSF3B1：25.1±1.9 vs. 61.2±3.8，P<0.01） and was reduced by shFOXM1（shNC+pSF3B1 vs. shFOXM1+pSF3B1： 61.2±3.8 vs. 18.5±1.9，P<0.001），and the reduction in G0/G1 cycle induced by SF3B1 overexpression was partially reversed by FOXM1 knockdown（shNC+pSF3B1 vs. shFOXM1+pSF3B1：35.0±1.5 vs. 58.0±1.8，P<0.05）. Conclusion SF3B1 can be used as a tumor-promoting gene in cervical cancer，and it can promote the proliferation of cervical cancer cells and disrupt the cell cycle by upregulating the expression of FOXM1.

Graphical abstract

关键词

剪接因子3B亚单位1 / 叉头框蛋白M1 / 细胞周期 / 宫颈癌

Key words

splicing factor 3B subunit 1 / forkhead box protein M1 / cell cycle / cervical cancer

目前，宫颈癌是发展中国家女性癌症死亡的第二大原因^[1]。与大多数癌症类似，宫颈癌的发生的一个复杂、随机但高度协调的多步骤过程^[2]。随着对人类癌症的研究进入高通量测序时代，已证实逃避抗生长信号是致癌过程必不可少的核心标志^[3]。最近的证据表明，选择性剪接模式的变化在癌症中起着重要作用^[4]。通过前mRNA剪接，单个前mRNA转录物可能产生内含子和外显子的多种不同组合，导致转录物多样性增加和替代蛋白的合成^[5]。对于许多真核内含子，剪接是在剪接体催化的一系列反应中进行的，剪接体是一种小核糖核蛋白的复合物^[6]。大量研究表明，关键剪接体成分的过度表达和突变导致异常剪接活性和标志性癌症表型的出现。剪接因子3B亚单位1（splicing-factor-3B-subunit-1，SF3B1）是剪接功能所必需的核心剪接体成分，参与RNA剪接中分支点序列的识别和选择^[7]。最近的研究集中于SF3B1的致癌作用，包括但不限于其在肝细胞癌、乳腺癌、骨髓瘤和宫颈癌免疫治疗抗性中的作用^[8]。此外，SF3B1的靶向小分子化合物抑制剂普拉地内酯B已显示通过抑制SF3B1表达诱导宫颈癌细胞凋亡^[9]。然而，目前尚不清楚SF3B1对宫颈癌进展的作用机制。因此，本研究拟通过生物信息学分析和体外实验进一步探讨SF3B1在宫颈中致癌的确切功能机制。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析

为了探索SF3B1在宫颈癌中的水平，通过基因表达谱交互式分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）网站的在线工具分析了来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌（cervical squamous cell carcinoma，CESC）的RNA-seq数据。

1.2 细胞培养、转染和稳定细胞系的建立

人乳头瘤病毒阳性宫颈癌细胞系（SiHa和HeLa）获自美国典型培养物保藏中心。2种细胞系都在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%青霉素/链霉素的杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中培养。在获得细胞系后的6个月内进行实验。选择HeLa细胞用于过表达SF3B1，和SiHa细胞用于敲低SF3B1。将2种细胞系以3×10⁵细胞/孔的浓度接种在6孔板中。用Lipofectamine 2000转染试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司）转染质粒（上海佰晔生物科技中心）。空的pENTER质粒和shRNA对照用作阴性对照。转染48 h后，收获细胞用于进一步的实验。

将SF3B1序列克隆到pLent-Puro慢病毒载体（上海佰晔生物科技中心）中以构建过表达SF3B1质粒（pSF3B1）。此后，慢病毒载体用于包装病毒颗粒。接下来，用嘌呤霉素（1 μg/mL，美国Sigma-Aldrich公司）选择感染病毒48 h的HeLa细胞系1周。

人重组shSF3B1-1、shSF3B1-2、shFOXM1慢病毒和阴性对照（shNC）慢病毒由上海佰晔生物科技中心构建。用shRNA慢病毒感染细胞48 h后，用嘌呤霉素（1 μg/mL）选择稳定表达shSF3B1-1、shSF3B1-2、叉头框蛋白M1（Forkhead Box M1，FOXM1）shRNA和NC shRNA的SiHa细胞。NC shRNA的序列为5'-CCGGCATTTCTCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGGTGACACGTTCGGAGAATTTTT-3'；shSF3B1-1的序列为5'-GATCCCCCTTCAATTTGTAGACTCTTTTCAAGAGAAAGAGTCTACAAATTGAAGGGTTTTTTA-3'；shSF3B1-2的序列为5'-AGCTTAAAAAACTC CTCAATCTGAGTGAGAGATCTCTTGAATCTCTCACTCAGATTGAGGAGG-3'；shFOXM1的序列为5'-CCGGCAGCTGGGATCAAGATTATTATTACTGAGTTAATAATTCTTGATCCC AGCTGTTTTG-3'。

1.3 细胞增殖试验

在细胞增殖试验中，用shRNA（shNC）、SF3B1 shRNA （shSF3B1）或过表达的SF3B1（pSF3B1）质粒转染宫颈癌细胞，并以1 000细胞/孔的密度将它们铺在96孔板中。每隔24 h，向每个孔中加入10 μL细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂（南京凯基生物科技发展有限公司）孵育1 h。使用微量滴定板读数器在450 nm处测量吸光度（absorbance，A）值。

在5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）试验中，将细胞铺在12孔板中并转染。48 h后，进行EdU分析（上海Beyotime公司）以分析细胞增殖。细胞用10 μmol/L EdU溶液孵育2 h，用4%多聚甲醛固定，用0.5% TritonX-100洗涤1次。接下来，用100 μL 1 × DAPI溶液对细胞进行染色。用PBS洗涤3次后，从荧光显微镜获得图像并计算增殖率。

1.4 细胞周期的流式细胞术分析

培养细胞并用相应的质粒转染48 h，然后转移到收集管中。将细胞固定在1 mL 70%冷乙醇中2 h，用冰冷的PBS洗涤细胞3次，并在室温下将它们悬浮在含有0.5 mL PI/RNase染色缓冲液（美国BD公司）的100 μL PBS中，避光15 min。PI染色后24 h内进行流式细胞术分析。最后，使用流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）测定细胞周期分布。

1.5 蛋白质印迹法

从培养的细胞中收获总蛋白质。用冰冷的PBS洗涤细胞，并用放射免疫沉淀检测缓冲液裂解细胞。与十二烷基硫酸钠缓冲液混合后，将蛋白质加热至100 ℃ 10 min，在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）。之后，将膜与针对SF3B1（1:1 000，英国Abcam公司）、GAPDH（1:5 000，美国Santa Cruz Biotechnology公司）、FOXM1（1:1 000，英国Abcam公司）、细胞周期蛋白D1（1:1 000，美国Santa Cruz Biotechnology公司）的第一抗体在4 ℃孵育过夜，随后与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体（1:5 000，武汉三鹰生物技术有限公司）孵育。使用化学发光溶液（美国Thermo fisher Scientific公司）检测免疫反应性蛋白质。

1.6 实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）

用Trizol试剂（美国Thermo fisher Scientific公司）提取总RNA，用M-MLV逆转录酶试剂盒（美国Invitrogen公司）进行逆转录反应。使用标准SYBR Green PCR试剂盒（东洋纺（上海）生物科技有限公司）进行RT-qPCR。引物序列如下：GADPH：5'-ACGTAGCTCAGGCCTCAAGA-3'，R：5'-GCGGGCTCAATTTATAGAAAC-3'；FOXM1：F：5'-ATAATTTATTTTCGATATGGAGTGC-3'，R：5'-AATAATTAATCAAAATTTTTCCGAC-3'；SF3B1：F：5'-AATTTATTTTTGATATGGAGTGTGG-3'，R：5'-AATAATTAATCAAAATTTTTCC AAC-3'。

1.7 染色质免疫共沉淀-定量聚合酶链式反应（chromatin immunoprecipitation -quantitative polymerase chain reaction，ChIP-qPCR）

将HeLa细胞（3×10⁶）接种在100 mm培养皿中，在1%甲醛处理后，用RIPA裂解缓冲液裂解细胞。基因组DNA被超声仪分离并剪切成200～600 BP的片段。离心后，取上清液，将染色质与SF3B1识别抗体（1∶50，美国Santa Cruz公司）或IgG（上海Beyotime公司）在4 ℃孵育过夜并沉淀。然后使用蛋白A/G-琼脂糖珠（美国GE Healthcare公司）沉淀免疫复合物4 h。接下来，用不同的洗涤缓冲液洗涤免疫复合物，随后使用500 μL洗脱缓冲液洗脱免疫沉淀物，并在65 ℃下逆转交联过夜，使用FOXM1启动子引物扩增SF3B1的结合位点。最终按照制造商的方案洗脱DNA，并通过RT-qPCR进行分析。FOXM1启动子引物序列：F：5'-GTTCCAGCAATTCTCCT-3'，R：5'-CTTGGGAGACTGAGGTG-3'。

1.8 双荧光素酶报告基因分析

构建含有SF3B1结合位点的野生型FOXM1报告基因（WT），以及不含结合位点的突变型FOXM1报告基因（MUT）。将上述报告基因与人重组shSF3B1-1、shSF3B1-2或shNC共转染到SiHa细胞中。用荧光素酶检测试剂盒（美国Promega公司）检测荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

使用SPSS 25.0分析数据。所有测量数据均呈正态分布，并描述为均数±标准差（x±s）。使用t检验评估两组之间的差异；并使用单因素方差分析比较多组之间的差异，然后使用Tukey的多重比较检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 人宫颈癌中SF3B1表达上调

对来自TCGA数据库的基因组数据集的分析证实，与正常宫颈组织相比，SF3B1在人宫颈癌中确实是上调（图1A），并且SF3B1高表达与宫颈癌患者不良预后密切相关（图1B）。

2.2 SF3B1在体外抑制宫颈癌细胞增殖

通过转染SF3B1过表达质粒（pSF3B1）和2个SF3B1特异性短发夹RNA（shSF3B1-1、shSF3B1-2）来过表达或敲低SF3B1（图2A）。随后通过CCK8和EdU试验监测宫颈癌细胞增殖。结果表明，SF3B1过表达后，HeLa细胞的生长率和增殖能力均明显增加（P<0.05）。此外，SF3B1敲低后，SiHa细胞的生长率和增殖能力均明显降低（P<0.05）（图2B~D）。这些结果表明SF3B1在体外可以抑制宫颈癌细胞的增殖。

2.3 SF3B1通过阻断细胞周期抑制宫颈癌细胞生长

为了阐明SF3B1如何调节宫颈癌的恶性进展，本课题组使用Linkedomics在线平台系统地分析了SF3B1在宫颈癌患者中的作用（图3A）。如热图所示，在宫颈癌有3 327个基因与SF3B1的表达正相关。基因组富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）用于SF3B1功能富集分析。结果显示，SF3B1基因与细胞周期和G₁至S细胞周期控制显著相关（图3B~C）。为了评估SF3B1对宫颈癌细胞增殖的影响是否是通过阻滞细胞周期来介导，进行了流式细胞术分析来研究宫颈癌细胞系中细胞周期特定时相的分布。在HeLa细胞中，与pENTER组相比，pSF3B1组细胞在细胞周期的G₀/G₁期显著降低（50.0±2.0 vs. 36.0±1.5，P<0.05）（图3D）。然而，在SiHa细胞系中，敲低SF3B1显著提高了G₀/G₁期比率（51.0±1.9 vs. 67.2±2.1、65.3±1.7，均P<0.05）（图3E）。此外，SF3B1过表达促进了HeLa细胞中G1期相关蛋白细胞周期蛋白D1表达，而敲低SF3B1抑制了SiHa细胞中周期蛋白D1表达（图3F）。

2.4 SF3B1上调FOXM1水平

为了找到SF3B1的靶基因，课题组进行了细胞周期PCR-阵列分析。在HeLa细胞系中，当SF3B1过表达时，FOXM1水平稳定上调（图4A），WB和RT-qPCR测定证明上调的SF3B1表达显著增强FOXM1的表达，而下调的SF3B1导致FOXM1的显著抑制（图4B~C）。本研究测试了SF3B1是否在转录水平靶向FOXM1。FOXM1启动子的DNA序列分析揭示了一个潜在的SF3B1结合位点。结合位点位于转录起始位点上游的核苷酸2242-2235 BP（GTCTTAAA）（图4D）。ChIP-qPCR分析进一步显示SF3B1在HeLa细胞系中与该位点结合（图4E）。为了进一步确定FOXM1启动子活性对SF3B1位点的需求，研究了携带野生型（Site-WT）或突变型（Site-Mut）SF3B1结合位点的FOXM1启动子荧光素酶报告基因的作用（图4F）。在野生型FOXM1启动子中，与shNC组相比，荧光素酶活性在SF3B1敲低组中受到抑制（1.30±0.08 vs. 0.73±0.02、0.70±0.04，均P<0.01），突变型FOXM1启动子不能在SiHa细胞中引发对shSF3B1的应答（图4G）。

2.5 FOXM1是SF3B1促进宫颈癌细胞增殖所必需的功能靶点

为了进一步探索FOXM1对SF3B1影响宫颈癌增殖和扰乱细胞周期的作用，课题组进行了挽救实验。shFOXM1（FOXM1特异性短发夹RNA）的敲低效率由WB证实（图5A）。EdU分析显示HeLa细胞的增殖能力通过SF3B1过表达而增强（shNC+pENTER vs. shNC+pSF3B1：25.1±1.9 vs. 61.2±3.8，P<0.01），并被shFOXM1降低（shNC+pSF3B1 vs. shFOXM1+pSF3B1：61.2±3.8 vs. 18.5±1.9，P<0.001）（图5B），并且SF3B1过表达诱导的细胞G0/G1周期降低通过敲低FOXM1而部分逆转（shNC+pSF3B1 vs. shFOXM1+pSF3B1：35.0±1.5 vs. 58.0±1.8，P<0.05）（图5C）。

3 讨 论

超过90%的人类基因经历选择性剪接，以组织特异性方式产生多种mRNA变体，并且相应的蛋白质亚型具有不同的，甚至是拮抗的性质^[10]。这些变体与各种疾病状态有关，包括癌症。大量研究表明，关键剪接体成分的过度表达和突变导致异常剪接活性和标志性癌症表型的出现^[11]。SF3B1是组成剪接体的蛋白质之一，调节前mRNA内含子的切除^[12]。本研究对来自TCGA数据库的基因组数据集的分析证实，SF3B1在人宫颈癌中上调，并且SF3B1高表达与宫颈癌患者不良预后密切相关。随后通过体外实验分析发现上调SF3B1的表达可以显著促进宫颈癌细胞的增殖，而敲低SF3B1的表达可以抑制细胞的增殖。因此，这些结果表明SF3B1可以影响宫颈癌细胞的增殖，针对剪接体机制可能成为治疗宫颈癌等不可治愈癌症的创新和成功的治疗方法。

近年来，已经设计了各种药物来靶向SF3B1（剪接体的中心/必需核心成分），使这种剪接体元件成为研究其翻译致癌性含义和在没有成功治疗或治愈的癌症中的治疗能力的最佳候选^[7-8]。然而，到目前为止，已发表的关于通过药理学方法调节关键剪接体成分的潜在致癌作用和治疗效果的数据非常有限。据本研究所知，SF3B1的致癌机制在宫颈癌中尚未被表征。为了阐明SF3B1如何调节宫颈癌的恶性进展，本研究使用Linkedomics在线平台系统地分析了SF3B1在宫颈癌患者中的作用，并发现SF3B1基因与细胞周期和G₁至S细胞周期控制显著相关。细胞周期调节细胞的命运，并在癌症进展中发挥关键作用^[4]。本研究中，SF3B1过表达降低对宫颈癌细胞中G₀/G₁细胞周期阻滞，并促进了HeLa细胞中G₁期相关蛋白细胞周期蛋白D1表达。细胞周期蛋白D1作为G₁阶段的重要介质，决定了细胞的方向，活或死^[13]。作为一种原癌蛋白，细胞周期蛋白D1在多种人类癌症中过度表达，如乳腺癌、尿路上皮性膀胱和结肠直肠癌^[14]。因此，细胞周期蛋白D1的调节被认为是癌症预防和治疗的有用策略^[15]。细胞周期蛋白D1下调与一组抗癌药物的抗癌机制有关^[16]。在从G₁向S期转变的过程中，激活的细胞周期蛋白D1可以磷酸化肿瘤抑制因子Rb，释放转录因子E2F，并介导一些细胞周期相关基因的转录^[17]。在本研究中，SF3B1敲低诱导G₁细胞周期停滞，并显著降低宫颈癌细胞中细胞周期蛋白D1的表达。因此，这些结果表明SF3B1可以通过影响细胞周期蛋白D1表达来促进宫颈癌细胞的增殖。

平衡良好的细胞周期进程是细胞增殖所必需的，而细胞周期成分的失调可能导致肿瘤的形成^[18]。FOXM1是叉头/翼螺旋家族的成员，在许多肿瘤中过度表达，包括宫颈癌^[19]。目前的研究工作表明，FOXM1在DNA修复的细胞周期进程中调节G₁/S和G₂/M的转变。FOXM1转录调节细胞周期蛋白B1、细胞分裂周期25A、细胞分裂周期25B和其他参与细胞周期进程的因子的表达和活性^[20]。同时，细胞通过上调FOXM1的表达用于DNA修复^[21]。本研究表明，SF3B1通过上调FOXM1信号通路诱导细胞增殖，而FOXM1敲低逆转了SF3B1促进宫颈癌增殖和扰乱细胞周期的作用。总的来说，这些数据强调了FOXM1是SF3B1的重要功能靶点，并支持FOXM1对SF3B1促进宫颈癌细胞增殖和细胞周期控制至关重要的观点。

总之，本研究表明SF3B1可以作为宫颈癌中的肿瘤促进基因，其通过上调FOXM1的表达来促进宫颈癌细胞增殖并扰乱细胞周期。这些结果为SF3B1的促癌作用和机制提供了新的见解，并可作为宫颈癌的潜在治疗靶点。然而，本研究并没有通过体内实验证实体外发现，这在一定程度上影响了本研究结论的准确性。因此，在未来的研究中，旨在构建原位移植和异位移植肿瘤模型探讨SF3B1/FOXM1信号通路调控细胞周期干预宫颈癌进展的机制。

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基金资助

湖北省卫生健康委员会科研资助项目(WJ2023M117)