HSF1/AMPK信号通路在铁死亡参与糖尿病心肌病发病的机制研究

Role of the HSF1/AMPK signaling pathway in the pathogenesis of ferroptosis-involving diabetic cardiomyopathy

摘要

目的 探讨热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）/5'-单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）信号通路调控铁死亡对糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）发病的影响。 方法 本研究为实验研究，采用空白对照与多组实验对照。H9c2细胞随机分为4组：低葡萄糖组（control，Con）、高葡萄糖组（high glucose，HG）、HG+HSF1组、HG+HSF1+化合物C（compound C，CC）组。分别对细胞进行罗丹明胶质蛋白染色、细胞线粒体（reactive oxygen species，ROS）检测和细胞脂质ROS检测，并通过Western blot分析AMPK信号表达。雄性C57/BL6小鼠随机分为4组：NC组、NC+HSF1组、DM组和DM+HSF1组，每组12只。通过超声心动图评估了小鼠心血管功能参数。 结果 与Con组相比，HG组HSF1、pAMPK/AMPK水平明显下调（P=0.005、0.002），和相对细胞表面积、线粒体Fe²⁺水平、线粒体ROS水平、细胞脂质ROS水平明显增加（P=0.001、0.003、0.006、0.002）。与HG组相比，HG+HSF1组明显逆转了这些变化（P=0.001、0.001、0.002、0.006、0.007、0.003），但加入CC时HSF1的逆转作用明显减弱（P<0.05）。与NC组相比，DM组EF%、FS%、E/A、E'/A'和心脏组织中HSF1、pAMPK/AMPK表达明显降低（均P<0.01），和心脏组织中Fe²⁺、ROS、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平和4-羟基壬烯酸（4-Hydroxynonenal，4-HNE）蛋白水平明显增加（P=0.004、0.003、0.001、0.004），DM+HSF1组明显逆转了这些变化。 结论 HSF1在DCM病理过程中发挥心脏保护作用，其抗铁死亡作用可能与AMPK依赖性的脂质代谢和线粒体稳态调节有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of ferroptosis regulated by the heat shock factor 1（HSF1）/adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase（AMPK） signaling pathway on the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy（DCM）. Methods This was an experimental study with a blank control and multiple experimental controls. H9c2 cells were randomly divided into 4 groups：low glucose group（control，Con），high glucose（HG） group，HG+HSF1 group，and HG+HSF1+compound C（CC） group. The cells were stained by rhodamine colloid protein，and tested for mitochondrial reactive oxygen species（ROS） and cellular lipid ROS. The AMPK signal expression was analyzed by Western blot. Male C57/BL6 mice were randomly divided into four groups： negative control（NC） group，NC+HSF1 group，DM group，and DM+HSF1 group，with 12 mice in each group. The cardiovascular function parameters of mice were evaluated by echocardiography. Results Compared with the Con group，the levels of HSF1 and pAMPK/AMPK in the HG group decreased significantly（P=0.005，0.002），and the relative cell surface area，mitochondrial Fe²⁺ level，mitochondrial ROS level，and cellular lipid ROS level increased significantly（P=0.001，0.003，0.006，0.002）. Compared with the HG group，the HG+HSF1 group significantly reversed these changes（P=0.001，0.001，0.002，0.006，0.007，0.003），but the reversal effect of HSF1 was obviously weakened when CC was added（P<0.05）. Compared with the NC group，the ejection fraction，fractional shortening，mitral ratio of peak early to late diastolic filling velocity（E/A），and E'/A' as well as the expression levels of HSF1 and pAMPK/AMPK in heart tissues in the DM group were significantly decreased（P<0.01），and the levels of Fe²⁺，ROS，malondialdehyde，and 4-hydroxynonenal protein in heart tissues were significantly increased（P=0.004，0.003，0.001，0.004）；the DM+HSF1 group significantly reversed these changes. Conclusion HSF1 plays a cardioprotective role in the pathological process of DCM，and its anti-ferroptosis effect may be related to AMPK-dependent lipid metabolism and mitochondrial homeostasis regulation.

Graphical abstract

关键词

热休克因子1 / 5'-单磷酸腺苷活化蛋白激酶 / 糖尿病心肌病 / 小鼠 / 铁死亡

Key words

heat shock factor 1 / adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase / diabetic cardiomyopathy / mouse / ferroptosis

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是在糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者中发现的一种特殊类型的心肌病，可引起病理异常，包括心肌细胞凋亡、左心室功能障碍、心脏重塑、炎症、氧化反应和心肌代谢紊乱^[1]。目前预防DCM的治疗策略结果不能令人满意。因此，新的药物或分子干预措施对遏制DCM患者心室功能障碍和重塑的发生率不断上升至关重要。最近研究发现，铁死亡与各种疾病有关，包括心脏疾病^[2]。铁死亡是一种非凋亡形式的调节性细胞死亡，由磷脂氢过氧化物以铁依赖的方式过量产生而诱导^[3]。铁死亡与心脏缺血/再灌注损伤和多柔比星诱导的心肌病相关的病理过程有关^[4]。然而，目前尚不清楚铁死亡是否也在慢性疾病相关的心脏功能障碍（如DCM）中起作用。越来越多的证据表明，糖尿病患者体内的铁过载不仅会增加胰岛素抵抗和糖尿病进展的风险，还会通过芬顿反应加重心血管并发症^[5]。因此，本研究旨在明确铁死亡在扩张型心肌病发病机制中的作用。热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）是一种应激反应转录因子，在各种应激因素下调节热休克蛋白的表达^[6]。由HSF1介导的热休克是生物体长期进化过程中形成的一种分子应激防御反应^[6]。在心血管方面，HSF1在压力过载心力衰竭模型中可以通过积极调节环磷酸腺苷途径来缓解心力衰竭^[7]。此外，最近研究证实，HSF1可能通过维持细胞的铁平衡和谷胱甘肽过氧化酶4（glutathione Peroxidase 4，GPX4）的表达，成为对抗铁死亡的关键防御者^[6]。但目前仍缺乏关于HSF1在DCM保护方面的更多细节。因此，本研究拟通过体内外DCM模型探讨HSF1在铁死亡和心脏损伤中的保护作用和潜在机制。

1 材料与方法

1.1 H9c2细胞培养

从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库获得H9c2细胞系。将细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的达尔伯克（氏）必需基本培养基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）（美国Hyclone公司）中培养。细胞随机分成4组：低葡萄糖组（Con；加入5.5 mmol/L葡萄糖培养48 h）、高葡萄糖组（high glucose，HG；加入33 mmol/L葡萄糖培养48 h）、HG+HSF1（重组人HSF1蛋白，美国Abcam公司）、HG+HSF1+化合物C（compound C，CC，美国MedChemExpress公司）。HG+HSF1组细胞用33 mmol/L葡萄糖培养前，用50 ng/mL HSF1处理1 h。HG+HSF1+CC组细胞用33 mmol/L葡萄糖培养前，用50 ng/mLHSF1和5 μmol/L CC处理1 h。

1.2 罗丹明胶质蛋白染色

通过罗丹明标记鬼笔环肽染色（上海宜胜生物科技有限公司）评估相对细胞表面积。首先，H9c2心肌细胞在37 ℃下用罗丹明标记鬼笔环肽（5 μg/mL）染色1 h；然后，在黑暗中用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）反应5 min。用BX53荧光显微镜（日本Olympus公司）观察染色情况。

1.3 细胞线粒体超氧化物产生（mitochondrion reactive oxygen species，mitoROS）检测

将H9c2细胞与100 nmol/L Mito-Tracker Green（美国Thermo Fisher Scientific公司）在37 ℃的低血清培养基中孵化30 min。然后将细胞与磷酸盐缓冲盐水中的5 μmol/L MitoSox Red（美国Thermo Fisher Scientific公司）在37 ℃下在黑暗中孵育30 min。此外，用温热的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered salin，PBS）缓冲液轻轻清洗细胞3次，并立即用ImageXpress^® Micro Confocal High-Content Imaging System（美国Molecular Devices公司）进行检测，以确定ROS水平。

1.4 细胞脂质ROS检测

将H9c2细胞与C11-BODIPY（美国Thermo Fisher Scientific公司）在37 ℃下孵育30 min。孵育后，用Hoechst33342（上海碧云天生物科技有限公司）染色，并用ImageXpress^® Micro Confocal High-Content Imaging System（美国Molecular Devices公司）进行分析。

1.5 Western blot分析

使用放射免疫沉淀法裂解缓冲液裂解小鼠心脏组织和心肌细胞。使用二辛可宁酸蛋白定量试剂盒测定细胞裂解液的蛋白浓度。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上（美国Millipore公司）。在室温下用5%的脱脂牛奶在Tris-缓冲盐水中阻断非特异性结合点2 h，在4 ℃下将膜与一级抗体孵育过夜。此外，将膜与相应的二抗一起孵育，通过ChemiDoc XRS（美国Bio-Rad公司）对斑点进行可视化和定量。用Image J软件分析斑点强度。

本研究中使用的主要抗体包括抗GPX4抗体（1∶1 000，美国abcam公司），抗心钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗体（1∶1 000，美国Abcam公司），抗4-羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal，4-HNE）抗体（1∶2 000，美国Abcam公司），抗乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）抗体（1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司），抗磷酸化ACC抗体（1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司），抗磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）抗体（1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司），抗磷酸化AMPK抗体（Thr172；1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司），抗长链酰基辅酶a合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4）抗体（1∶1 000，美国proteintech group公司）和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（1∶1 000，美国proteintech group公司）。

1.6 动物实验

雄性C57/BL6小鼠（8周，20~22 g）购自北京维通达生物技术有限公司。所有小鼠均在标准化条件下饲养（12 h光/暗循环，温度22~24 ℃，湿度35%~60%），可自由饮用食物和水。喂养1周后，将小鼠随机分为4组：正常对照（normal control，NC）组、NC+HSF1组、DM组和DM+HSF1组，每组12只。DM组和DM+HSF1组小鼠喂食高脂饮食3个月以诱导胰岛素抵抗，然后连续2 d腹腔内注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ，溶于柠檬酸缓冲液中，50 mg/kg）诱导部分胰岛素缺乏和高血糖症，以空腹血糖≥11.1 mmol/L确认DM建模成功^[8]。NC组、NC+HSF1组喂食正常饲料。建模后，DM组和DM+HSF1组继续给予高脂饮食。NC+HSF1组和DM+HSF1组小鼠从建模后皮下注射HSF1（0.5 mg/kg），每周3次，连续治疗6个月。当HSF1治疗完成后，进行超声心动图检查，然后处死小鼠（DM发病后6个月）。

1.7 超声心动图

各组随机选取6只小鼠，麻醉后通过超声心动图测量（Vevo TM 2100，加拿大VisualSonics公司）评估小鼠的心脏功能。在乳头肌水平记录m型追踪，分析了射血分数（ejection fraction，EF）和分数缩短（fraction shortening，FS）。脉冲多普勒超声心动图和组织多普勒成像分别用于测量E/A比值和E'/A'比值。

1.8 组织学和免疫组织化学分析

心肌样品用4%多聚甲醛固定24 h，然后包埋在石蜡中。将5 μm的心肌横截面横向切成4 mm的切片，用苏木精和伊红（hematoxylin-eosin，H&E）染色。此外，心脏切片用Masson三色染色以检测细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积。将组织切片与抗HSF1（1∶500；美国Cell Signaling Technology公司）抗体在4℃孵育过夜，随后进行DAB染色（上海Beyotime公司）。使用ImageProPlus6.0分析数据。

1.9 ROS、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和Fe²⁺水平测定

使用ROS、GSH和MDA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定心脏组织中的ROS、GSH和MDA水平。使用铁分析试剂盒（美国Abcam公司）测量心脏组织中的Fe²⁺水平。

1.10 统计学方法

通过SPSS 25.0进行统计分析。数据表示为平均值±标准差。使用单向方差分析和Tukey事后检验进行多组比较。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 HSF1上调对HG诱导的心肌细胞肥大影响

首先，本研究测定了H9c2细胞中HSF1的水平，发现与HG处理0 h相比，HG处理12 h时细胞中HSF1蛋白表达明显上调（相对水平：1.00±0.03 vs. 2.42±0.22，P<0.001），和24 h、48 h时明显下调（相对水平：1.00±0.03 vs. 0.28±0.03、0.24±0.02，均P<0.001）（图1A）。然后研究采用HSF1拯救HG诱导H9c2中HSF1水平的下调，结果显示与HG组相比，HG+HSF1组HSF1水平显著上调（相对水平：0.25±0.02 vs. 1.63±0.07，P<0.001）。随后，本研究通过测量肥大标志物ANP的蛋白水平和用罗丹明磷灰素染色细胞，研究HSF1在心肌细胞肥大中的作用。与Con组相比，HG组ANP的蛋白水平和相对细胞表面积均明显增加（均P<0.05）。HG+HSF1组ANP的蛋白水平和相对细胞表面积均较HG组明显降低（P<0.05）（图1B~D）。

2.2 HSF1上调对HG诱导的心肌细胞铁死亡影响

与Con组相比，HG组细胞脂质ROS水平明显增加（P<0.001）。HG+HSF1组细胞脂质ROS水平明显低于HG+Vector组（P<0.001）（图2）。

2.3 HSF1通过激活AMPK对铁死亡表现出保护作用

激活AMPK是治疗HG诱导的心脏毒性的一种潜在应对策略^[5]。以前的一些研究广泛地探讨了AMPK在铁死亡中的作用，并证实了HSF1对AMPK的激活作用^[7]。与Con组相比，HG组细胞中pAMPK/AMPK、pACC/ACC、GPX4表达明显降低（相对水平：1.00±0.02 vs. 0.65±0.06，1.00±0.02 vs. 0.72±0.07，1.00±0.03 vs. 0.53±0.04，P<0.01），和ACSL4表达明显增加（相对水平：1.00±0.02 vs. 1.23±0.08，P<0.01）。与HG组相比，HG+HSF1组细胞中pAMPK/AMPK、pACC/ACC、GPX4表达明显增加（相对水平：0.65±0.06 vs. 0.98±0.07，0.72±0.07 vs. 0.90±0.06，0.53±0.04 vs. 0.89±0.07，P<0.01），和ACSL4表达明显降低（相对水平：1.23±0.08 vs. 1.03±0.08，P<0.01）。另一方面，化合物C（CC），一种AMPK的抑制剂，抑制了HSF1对AMPK信号的激活作用（图3）。此外，CC增加了HSF1干预后HG处理的H9c2细胞的ANP蛋白水平（图1B）、相对细胞表面积（P<0.01）（图1C）和脂质ROS水平（P<0.01）（图2B）。

2.4 HSF1上调对HG诱导的铁死亡中线粒体毒性影响

在HG处理的H9c2细胞中，线粒体Fe²⁺水平增加，线粒体ROS水平随之增加（P<0.01）。HSF1上调部分抑制了HG诱导的线粒体Fe²⁺和线粒体ROS产生的过度积累（P<0.01）。然而，HSF1上调对线粒体的保护作用被CC逆转（P<0.01）（图4）。

2.5 HSF1通过预防心肌细胞铁死亡保护心脏功能

与NC组相比，DM组诱导心脏组织肥厚性改变，心肌内的细胞外基质沉积明显增加（均P<0.01），和心肌组织中HSF1表达明显降低（P<0.01）。与DM组相比，DM+HSF1组心脏组织肥厚性和细胞外基质沉积显著减轻，和心肌组织中HSF1表达明显增加（均P<0.01）（图5A~F）。超声心动图分析显示，与NC组相比，DM组EF%、FS%、E/A、E'/A'明显降低（均P<0.01），和LVEDd明显增加（均P<0.01），DM+HSF1组明显逆转了这些变化（图5G、表1）。铁死亡指标分析显示，与NC组相比，DM组心脏组织中Fe²⁺、ROS、MDA水平和4-HNE蛋白水平明显增加（均P<0.01），以及GSH水平和GPX4、pAMPK/AMPK表达明显降低（均P<0.01），DM+HSF1组显著逆转了这些变化（图5H~K、表1）。综上所述，HSF1上调通过激活AMPK对铁死亡介导的DCM具有明显的保护作用。

3 讨 论

DM是导致异常心血管疾病的主要环境原因。目前，DCM的发病率在DM患者中逐渐增加。最近研究证实，铁死亡是DCM的1个主要特征。心肌细胞的不断丧失引发了心肌肥大、心肌纤维化，以及收缩和舒张功能受损^[9]。铁死亡是一种以铁超载为特征的细胞死亡形式，导致脂质过氧化物的致死水平积累^[10]。高铁饮食导致严重的心脏损伤和肥厚性心肌病^[10]。此外，铁超载增加了AngⅡ诱导的心脏纤维化并促进新生内膜的形成^[11]。本研究表明，HSF1通过限制铁积累、恢复GPX4依赖的抗氧化能力以及防止细胞水平或线粒体水平的脂质过氧化来抑制体外高糖模拟DCM模型的铁中毒。体内研究也证实了HSF1上调通过激活AMPK对铁死亡介导的DCM具有显著的保护作用。

心肌细胞损失是DM诱导的心脏损伤和功能障碍的主要原因^[12]。此外，预防心肌细胞损失是治疗DCM的有效方法。据报道，不同类型的程序性细胞死亡，如细胞凋亡、坏死和铁死亡等均参与了DCM^[13-14]。铁死亡的特点是铁依赖性的脂质过氧化的过度积累。本研究表明，在DM小鼠的心脏组织中，铁死亡阴性调节剂GPX4的水平降低，而阳性标志物如4-HNE则增加。这些变化与脂质过氧化产物和铁含量的增加有关。值得注意的是，所有这些变化在体外经HG处理的H9c2心肌细胞中也有表现。研究发现，HG处理的心肌细胞表现出铁中毒的特征，如游离铁的增加和脂质过氧化物的积累^[15]。因此，本研究的结果表明，针对铁死亡的抑制是预防DCM的一种有效的心脏保护策略。

HSF1是一种应激诱导的转录因子，通过转录激活各种热休克蛋白，在热休克反应中起着关键作用。近年来，一些研究已经注意到HSF1在调控应激反应的细胞氧化还原平衡中的重要性^[6]。HSF1的缺乏导致心脏和肾脏中的谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽二硫酸盐（GSSG）比率下降约40%，并增加线粒体的氧化损伤，进而导致细胞程序性死亡^[16]。此外，HSF1可以通过转录调节热休克蛋白（如HSPA1A、HSPA4和HSPB6）来应对重金属引起的应激反应^[17]。HSF1已经被发现参与了癌细胞的铁死亡^[18]。在本研究中，HG暴露抑制H9c2心肌细胞中HSF1表达，并导致细胞的肥大效应、Fe²⁺水平积累和脂质过氧化。通过上调H9c2心肌细胞中HSF1表达，逆转了HG暴露诱导的这些变化。线粒体是连接新陈代谢和细胞死亡的重要调节器。最近研究报道，铁中毒主要与线粒体形态和功能受损有关^[19]。线粒体约占心肌细胞体积的45%，是关键的能量代谢场所。研究发现，线粒体触发了HG诱导的心肌细胞铁中毒的细胞死亡^[20]。此外，调节线粒体的ROS可能是HG诱导的心肌细胞死亡和损伤的有效治疗方案^[21]。本研究发现，HSF1上调减轻了HG诱导的线粒体毒性作用，这可能有助于减轻H9c2心肌细胞中铁死亡。

铁中毒相关的代谢重塑最近受到越来越多的关注。研究发现，AMPK的激活赋予了抵抗铁死亡的能力^[5]。Lee M等^[22]研究报告称，AMPK对铁死亡的调节与AMPK介导的乙酰CoA羧化酶的磷酸化和多不饱和脂肪酸的生物合成相关联。AMPK的ACC磷酸化和失活抑制了乙酰CoA向丙二酰CoA的转化，而丙二酰CoA是脂肪酸（包括长链PUFA）生物合成所必需的，导致脂质过氧化物的生成减少，最终抑制了铁中毒^[23]。AMPK还与线粒体的脂肪酸氧化和平衡有关。它的激活会引起线粒体的生物生成。最近研究证实，HSF1可以通过转录激活上调AMPK的转录水平，而敲除HSF1可逆转这一过程^[6]。本研究在体内外研究均证实了HSF1可能通过激活AMPK表现出对铁死亡诱导心脏损伤的保护作用。值得注意的是，CC是AMPK的抑制剂，它逆转了HSF1对用HG处理的心肌细胞铁死亡的保护作用，进一步表明HSF1对HG诱导的心肌细胞铁死亡的保护作用可能依赖于AMPK的激活。

总之，本研究揭示了铁死亡在DCM病理过程中的重要作用，并确立了HSF1的心脏保护作用，其抗铁死亡作用可能与AMPK依赖性的脂质代谢和线粒体稳态调节有关。这些发现可以更好地理解DCM心脏损伤的病理生理学基础，并为其预防或缓解提供新的线索。

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基金资助

湖南省卫生健康委科研计划资助项目(202100236512)