NLRP3炎症小体介导Th17/Treg失衡在哮喘小鼠气道炎症中的作用

Role of NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 inflammasome in airway inflammation in asthmatic mice by mediating T helper 17/regulatory T cell imbalance

摘要

目的 探讨NLR家族的Pyrin域蛋白3（NLR family，pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎症小体介导Th17/Treg失衡在哮喘小鼠气道炎症中的作用及其机制。 方法 将32只BALB/c雌性小鼠随机分为正常对照组（NS组）、哮喘模型组（AS组）、MCC950干预组（MC组）及地塞米松组（Dex组）。AS组予卵清白蛋白（OVA）致敏和激发。MC组和Dex组分别予以MCC 950 和地塞米松干预。末次激发24 h后麻醉、放血，制备支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）细胞计数和ELISA检测IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35浓度；流式细胞技术检测小鼠外周血、脾、肺组织CD4细胞IL-17（CD4⁺IL-17⁺） 和CD4⁺CD25⁺CD127^low占CD4⁺细胞比例分别反映辅助性T细胞17（Th17）和调节性T淋巴细胞（Treg）水平；免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）观察肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白水平。 结果 与NS组比较，AS组BALF细胞计数、IL-17A、IL-1β、IL-18及IL-33浓度均升高（P<0.01），而IL-10、IL-35浓度降低（P<0.05），外周血、肺及脾组织Th17比例升高（P<0.01），而Treg比例降低（P<0.01），肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白水平升高（P<0.01）。与AS组比较，MC组及Dex组BALF细胞计数、IL-17A、IL-1β、IL-18及IL-33浓度均降低（P<0.01），IL-10、IL-35浓度升高（P<0.05）；外周血、肺及脾组织Th17比例降低（P<0.01），Treg比例升高（P<0.01），肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白水平降低（P<0.01）。 结论 NLRP3炎症小体可介导Th17/Treg失衡，参与哮喘气道炎症的发生，MCC950可调节Th17/Treg平衡，减轻哮喘气道炎症。

Abstract

Objective To investigate the role and mechanism of action of NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 （NLRP3） inflammasome in airway inflammation in asthmatic mice by mediating T helper 17（Th17）/regulatory T（Treg） cell imbalance. Methods A total of 32 female BALB/c mice were randomly divided into normal control group（NS group），asthma model group（AS group），MCC950 intervention group（MC group），and dexamethasone group（Dex group）. The mice in the AS group were given ovalbumin for sensitization and challenge，and those in the MC group and the Dex group were given MCC950 and dexamethasone，respectively. At 24 hours after the last challenge，the mice were anesthetized and exsanguinated，and bronchoalveolar lavage fluid（BALF） was prepared for cell counting； ELISA was used to measure the concentrations of interleukin-1A（IL-17A），interleukin-1β（IL-1β），interleukin-10（IL-10），interleukin-18（IL-18），interleukin-33（IL-33），and interleukin-35 （IL-35）； flow cytometry was used to measure the proportion of CD4⁺IL-17⁺ cells and CD4⁺CD25⁺CD127^low cells among CD4⁺ cells in peripheral blood，spleen，and lung tissue，which reflected the level of Th17 and Treg cells，respectively；immunohistochemistry was used to observe the protein levels of NLRP3 and Caspase-1 in lung tissue. Results Compared with the NS group，the AS group had significant increases in BALF cell count and the concentrations of IL-17A，IL-1β，IL-18，and IL-33 （P<0.01），significant reductions in the concentrations of IL-10 and IL-35 （P<0.05），a significant increase in the proportion of Th17 cells and a significant reduction in the proportion of Treg cells in peripheral blood，lung，and spleen tissue （P<0.01），and significant increases in the protein levels of NLRP3 and caspase-1 in lung tissue（P<0.01）. Compared with the AS group，the MC group and Dex group had significant reductions in BALF cell count and the concentrations of IL-17A，IL-1β，IL-18，and IL-33（P<0.01），significant increases in the concentrations of IL-10 and IL-35（P<0.05），a significant reduction in the proportion of Th17 cells and a significant increase in the proportion of Treg cells in peripheral blood，lung，and spleen tissue（P<0.01），and significant reductions in the protein levels of NLRP3 and caspase-1 in lung tissue（P<0.01）. Conclusion NLRP3 inflammasome may participate in the onset of airway inflammation in asthma by mediating Th17/Treg imbalance，while MCC950 can regulate Th17/Treg balance and alleviate airway inflammation in asthma.

Graphical abstract

关键词

支气管哮喘 / NLR家族的Pyrin域蛋白3 / Th17/Treg / 气道慢性炎症

Key words

bronchial asthma / NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 / T helper 17/regulatory T cells / chronic airway inflammation

气道慢性炎症是哮喘的病理基础，很多研究证实NLR家族的NLRP3（NLR family，pyrin domain containing protein 3）炎性小体参与哮喘等气道疾病的炎症过程^[1-2]。NLRP3控制caspase-1的活化，调控IL-1β等促炎细胞因子的修饰与活化，IL-1β可以促进Th17的分化、维持Th17相关细胞因子的产生，也可以促进嗜酸性粒细胞的募集^[3]。激活NLRP3炎症小体对调节Th17和Treg的控制有重要的作用^[4]。已经证实Th17/Treg平衡失调介导哮喘气道炎症，是哮喘重要的发病机制之一^[5]。因此，本研究推测NLRP3炎症小体参与Th17/Treg平衡失调介导的气道炎症发病过程，目前尚未见相关报道。MCC950是作用强且具有特异性的NLRP3炎症小体抑制剂，常常选用MCC950作为NLRP3相关疾病动物模型的干预剂^[6]。本研究拟建立哮喘小鼠模型，通过NLRP3抑制剂MCC950干预，观察Th17/Treg水平及其细胞因子水平、肺组织病理学改变和肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白水平，探讨NLRP3炎症小体介导Th17/Treg失衡在哮喘小鼠气道炎症中的作用及其机制，并为哮喘的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

无特定病原体6～8 周18～20 g BALB/C 雌性小鼠（莱彼特生物科技有限公司，重庆）伦理批准号MKLLY（A）-2021-128；OVA（美国 Sigma公司）；MCC950（美国MedChemExpress公司）；NLRP3抗体（美国GeneTex公司）；Anti-Caspase-1抗体（英国abcam公司）；FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD25、APC anti-mouse CD127（IL-7Rα）、PerCP anti-mouse CD45、PE anti-mouse IL-17（美国Biolegend公司）；小鼠IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35的ELISA试剂盒（江莱生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验小鼠分组、模型的建立与干预

32只无特定病原体6~8周BALB/C雌性小鼠随机分为哮喘模型组（AS组）、正常对照组（NS组）、MCC950干预组（MC组）及地塞米松组（Dex组），每组8只。参照Kim DI等^[7]制作哮喘小鼠模型的方法，并根据本课题组^[8]多年制作哮喘小鼠模型的方法进行改进，AS组第1天和第13天给予小鼠10% OVA氢氧化铝凝胶混悬液腹腔注射联合颈部及双侧大腿根部皮下注射以致敏，第19~23天每天给予小鼠10% OVA雾化吸入激发。NS组：注射剂OVA以PBS代替、雾化用生理盐水代替，余处理同哮喘组。MC组和Dex组分别采用MCC950和地塞米松干预，具体方法是在AS组处理的基础上每次雾化激发前30 min分别腹腔注射MCC950 10 mg/kg^[9]和地塞米松2 mg/kg^[10]进行干预。

1.2.2 外周血、支气管肺泡灌洗液、肺和脾组织标本采集与制备

末次激发24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，眼眶静脉丛采血用于制作外周血单个核细胞悬液（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），然后打开腹腔，腹主动脉处放血，取脾脏备用。打开胸腔，暴露双肺，结扎右肺肺门，取出整个右肺，右肺中叶用于制作单个核细胞悬液；右肺下叶置于4%多聚甲醛常温固定，后续免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测。暴露颈部气管，在环状软骨上方用静脉留置针插管固定，无菌PBS灌洗，收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），30 min内行细胞计数，1 200 r/min 4 ℃离心，取沉渣涂片瑞氏吉姆萨染色，其余标本迅速冻存在-80 ℃冰箱内保存备用。

1.2.3 外周血、脾及肺组织单个核细胞悬液的制备

①PBMC的制备：加入等量的样本稀释液到采集血液中混匀，小心加至淋巴细胞分离液上层，吸取PBMC，裂红离心弃上清，800 μL PBS重悬计数。②脾组织单个核细胞悬液的制备：取新鲜小鼠脾脏，冷PBS清洗放到40 μm细胞筛网，注射器活塞轻柔按压研磨，用3 mL PBS轻轻冲洗筛网。余步骤同PBMC。③右肺中叶单个核细胞悬液的制备：先配制酶消化工作液，按照银维谋^[11]等的方法用，1 mg/mL胶原酶（collagenase V）+ 0.2 mg/mL DNse I，溶于1640培养基中，将取出的右肺中叶用冷的PBS清洗，加入1 mL酶消化工作液；剪碎肺组织，37 ℃摇床消化30~40 min；其余步骤同脾组织单个核细胞悬液的制备。

1.2.4 外周血、肺及脾单个核细胞悬液流式细胞染色

参照刘红云等^[12-13]流式细胞技术检测Th17和Treg流式细胞染色的方法，按照说明书使用。①Treg染色：将前面的单个核细胞悬液计数，分装，分别加染色抗体和对照CD4、CD45、CD25、CD127；4 ℃避光孵育；2%多聚甲醛4 ℃避光固定，洗涤、离心弃上清；Staining Buffer重悬，上机。②Th17染色：取前面剩余单个核细胞悬液进行计数，按照（1~2）×10⁶/mL个细胞，加入1640培养基+血清铺板；加三联体Cell activation cocktail with Brefeldin A（PMA+离子霉素+高尔基体阻断剂）混匀后37 ℃培养4～6 h；收集细胞，染色缓冲液重悬；表面染色，分别加入CD4、CD45、CD69和对照CD4、CD45；固定破膜，加入Cyto-Fast™ Fix Perm Buffer，室温避光孵育，洗涤，Cyto-Fast™ Perm Wash Solution重悬；胞内染色，加入Cyto-Fast™ Perm Wash Solution，分别加IL-17抗体和IL-17对照抗体，室温避光孵育；洗涤、离心、弃上清；加入Cell Staining Buffer重悬，上机。

1.2.5 肺组织石蜡切片的制作

肺组织在4%的多聚甲醛固定14～20 h，分别置于50%和70%乙醇12 h和4 h，80%和90%乙醇30min，95%和100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各浸泡45 min，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片。

1.2.6 NLRP3、caspase-1蛋白水平免疫组化

肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，微波抗原修复后自然降到常温，3%的H₂O₂室温避光孵育，封闭用山羊血清封闭，滴加相应一抗孵育冲洗后滴加对应的二抗及DAB显色，设空白对照，阴性对照和阳性对照，阳性表达为黄色、淡黄色和棕黄色。用Leica V4.2采图系统采图；每组在相同条件下随机选择5个直径约70 μm完整气道，应用图像分析软件Image-proplus 6.0，以积分光密度及区域为指标进行定量分析，计算平均积分光密度值（integrated optical density，IOD）。

1.2.7 BALF中IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35浓度（ELISA）

平衡至室温，按说明书配制标准品工作液浓度梯度分装，设立复孔和空白对照，配制洗涤缓冲液、生物素化抗体工作液和酶结合物工作液即配即用。按操作步骤分别加样、加生物素化抗体、酶结合物工作液、加底物、终止，用450 nm波长对各孔吸光度（absorbance，A）值进行测量。采用ELISAcalc软件绘制标准曲线，以标准浓度为横坐标（X轴），对应的A_{450 nm}值为纵坐标（Y轴），绘制出标准品的线性回归线，按曲线方程计算各样本的浓度值（以Y值计算X值）再乘以稀释倍数，得出对应的浓度（pg/mL）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件分析数据，根据资料的属性对各组数据进行统计分析，以均数±标准差（x±s）表示。对多样本均数比较时采用单因素方差分析，有差异者进一步采用LSD-t检验行两两比较。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 各组小鼠行为学的变化

AS组小鼠经过OVA 致敏和激发后，表现出呼吸急促、时而躁动不安、抓耳挠腮，时而精神萎靡、口唇、眼睑发绀、进食差、不活泼、活动减少；MC组、Dex组上述表现较AS组明显减轻，NS组无上述表现。

2.2 BALF总细胞计数、瑞士-吉姆萨染色白细胞分类计数的变化

AS组细胞计数、白细胞计数及嗜酸性粒细胞占白细胞分类计数百分比较NS组增高；MC组、Dex组较AS组降低，均P<0.01。见表1、图1。

2.3 流式细胞技术检测外周血、肺及脾组织单个核细胞悬液CD4细胞Th17比例和Treg比例及Th17/Treg比例的变化

参照流式细胞技术^[14-15]检测Th17、Treg细胞的方法，以CD4细胞IL-17（CD4⁺IL-17⁺）和CD4⁺CD25⁺CD127^low占CD4⁺细胞比例分别反映Th17和Treg水平。AS组外周血、肺、脾组织单个核细胞悬液中Th17较NS组高，Treg较NS组低，MC组、Dex组Th17较AS组减低，Treg较AS组升高，P=0.000。见图2、3、4，表2。

2.4 肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白水平的变化

NLRP3主要表达在肺上皮细胞、巨噬细胞及树突状细胞，Caspase-1蛋白在肺和脾脏中大量表达，染色中黄色、棕黄色为其阳性表达，见图5。AS组NLRP3、Caspase-1肺组织蛋白水平较NS组高，MC组、Dex组较AS低，P=0.000。见图6，表3。

染色中黄色、棕黄色为其阳性表达，AS组小鼠肺组织中NLRP3、Caspase-1的表达呈强阳性，NS组表达较弱；MCC950及地塞米松干预后上述蛋白的表达强度较AS组进一步减弱。

2.5 BALF中IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35浓度变化

AS组BALF的IL-17A、IL-1β、IL-18及IL-33浓度较NS增高，P均<0.01，IL-10、IL-35浓度较NS降低，P<0.05；MC组、Dex组IL-17A、IL-1β、IL-18、IL-33浓度较AS组降低，P均<0.01，IL-10、IL-35浓度较AS组高，P<0.05；见表4。

3 讨 论

哮喘的发病机制复杂，现有的理论不能完全阐明哮喘的发病机制，使哮喘的控制面临巨大的挑战，进一步深入研究哮喘的发病机制有重要意义。研究表明，哮喘患者中存在Th17/Treg细胞平衡失调，NLRP3参与哮喘的发病过程，本研究通过制作小鼠哮喘模型，探讨NLRP3炎症小体介导Th17/Treg失衡在哮喘气道炎症中的作用，使用NLRP3抑制剂MCC950干预哮喘小鼠，观察MCC950干预对哮喘小鼠气道炎症、Th17/Treg失衡的影响，进一步探讨哮喘的发病机制，并为哮喘的治疗提供新的思路。

本研究观察到AS组的小鼠呼吸频率增快、呼吸困难、口唇发绀、烦躁抓耳、活动减少，检测发现BALF细胞计数及EOS百分比和IL-17A、IL-18及IL-33浓度增高，通过对肺组织切片HE染色后观察到以嗜酸性粒细胞为主的气道炎症。成功的哮喘动物模型^[16-18]表现为气道炎性指标增加（如BALF的EOS、细胞因子IL-17、IL-18及IL-33等）、肺组织炎症细胞浸润、黏液分泌物增多等及气道反应性增加。评价哮喘动物模型成功的指标包括气道炎症细胞浸润增加和气道反应性增高。气道反应性测定包括无创和有创两种方法，其干扰因素多，实施繁杂，仪器设备昂贵，且不能模拟哮喘自然发病状态，目前应用较少。复习大量国内外哮喘动物模型的相关文献发现，大多数研究将以嗜酸粒细胞浸润为主的气道炎症改变作为判断哮喘小鼠模型成功的主要指标，气道反应性测定少用。

本研究应用流式细胞技术检测AS组外周血、肺及脾组织的单个核细胞悬液中Th17占CD4⁺细胞的百分比均高于NS组，而Treg占CD4⁺细胞的百分比均低于NS组，同时Th17/Treg的比值升高。哮喘发生与Th17升高、Treg降低及Th17/Treg平衡失调有关。有研究表明哮喘患者病情的严重程度与患者外周血中Th17细胞IL-17的表达量呈正相关，其痰液的IL-17A水平升高^[19-20]。本研究发现在哮喘小鼠中，Th17不仅在外周血中升高，在肺组织、脾组织中同样升高，考虑哮喘的炎症不仅累及肺，还在外周血和脾组织中有表达。研究表明Treg的数目变化或功能缺陷也在哮喘气道炎症中发挥重要作用^[21]。本研究进一步采用MCC950干预后Th17比例下降，Treg比例上升，Th17/Treg比例较AS组下降，MCC950干预有助于改善这种平衡失调。文献报道，MCC950干预抑制小鼠气管移植后Th1/Th17反应和促进Treg反应改善闭塞性细支气管炎^[22]，未见MCC950改善哮喘Th17/Treg平衡的报道，将为探索哮喘患者NLRP3抑制剂和Th17与Treg调节作用方面的机制和治疗药物提供新思路。

应用ELISA测各组小鼠BALF液中的Th17相关细胞因子IL-17A和Treg相关细胞因子IL-10、IL-35的浓度，结果显示AS组BALF中IL-17A浓度较NS增高，IL-10、IL-35水平均低于NS组，MC组IL-17A浓度较AS组降低，IL-10、IL-35高于AS组。这一结果表明哮喘小鼠中Th17相关细胞因子增加，Treg相关细胞因子降低。研究表明气道中IL-17A、IL-17F等因子的水平与哮喘疾病严重程度和气道反应相关^[23-24]。Kearley J^[25]等研究发现将CD4⁺ CD25⁺Treg输入哮喘小鼠体内，分泌的IL-10可缓解哮喘小鼠气道高反应、减轻嗜酸性粒细胞浸润，本研究使用OVA建立的哮喘小鼠模型中Treg相关细胞因子降低。与此同时使用MCC950干预可以抑制Th17相关细胞因子IL-17A和促进Treg相关细胞因子IL-10、IL-35的产生，可以调节Th17和Treg功能，MCC950可能成为Th17/Treg失衡所致哮喘的潜在治疗药物。由此，本研究得出结论哮喘中Th17/Treg比例升高，并且其相关细胞因子水平也有相应改变，Th17/Treg比例失衡可能是哮喘发病机制之一。经MCC950干预可调节Th17/Treg比例失衡和调节相关细胞因子的浓度。

应用免疫组化法观察到AS组肺组织NLRP3和Caspase-1蛋白水平高于NS组，ELISA测定显示AS组BALF中IL-1β、IL-18、IL-33浓度较NS组增高，考虑哮喘小鼠中炎症小体NLRP3和Caspase-1及其下游细胞因子浓度增加，炎症小体NLRP3和Caspase-1及其下游细胞因子IL-1β、IL-18、IL-33参与小鼠哮喘的发生发展。应用MCC950干预后MC组IL-1β、IL-18、IL-33浓度较AS组降低。该结果表明NLRP3、Caspase-1及其下游细胞因子的增高与哮喘有关，使用MCC950干预后可使其浓度下降，可能有助于哮喘气道慢性炎症的控制。Rossios C等^[26]研究证实患者痰液样本中的NLRP3炎症小体与哮喘病情呈正相关，哮喘病情越重则NLRP3炎症小体表达水平越高。本研究应用MCC950干预后哮喘小鼠BALF液的IL- 1β、IL-33及IL- 18浓度和肺组织NLRP3蛋白水平、Caspase-1蛋白水平较AS组降低，证实MCC950干预可阻滞哮喘小鼠NLRP3及其下游细胞因子IL- 1β、IL-33及IL- 18表达。IL-1β和IL-18可诱导T细胞向Th1和Th17分化，IL-1β可促进Th17细胞分化、维持Th17相关细胞因子的产生，也可促进嗜酸性粒细胞的募集。在炎症条件下，在有IL-2存在的前提下IL-1β可诱导Treg转化为促炎Th17，且在炎症和自身免疫之间建立起功能联系^[27]。上述结果证实之前的推测，NLRP3炎症小体参与Th17/Treg平衡失调介导的气道炎症发病过程，NLRP3炎性小体及其下游细胞因子IL-1β、IL-33及IL-18参与哮喘的发生与发展，MCC950可能是NLRP3炎性小体介导的哮喘气道炎症药物治疗的新思路或新途径。

糖皮质激素因对炎症细胞、炎症介质和炎症反应等多途径均有抑制作用而成为目前治疗哮喘的一线用药。Dex作为糖皮质激素的代表药，本研究设立Dex干预组，对比MCC950干预组哮喘小鼠气道炎症的影响，结果显示，Dex干预与MCC950干预相比，Dex组外周血、肺组织及脾组织中Th17较MC低，Treg较MC组高，差异有统计学意义；BALF液中IL-1β、IL-10、IL-17A、IL-33、IL-18表达及肺组织中Caspase-1 蛋白水平与MC组差异有统计学意义。Dex组BALF细胞数、嗜酸性粒细胞比例低于MC组，差异有统计学意义，综合分析Dex干预哮喘小鼠优于MCC950，其机制是糖皮质激素作为抗炎药从多个环节全面抑制哮喘气道炎症，MCC950主要作用于NLRP3及其细胞因子所致的气道炎症有关。尽管MCC950对哮喘小鼠作用不如Dex，但非激素类药物类似于白三烯受体的拮抗剂孟鲁司特钠，也为探索哮喘发病机制、新药的研究、联合治疗等提供新的思路。

综上所述，在哮喘小鼠模型中，NLRP3、Caspase-1及NLRP3下游细胞因子IL-1β、IL-18及IL-33升高，Th17产生的细胞因子IL-17A升高，Treg产生的细胞因子IL-10、IL-35降低，Th17/Treg比例升高，NLRP3炎症小体可通过介导Th17/Treg失衡，参与或加重哮喘气道炎症的发生。MCC950可通过下调哮喘小鼠Th17功能，上调Treg功能，从而调节Th17/Treg平衡，降低支气管肺组织IL-17A、IL-1β、IL-18、IL-33、NLRP3及Caspase-1水平，上调支气管肺组织IL-10、IL-35水平，减轻哮喘气道炎症。然而，NLRP3及相关细胞因子的调控以及Th17和Treg之间的转化调控复杂精细，涉及复杂的炎症和免疫异常，许多问题还未得到阐释。因此，进一步研究NLRP3和Th17与Treg在哮喘发病机理中的作用及相互影响，探索NLRP3及相关因子的调控和Th17与Treg之间的转化调控将有助于进一步阐明哮喘的发病机制，为哮喘的治疗提供新的思路。

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基金资助

遵义市科技计划资助项目(遵市科合HZ（2021）24号)