胃癌是全球常见的癌症之一，由于早期疾病症状不明显，且定期筛查率较低，大多数患者在晚期才被诊断
[1]。近年来，胃癌的系统治疗，包括化疗、靶向治疗和免疫治疗，已经取得了明显进展。对于可切除的胃癌，围术期化疗已成为标准治疗
[2]。对于转移性胃癌，近年来在免疫治疗和生物靶向治疗方面取得进步。目前，基于程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的靶向治疗为胃癌患者提供了更多的治疗选择
[3]。鉴于胃癌患者的整体生存率仍然相对较低，理解并阐述胃癌发生和发展详细机制显得尤为重要。趋化素样因子（chemokine-like factor，CKLF） 样MARVEL跨膜结构域（CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing，CMTM） 基因家族包括CKLF和CMTM1-8，其中CMTM6的研究主要集中在其抗肿瘤免疫中的功能
[4]。然而，关于CMTM6在肿瘤发生中的作用尚未完全明确。有报道称CMTM6促进颈部鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma of neck，NSCC）细胞干性、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和抑制T细胞功能
[5]。此外，高表达的CMTM6与口腔鳞状细胞癌
[6]和胶质瘤
[7]的不良预后有关。CMTM6被发现与非小细胞肺癌
[8]和肺腺癌
[9]的良好生存率相关。然而，在胃癌中，CMTM6的表达和生物学特性仍不清楚。本研究拟探讨CMTM6对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响及作用机制。
1 材料与方法
1.1 组织标本
选取锦州医科大学附属第一医院2022年1月至2022年5月行腹腔镜下毕Ⅱ式胃癌根除术后的3例胃癌患者，男2例，女1例，分别为TNM Ⅱ期2例（T2N2M0和T2N1M0）、Ⅲ 期1例（T3N2M0）。患者在术中切除胃癌及癌旁正常组织，标本冻存液氮罐中，用于进一步检测。所有患者术前均未接受放化疗和生物治疗等，并签署知情同意书。
1.2 主要试剂
DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司，CCK8试剂盒、Trizol和RIPA裂解液购自中国碧云天公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒和PVDF膜购自美国赛默飞公司，RNA反转录和qPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，Transwell小室和Matrigel基质胶购自美国BD公司，蛋白A/G磁珠、CHX、一抗和二抗购自美国Sigma公司，转染试剂购自美国Invitrogen公司。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养与转染
胃正常细胞GES-1和胃癌细胞AGS和BGC-823购自中国科学院上海细胞生物研究所，采用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基在37 ℃、5%CO2平衡湿度培养箱中培养。使用Lipofectamine 2000将shRNA针对CMTM6（5'-CCCAAGACAGTGAAAGTAATT-3'）sh-CMTM6或阴性对照shRNA转染到AGS和BGC-823细胞，其具体操作按照说明书进行。
1.3.2 qRT-PCR
使用Trizol试剂从细胞和组织样本中提取总RNA，并按照生产厂家的指示使用PrimeScript反转录酶逆转录成互补DNA。使用特定引物进行qRT-PCR，以GAPDH mRNA 转录本为对照，定量目标基因的相对水平。引物序列为：CMTM6：F：5'-TTTCCACACATGACAGGA CTTC-3'，R：5'-GGCTTCAGCCCTAGTGGTAT-3'；GAPDH：F：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，R：5'-GAGATGGTG ATGGGATTTC-3'。使用2-ΔΔCt分析CMTM6相对表达水平。
1.3.3 CCK-8方法检测细胞增殖
AGS和BGC-823细胞（每孔5 000个细胞）接种到96孔板中培养，各组细胞分别培养24、48、72 和96 h后，在最后1 h培养期间，向每个孔中加入10 μL/well的CCK-8试剂，通过测量每个孔的吸光度（450 nm）来确定细胞增殖情况。
1.3.4 侵袭和迁移实验
细胞侵袭实验在24孔Transwell板（8 μm孔径）中进行，将AGS和BGC-823细胞在上层室中加入FBS无血清培养基中培养，上层室已涂有Matrigel基质胶，下层室加入完整培养基，培养24 h。用棉球清除上层室上表面的细胞，已侵入上层室下的细胞用0.5％戊二醛固定并用0.5％甲苯胺蓝染色，然后在光学显微镜下进行拍照。在迁移实验中上层室中不加入基质胶，在每个膜上的3个视野中对细胞计数。
1.3.5 流式细胞术
AGS和BGC-823细胞用预冷的PBS洗涤2次，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液（0.25 mg/mL），轻轻混匀，室温避光孵育20 min，用流式细胞仪进行检测。
1.3.6 Western blot法
收集转染24 h后的细胞，常规提取细胞总蛋白，BCA蛋白质测定试剂盒测量细胞裂解上清液中的蛋白质浓度，SDS-PAGE凝胶每孔加入40 μg的待测蛋白，110 V电泳，250 mA电转至PVDF膜，5％非脂肪奶粉的Tris缓冲盐溶液和0.1％Tween-20（TBST）阻断2 h，分别加入CMTM6、Cleaved-caspase-3和HER2一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3×10 min，二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3×30 min，ECL显影。使用Image J软件进行密度扫描分析蛋白质表达的相对水平。
1.3.7 免疫组化
胃癌组织和癌旁正常组织被固定并石蜡包埋。切片（4 μm）脱蜡和水化，然后在pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复，在微波中加热10 min。随后，在3％的过氧化氢溶液中孵育，并使用5％牛血清白蛋白进行阻断。切片在4 ℃下用HER2的一抗抗体孵育过夜。在被洗涤后，使用辣根过氧化物酶偶联的二抗抗体在室温下检测结合的抗体，并使用3,3'-二氨基联苯进行可视化，使用光学显微镜观察。
1.3.8 蛋白稳定性检测
各组细胞培养至70%~80％的密度，用PBS洗涤细胞3次，然后添加含有10 μmol/L CHX的培养基。在不同时间点（0、0.5、1和2 h）收集细胞，用PBS洗涤细胞3次，并制备细胞裂解液，然后就行Western blot检测HER2蛋白的表达水平。
1.3.9 免疫共沉淀
细胞在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解。离心后，将细胞裂解液样品与抗CMTM6抗体、抗HER2抗体或对照免疫球蛋白IgG在4 ℃孵育4 h，然后与20 μL Dynabeads在4 ℃下轻轻摇晃过夜。经过3次用冰冷PBS洗涤以去除未结合的抗体，然后通过SDS-PAGE分离珠子上的结合免疫复合物，并分别使用抗HER2或抗CMTM6进行Western blot。
1.4 统计学方法
使用GraphPad Prism 9软件（GraphPad Software）进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用两独立样本t检验或配对t检验，多组间比较采用方差分析，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 CMTM6在胃癌组织和细胞中高表达
在3对胃癌组织和癌旁正常组织中检测CMTM6蛋白和mRNA的表达水平，与癌旁正常组织相比，CMTM6蛋白（1.00±0.08 vs. 2.21±0.15；
t=12.328，
P<0.001，
图1A）和mRNA（1.00±0.11 vs. 1.82±0.13；
t=8.432，
P=0.001）的表达水平在胃癌组织中明显上调。同时，在GEPIA数据中CMTM6在胃癌组织中明显高表达（
P<0.05，
图1B），差异均有统计学意义。与胃正常细胞GES-1相比，CMTM6蛋白（3组间比较：
F=93.376，
P<0.001；两两比较：GES-1 vs. AGS，
P<0.001，GES-1 vs. BGC-823，
P<0.001，
图1C）和mRNA（3组间比较：
F=97.675，
P<0.001；两两比较：GES-1 vs. AGS，
P<0.001，GES-1 vs. BGC-823，
P<0.001）在胃癌细胞AGS和BGC-823中的表达水平明显上调。CMTM6蛋白在GES-1、AGS和BGC-823细胞中的表达量分别为1.00±0.13，2.42±0.15和2.56±0.18；CMTM6 mRNA在GES-1、AGS和BGC-823细胞中的表达量分别为1.00±0.05，1.54±0.09和2.06±0.12。与转染sh-NC组相比，AGS（1.00±0.06 vs. 0.36±0.03，
t=16.073，
P<0.001）和BGC-823（1.00±0.08 vs. 0.27±0.02，
t=14.909，
P<0.001）细胞转染sh-CMTM6后，CMTM6的表达水平明显下降。
2.2 低表达CMTM6抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移
为进一步验证CMTM6对胃癌细胞生物学功能的影响，CCK-8增殖实验显示，与sh-NC组比较，sh-CMTM6组可明显降低AGS细胞（
图2A）（时间：
F=131.477，
P<0.001；组别：
F=303.501，
P<0.001；时间组别交互：
F=20.949，
P<0.001）和BGC-823细胞（
图2B）（时间：
F=298.427，
P<0.001；组别：
F=497.095，
P<0.001；时间组别交互：
F=41.116，
P<0.001）的增殖能力；Transwell实验显示，与sh-NC组相比，sh-CMTM6组可明显降低AGS和BGC-823细胞的迁移（AGS：25.00±2.00 vs.15.00±3.00，
t=4.804，
P=0.009；BGC-823：24.00±2.00 vs. 14.00±1.00，
t=7.746，
P=0.002，
图2C）和侵袭能力（AGS：17.00±2.00 vs. 6.00±1.00，
t=8.521，
P=0.001；BGC-823：15.00±3.00 vs. 5.00±2.00，
t=4.804，
P=0.009，
图2D）。这提示低表达CMTM6能够明显抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移。
2.3 低表达CMTM6促进胃癌细胞凋亡
流式细胞凋亡实验显示，与sh-NC组相比，sh-CMTM6组可明显促进AGS和BGC-823细胞的凋亡（AGS：5.60±0.42 vs.12.30±1.37，
t=8.126，
P=0.001；BGC-823：6.31±0.61 vs. 13.45±1.10，
t=9.808，
P=0.001，
图3A）；Western blot实验显示，与sh-NC组相比，sh-CMTM6组可明显上调AGS和BGC-823细胞中Cleaved-caspase-3的表达水平（AGS：1.00±0.12 vs.1.95±0.14，
t=8.924，
P=0.001；BGC-823：1.00±0.08 vs. 2.63±0.18，
t=7.746，
P<0.001，
图3B）。这提示低表达CMTM6能够明显促进胃癌细胞凋亡。
2.4 CMTM6靶向结合HER2促进胃癌细胞增殖、侵袭和抑制细胞凋亡
CMTM6能够通过HER2调控乳腺癌的发生发展
[10]。在本研究中为验证CMTM6能否通过HER2调控胃癌细胞的生物学功能，在AGS和BGC-823细胞中转染sh-CMTM6后，与转染sh-NC组相比，AGS（1.00±0.13 vs. 0.25±0.03，
t=9.737，
P<0.001）和BGC-823（1.00±0.09 vs. 0.23±0.01，
t=14.728，
P<0.001）细胞中HER2蛋白的表达水平明显下调（
图4A），Co-IP证实CMTM6和HER2结合情况（
图4B），在低表达CMTM6后能够明显抑制HER2蛋白的稳定性，加速HER2蛋白降解（时间：
F=62.132，
P<0.001；组别：
F=121.034，
P<0.001；时间组别交互：
F=12.602，
P<0.001，
图4C）。免疫组化显示HER2在胃癌组织中阳性表达（
图4D）。Transwell侵袭实验结果显示：与sh-NC组相比，LV-CMTM6组可明显促进AGS和BGC-823细胞的侵袭能力，而同时转染LV-CMTM6和sh-HER2后，对AGS（3组间比较：
F=22.071，
P=0.002；两两比较：sh-NC，16.00±3.00 vs. LV-CMTM6，27.00±2.00，
P=0.001，sh-NC，16.00±3.00 vs. LV-CMTM6+sh-HER2，18.00±1.00，
P=0.460）和BGC-823（3组间比较：
F=55.500，
P<0.001；两两比较：sh-NC，14.00±1.00 vs. LV-CMTM6，25.00±2.00，
P<0.001，sh-NC，14.00±1.00 vs. LV-CMTM6+sh-HER2，15.00±1.00，
P=0.620）细胞的侵袭能力无影响。流式细胞凋亡实验显示，与sh-NC组相比，LV-CMTM6组可明显抑制AGS和BGC-823细胞的凋亡，而同时转染LV-CMTM6和sh-HER2后，对AGS（3组间比较：
F=70.496，
P<0.001；两两比较：sh-NC，6.20±0.50 vs. LV-CMTM6，2.50±0.18，
P<0.001，sh-NC，6.20±0.50 vs. LV-CMTM6+sh-HER2，6.00±0.52，
P=0.800）和BGC-823（3组间比较：
F=65.408，
P<0.001；两两比较：sh-NC，6.10±0.45 vs. LV-CMTM6，2.80±0.21，
P<0.001，sh-NC，6.10±0.45 vs. LV-CMTM6+sh-HER2，5.80±0.46，
P=0.570）细胞的凋亡率无影响。这提示CMTM6能够靶向结合HER2促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，以及抑制胃癌细胞的凋亡。
3 讨 论
HER2是一种跨膜酪氨酸激酶受体，属于HER受体家族。研究显示HER2在胃癌中显著高表达，尤其是在肠型和胃食管连接处
[11]。HER2过表达与胃癌患者预后不良、侵袭性行为和耐药性有关
[12]。曲妥珠单抗是一种针对HER2的单克隆抗体，已经获批用于与化疗联合治疗HER2阳性晚期胃癌，显示出显著的生存益处
[7]。然而，曲妥珠单抗耐药是限制其临床疗效的主要挑战。CMTM6已被证明参与多种生物学过程，如免疫调节、细胞分化和肿瘤发生
[13]。CMTM6已被确定为PD-L1的关键调节因子，PD-L1是PD-1的配体，介导癌细胞的免疫逃避
[14]。CMTM6通过防止PD-L1的泛素化和降解来稳定PD-L1蛋白，从而增强其在细胞表面的表达
[7]。CMTM6在多种人类癌症中高度表达，并与患者不良预后和免疫抑制相关。此外，CMTM6已被证明与HER2相互作用，并调节其在乳腺癌细胞中的表达和信号传递，导致曲妥珠单抗耐药
[10]。
在本研究中纳入3对胃癌组织和癌旁正常组织，CMTM6 蛋白和mRNA在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，在GEPIA数据库中CMTM6在胃癌组织中显著高表达，同时在胃癌细胞AGS和BGC-823中的表达水平显著上调。在细胞功能验证中，低表达CMTM6能够显著抑制AGS和BGC-823细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡；过表达CMTM6能够显著促进AGS和BGC-823细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制细胞凋亡。研究显示CMTM6在多种恶性肿瘤中过度表达，与脑胶质瘤、口腔鳞状细胞癌、头颈鳞状细胞癌、肺腺癌、非小细胞肺癌和肝癌的恶性程度相关，并与患者预后不良有关
[7，15-16]。在本研究中CMTM6能够抑制胃癌的发生发展。
HER2是属于人表皮生长因子受体家族的跨膜酪氨酸激酶受体
[17]，能够通过Ras-丝裂原活化蛋白激酶途径或磷脂酰肌醇3'-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途径调控细胞生物学功能
[18]。1项涉及多个中心的大规模研究
[19]评估了1 148例接受胃切除手术的胃癌患者中HER-2表达的预后影响，结果提示HER2过表达是胃癌患者预后不良的危险因素。1项汇总5 290例胃癌患者的荟萃分析表明，HER-2过表达与患者的OS明显相关，同时HER-2表达水平与Bormann分型、Lauren分类、肿瘤分化程度、淋巴结状态、静脉侵犯和淋巴管侵犯密切相关
[20]。在本研究中发现低表达CMTM6能够明显抑制HER-2表达水平，在低表达CMTM6后能够明显抑制HER2蛋白的稳定性，加速HER2蛋白降解。进一步实验证实CMTM6能够靶向结合HER2促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，以及抑制胃癌细胞的凋亡。
综上所述，CMTM6在胃癌组织和胃癌细胞中显著高表达，CMTM6能够靶向结合HER2，促进HER2蛋白的稳定性，进而促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，以及抑制胃癌细胞的凋亡。CMTM6可能成为胃癌的治疗靶点。
京公网安备11010202008535号
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