低滴度抗核抗体阳性与冻融胚胎移植妊娠结局的相关性研究

Correlation between low anti-nuclear antibody titers and pregnancy outcomes after frozen embryo transfer

摘要

目的 探讨低滴度抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）阳性与冻融胚胎移植（frozen embryo transfer，FET）妊娠结局的相关性。 方法 筛选2019年1月至2022年1月于山东中医药大学附属医院生殖中心行FET患者的临床资料共1 562例，根据ANA检测结果分为低滴度阳性组155例和阴性组1 407例，将2组进行倾向性评分匹配后得到阳性组与对照组各48例，进行回顾性研究比较2组患者的妊娠结局。 结果 阳性组较对照组年龄（P=0.027）更大，临床妊娠率（P=0.008）、活产率（P=0.012）更低，差异有统计学意义，2组间异位妊娠率、流产率、早产率、单胎早产率、单胎出生体质量、单胎出生身长差异无统计学意义（P>0.05），低滴度ANA阳性是FET临床妊娠（P=0.008）、活产（P=0.014）的独立影响因素，低滴度ANA阳性较ANA阴性患者FET更难获得临床妊娠（OR=0.325，95%CI=0.140~0.750）和活产（OR=0.342，95%CI=0.146~0.801）。 结论 低滴度ANA阳性与FET妊娠结局有关，对临床妊娠和活产有不利影响。

Abstract

Objective To determine the correlation between low anti-nuclear antibody（ANA） titers and pregnancy outcomes after frozen embryo transfer（FET）. Methods Clinical data were collected from 1 562 patients undergoing FET at the Reproductive Center of the Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine between January 2019 and January 2022. The patients were initially divided into the low-titer ANA-positive group（n=155） and ANA-negative group（n=1 407） based on their ANA test results. After propensity score matching，there were 48 patients each in the ANA-positive and ANA-negative groups. The pregnancy outcomes of the two groups were retrospectively analyzed. Results Patients in the ANA-positive group were older than those in the ANA-negative group（P=0.027），with significantly lower clinical pregnancy rate（P=0.008） and live birth rate（P=0.012）. There were no significant differences in ectopic pregnancy rate，miscarriage rate，premature birth rate，single premature birth rate，single birth weight，and single birth length between the two groups（P>0.05）. Low-titer ANA positivity was an independent influencing factor for clinical pregnancy（P=0.008） and live birth（P=0.014） after FET. Clinical pregnancy（OR=0.325，95%CI=0.140-0.750） and live birth（OR=0.342，95%CI=0.146-0.801） after FET were more difficult for patients with low-titer ANAs compared to those without ANAs. Conclusion Low ANA titers are associated with FET pregnancy outcomes and have adverse effects on clinical pregnancy and live birth.

关键词

胚胎移植 / 抗核抗体 / 妊娠结局

Key words

embryo transfer / anti-nuclear antibody / pregnancy outcomes

抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）是针对细胞核成分为靶抗原产生的自身抗体的总称。ANA阳性常见于自身免疫性疾病，但健康人群中也能检出，尤其是低滴度阳性。国内流行病学调查研究显示，健康人群ANA阳性率约为14%，但滴度较低，多为1∶100，且健康女性的ANA阳性率较健康男性更高，高达19%^[1]。既往ANA阳性与妊娠结局间的相关性研究多针对不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）或体外受精/卵胞浆内显微注射-胚胎移植（in vitro fertilization/intra-cytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF/ICSI-ET）进行，针对冻融胚胎移植（frozen embryo transfer，FET）的研究极少，且低滴度ANA阳性作为在健康人群中也常检出的免疫异常指标，是否对其提前筛查及干预均不明确。为探究低滴度ANA阳性与FET妊娠结局间是否存在相关性，进行了研究如下。

1 资料与方法

1.1 资料

取2019年1月至2022年1月于山东中医药大学附属医院生殖中心行FET助孕的不孕症患者，从中筛选出满足下述标准的病例：纳入标准：年龄<40岁；月经周期规律；使用自然周期制备内膜；胚胎来自夫妇本人的卵母细胞及精子；近半年内未服用免疫抑制剂。排除标准：有复发性流产病史；有反复着床失败病史；未经治疗的慢性子宫内膜炎患者；有多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等其他生殖系统疾病病史；ANA中、高滴度阳性；除ANA阳性外有其他自身免疫性疾病病史；生殖道解剖形态异常；有高泌乳素血症、高雄激素血症、糖尿病等其他内分泌疾病病史；夫妇染色体异常；有心、肝、肾等系统性疾病病史。

将以上筛选出的病例根据ANA检测结果进行分组，ANA低滴度阳性为低滴度阳性组，阴性为阴性组。将筛选出的2组病例以预测变量为年龄、体质指数、不孕年限、不孕类型、基础FSH、基础LH、基础E2、移植胚胎类型、移植胚胎数、移植优质胚胎数，卡钳值为0.02，比例为1∶1使用SPSS软件进行倾向性评分匹配（propensity score matching，PSM），匹配后的2 组命名为阳性组与对照组，进行回顾性研究。

1.2 方法

1.2.1 胚胎评分标准

按Peter卵裂期胚胎评分系统评估卵裂期胚胎质量。Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形状规则，透亮，碎片<10%；Ⅱ级：卵裂球稍不均匀或形状稍不规则，胞质有颗粒现象，碎片在10%~20%；Ⅲ级：卵裂球明显不均匀或形状明显不规则，胞质有颗粒现象，碎片>20%~50%；Ⅳ级：卵裂球严重不均匀或形状严重不规则，胞质有颗粒现象，碎片>50%。将I级胚胎定义为优质胚胎，Ⅱ级胚胎定义为可用胚胎。

1.2.2 ANA检测过程

进入FET周期前采集受检者静脉血3 mL于真空采血管中，3 500 r/min离心5 min，取血清检测。ANA荧光核型分析采用间接免疫荧光法，使用人上皮HEp-2细胞系和猴肝组织细胞两种生物薄片、德国欧蒙医学实验诊断试剂公司的ANA荧光核型检测试剂盒进行检测，稀释比为1∶100、1∶320和1∶1 000。ANA滴度≥1∶100为阳性，ANA滴度≥1∶100、<1∶320为低滴度阳性。

1.2.3 FET周期过程

进入周期后，于月经周期第9日始每日超声监测卵泡发育情况，确定排卵日。卵裂期胚胎（D3）移植：于排卵日始连续给予黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份有限公司）20 mg/d×3 d，排卵后第3天进行胚胎移植。囊胚（D5）移植：排卵日始连续给予黄体酮注射液（同上）20 mg/d×5 d，排卵后第5天进行囊胚移植。若排卵日内膜厚度<7 mm则取消移植。采用玻璃化解冻，每次最多移植两枚胚胎。

1.2.4 临床指标定义

临床妊娠定义为移植后35 d超声下见宫腔内存在胎心搏动。流产定义为在妊娠28周前失去临床妊娠。活产定义为有至少1名存活胎儿分娩。早产定义为在妊娠37周之前分娩存活胎儿。

1.3 统计学方法

使用SPSS 25.0进行统计分析。连续变量中的正态分布数据以均数±标准差（x±s）表示，非正态分布数据以中位数（四分间距）[M_d （P₂₅，P₇₅）]表示；分类变量以例数（百分比）表示。使用t检验或Mann-Whitney U检验比较连续变量，使用卡方检验比较分类变量。以年龄<35岁赋值0，35岁≤年龄<40岁赋值1；ANA阴性赋值0，ANA低滴度阳性赋值1进行二分类logistic逐步回归分析，计算具有95%置信区间（confidence interval，CI）的优势比（odds ratio，OR）。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 患者一般资料

共纳入1 562例患者，其中低滴度阳性组155例、阴性组1 407例。PSM后，共有96例患者（阳性组、对照组各48例）纳入本研究，2组患者间年龄差异存在统计学意义（Z=-2.213，P=0.027），阳性组年龄更大；余基线资料比较差异无统计学意义（P>0.05）；见表1。

2.2 2组患者的妊娠结局比较

2组患者的临床妊娠率（χ²=7.119，P=0.008）、活产率（χ²=6.272，P=0.012）差异有统计学意义，阳性组的临床妊娠率、活产率较对照组更低；异位妊娠率（χ²=0.000，P=1.000）、流产率（χ²=0.000，P=1.000）、早产率（χ²=0.000，P=1.000）、单胎早产率（χ²=0.044，P=0.835）、单胎出生体质量（Z=-1.341，P=0.180）、单胎出生身长（Z=-1.259，P=0.208）在2组间差异无统计学意义；阳性组双胎活产仅2例，对照组无双胎活产，故表中数据部分缺失（用“/”表示）。见表2。

2.3 低滴度ANA阳性、年龄与FET临床妊娠的logistic回归分析

年龄未被纳入逐步回归方程，低滴度ANA阳性是FET临床妊娠的独立影响因素（OR=0.325，95%CI=0.140～0.750，P=0.008），低滴度ANA阳性较ANA阴性患者更难获得FET临床妊娠。

2.4 低滴度ANA阳性、年龄与FET活产的Logistic回归分析

年龄未被纳入逐步回归方程，低滴度ANA阳性是FET活产的独立影响因素（OR=0.342，95%CI=0.146~0.801，P=0.014），低滴度ANA阳性较ANA阴性患者更难获得FET活产。

2.5 低滴度ANA阳性对IVF/ICSI胚胎质量的影响

比较PSM后患者前次IVF/ICSI周期的Gn天数（Z=-0.754，P=0.451）、Gn总量（Z=-1.265，P=0.206）、获卵数（Z=-0.947，P=0.344）、优质胚胎率（Z=-1.892，P=0.058），阳性组的优质胚胎率存在明显下降趋势。见表3。

2.6 低滴度ANA阳性对子宫内膜容受性的影响

比较PSM后患者FET周期的排卵前内膜厚度（t=-0.473，P=0.638）、排卵前雌二醇水平（Z=-0.557，P=0.578）、排卵前孕酮水平（t=-0.229，P=0.819）、移植日雌二醇水平（Z=-0.524，P=0.600）、移植日孕酮水平（Z=-0.136，P=0.892），差异均无统计学意义。见表4。

3 讨 论

在上述研究中，匹配前2组间基线资料比较差异均无统计学意义，但在匹配后两组间基线资料比较中发现阳性组年龄明显升高，ANA阳性率在不同年龄段的健康不孕女性间是否存在差异，需后续研究论证。在匹配后2组间妊娠结局的比较中发现临床妊娠率、活产率在阳性组中均有明显下降，为排除这种下降与阳性组年龄偏高有关，随后又进行了纳入年龄因素的回归分析，结果显示ANA低滴度阳性是FET后临床妊娠、活产的独立影响因素，存在不利影响。研究同时发现阳性组的优质胚胎率有明显下降趋势，低滴度ANA阳性患者FET临床妊娠率、活产率的降低可能与胚胎质量下降有关。李颖等^[2]同样发现ANA会影响胚胎质量，表现在成熟卵率、受精率、优质胚胎率等明显下降。究其原因，Ying Y等^[3]研究发现卵泡液ANA与血清ANA水平成正比，且Li Y等^[4]在卵泡液ANA阳性患者的卵泡液中发现明显增多的细胞凋亡标志物。Wu SQ等^[5]同样发现ANA阳性抑制细胞滋养细胞增殖并加快其凋亡。除细胞凋亡增加外，González-Chávez SA等^[6]研究发现ANA阳性患者妊娠期间DNA发生过度损伤反应，这都可能引起胚胎质量下降。此外，既往研究中发现ANA阳性引起的免疫失调、子宫动脉血流受损也可能是影响ANA阳性患者妊娠结局的原因。Dei Zotti F等^[7]研究发现ANA阳性患者的CD4⁺T细胞代谢活性增强，18～40岁年龄范围内患者还伴有CD4⁺T细胞亚群比例改变，表现为TH2和TH17CD4⁺T细胞比例明显增加。Pietropolli A等^[8]研究发现ANA阳性患者在整个月经周期中的子宫动脉阻力均明显升高。本研究未发现低滴度ANA阳性会对子宫内膜容受性产生影响，受限于回顾性研究，未分析子宫动脉血流，仅在排卵前血清激素水平、排卵前内膜厚度、移植日血清激素水平间未发现差异存在统计学意义。

ANA阳性对FET妊娠结局的研究较少，但大量研究已证实ANA阳性会对IVF/ICSI-ET妊娠结局造成不利影响，2019年^[9]及2023年^[10]的Meta分析研究均显示，ANA阳性会引起IVF/ICSI-ET胚胎着床率、临床妊娠率明显下降，流产率明显升高。但也有极少数研究得出相反结论，Chen X等^[11]研究发现ANA阳性与IVF/ICSI-ET妊娠结局无关，这可能与未进行抗体滴度分组有关。ANA阳性患者的抗体滴度越高，妊娠结局可能越差，且妊娠前后ANA滴度的变化也可能影响妊娠结局。Li Y等^[12]研究发现ANA阳性患者IVF/ICSI-ET早期流产率随着抗体滴度的升高而增加。Sakthiswary R等^[13]研究发现ANA阳性uRSA患者的流产次数与抗体滴度明显相关。Ticconi C等^[14]研究发现ANA阳性uRSA患者在妊娠早期抗体转阴较妊娠期间抗体持续阳性患者的流产率明显下降。Sun S等^[15]研究发现ANA阳性uRSA患者妊娠后的抗体滴度变化是活产结局的独立影响因素。此外，也有极少量研究结论不支持ANA阳性患者的抗体滴度与妊娠结局间存在关联，Zhu Q等^[16]研究发现ANA阳性患者IVF/ICSI-ET胚胎着床率及临床妊娠率下降，早期流产率升高，但未在亚组分析中发现此种影响的不同，ANA滴度≤1∶320亚组的IVF/ICSI-ET妊娠结局与ANA滴度>1∶320亚组相似。本研究选取ANA低滴度阳性作为阳性组，抗体滴度虽低但回归分析结果表明阳性组FET临床妊娠及活产的概率仅为对照组的32.5%（OR=0.325）及34.2%（OR=0.342），已足够引起重视，更高滴度的ANA对妊娠结局的影响仍需进一步研究。在临床工作中发现健康不孕女性的ANA中滴度（ANA≥1∶320、<1∶1 000）阳性较为少见，高滴度（≥1∶1 000）阳性更是极为少见，样本数量的局限性可能是研究较难开展的主要原因。

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