人脐带间充质干细胞条件培养基促进放创复合伤创面愈合及其机制

Effect and mechanism of action of human umbilical cord mesenchymal stem cell conditioned medium in promoting the healing of combined radiation and wound injury

摘要

目的 探索人脐带间充质干细胞条件培养基（human umbilical cord mesenchymal stem cell conditional medium，uMSC-CM）对放创复合伤（combined radiation and wound injury，CRWI）的促愈作用及相关机制。 方法 42只雄性C57BL小鼠被随机分成单纯创伤组、放创复合伤对照组和放创复合伤治疗组（n=14）；以4 Gy γ射线全身辐照联合直径1 cm全层皮肤缺损创面构建小鼠皮肤放创复合伤模型，放创复合伤治疗组隔天1次腹腔注射5 mg/kg uMSC-CM，其余2组注射等体积无血清DMEM培养基，采用拍照及HE染色评估创面愈合情况；CD31免疫荧光染色检测血管形成；α-SMA免疫组化染色检测细胞迁移；Masson染色检测胶原沉积；Ki67和TUNEL染色检测增殖和凋亡；Western blot检测凋亡相关蛋白和 PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平；小鼠皮肤原代成纤维细胞分为对照组、辐照组和辐照治疗组；采用Edu染色和集落形成实验检测增殖；细胞划痕和Transwell实验检测迁移；流式细胞术检测凋亡；Western blot检测PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平。 结果 uMSC-CM对CRWI创面具有明显促愈效果（P<0.05）；组织学结果提示，uMSC-CM可促进CRWI创面血管生成、细胞迁移和胶原纤维沉积，进一步分析显示uMSC-CM处理后创面细胞增殖增加且凋亡减少（P<0.05）；组织Western blot结果显示，uMSC-CM促进CRWI创面PI3K、AKT蛋白磷酸化表达水平（P<0.05）；体外细胞实验结果显示，uMSC-CM促进辐照后小鼠真皮成纤维细胞增殖和迁移并减少凋亡（P<0.05）；Western blot结果显示，uMSC-CM促进辐照后成纤维细胞PI3K、AKT蛋白磷酸化（P<0.05）。 结论 uMSC-CM加速CRWI创面愈合，这可能与激活PI3K/AKT信号通路促进成纤维细胞的增殖、迁移并抑制凋亡有关。

Abstract

Objective To investigate the effect and mechanism of action of human umbilical cord mesenchymal stem cell conditional medium（uMSC-CM） in promoting the healing of combined radiation and wound injury（CRWI）. Methods A total of 42 male C57BL mice were randomly divided into trauma group，CRWI control group，and CRWI treatment group，with 14 mice in each group. A mouse model of skin CRWI was established by whole body irradiation with 4 Gy γ-ray combined with full-thickness skin defect wound with a diameter of 1 cm. The mice in the CRWI treatment group were given intraperitoneal injection of 5 mg/kg uMSC-CM once every other day，while those in the other two groups were given injection of an equal volume of serum-free DMEM medium. Photographs and HE staining were used to assess wound healing；CD31 immunofluorescent staining was used to observe neovascularization；α-SMA immunohistochemical staining was used to observe cell migration；Masson staining was used to evaluate collagen deposition；Ki67 and TUNEL staining were used to measure proliferation and apoptosis；Western blot was used to measure the expression levels of apoptosis-related proteins and PI3K/AKT signaling pathway proteins. Primary skin fibroblasts of mice were divided into control group，irradiation group，and irradiation treatment group. Edu staining and colony formation assay were used to detect cell proliferation；cell scratch assay and Transwell assay were used to detect cell migration；flow cytometry was used to measure cell apoptosis；Western blot was used to measure the expression levels of PI3K/AKT signaling pathway proteins. Results In this study，uMSC-CM significantly promoted the healing of CRWI（P<0.05），and the histological results showed that uMSC-CM could promote angiogenesis，cell migration，and collagen fiber deposition in CRWI. Further analysis showed that uMSC-CM increased cell proliferation and reduced cell apoptosis in CRWI（P<0.05）. Western blot showed that uMSC-CM promoted the protein expression levels of phosphorylated PI3K and phosphorylated AKT（P<0.05）. In vitro cell experiments showed that uMSC-CM promoted the proliferation and migration of mouse dermal fibroblasts and reduced apoptosis after irradiation（P<0.05），and Western blot showed that uMSC-CM promoted the protein expression levels of phosphorylated PI3K and phosphorylated AKT after irradiation（P<0.05）. Conclusion This study shows that uMSC-CM accelerates CRWI wound healing，possibly by activating the PI3K/AKT signaling pathway to promote the proliferation and migration of fibroblasts and inhibit their apoptosis.

Graphical abstract

关键词

人脐带间充质干细胞 / 条件培养基 / 放创复合伤 / 创面愈合 / PI3K/AKT信号通路

Key words

human umbilical cord mesenchymal stem cell / conditioned medium / combined radiation and wound injury / wound healing / PI3K/AKT signaling pathway

辐射损伤合并创伤称为放创复合伤（combined radiation and wound injury，CRWI），多发生在临床肿瘤患者放疗后手术，也可见于核爆炸、核恐怖主义袭击、核放射源暴露等事件，其显著特点是伤口愈合延迟，甚至迁延不愈、反复溃烂，严重影响患者生活质量，目前仍缺乏有效的治疗手段^[1]。多项研究提示间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）在治疗难愈性创面中具有巨大潜力，然而，MSCs因移植效率低、恶变风险高、免疫原性强和医学伦理障碍等问题，限制其临床广泛应用^[2-4]。最近研究发现间充质干细胞条件培养基（mesenchymal stem cell conditioned medium，MSC-CM）具有与MSCs移植类似治疗效果，且极大降低了上述免疫原性、恶变风险等问题，具有较好的临床应用前景^[5]。MSC-CM的疗效通常受细胞来源、培养及提取方法、制备工艺等因素影响，因此，课题组前期自主建立了人脐带间充质干细胞条件培养基（human umbilical cord mesenchymal stem cell conditional medium,uMSC-CM）的标准化制备流程和方法，发现其可促进慢性放射性皮肤溃疡创面愈合^[6-7]。然而，uMSC-CM对CRWI创面愈合的影响尚未见相关报道，基于此，本研究通过构建CRWI小鼠皮肤模型，明确uMSC-CM对CRWI的促愈作用及潜在机制，旨在为CRWI治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物

42只雄性6~8周C57BL小鼠，体质量18~20 g，购于陆军军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK（渝）2022-0011，购入后在SPF级动物房适应性喂养1周后进行动物实验，动物实验过程严格遵循动物福利“3R”原则，实验方案通过陆军军医大学动物伦理委员会批准（批号：AMUWEC2020688）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代真皮成纤维细胞提取及培养方法

将新生乳鼠安乐死，乙醇浸泡消毒后，分离背部全层皮肤，胰酶4 ℃消化过夜，然后将皮肤真皮层组织剪碎，用1 mg/mL的胶原酶Ⅳ在37 ℃消化30 min，经无菌滤网过滤、离心机1 200 r/min离心3 min后，用DMEM完全培养基重悬，接种于培养瓶中，培养在37 ℃含5%CO₂的细胞培养箱中。

1.2.2 uMSC-CM的制备

将培养瓶中生长状态良好、四代以内、细胞密度为80%的人脐带间充质干细胞的细胞培养液更换为无血清DMEM培养基，并放入细胞培养箱中继续培养24 h，然后，收集培养瓶中的条件培养基，经超滤膜4 ℃浓缩、0.22 μm除菌滤器过滤、超低温冷冻4 h形成uMSC-CM冻干粉，最后，用DMEM培养基稀释成浓度为0.5 mg/mL、10 μg/mL分别用于动物及细胞实验。

1.2.3 主要试剂

Masson染色液（南京建成，中国）；CD31兔抗、α-SMA兔抗、Ki67兔抗、555-山羊抗兔IgG（abcam，英国）；PI3K兔抗（Affinity，中国）、P-PI3K兔抗（正能，中国）；兔二步法试剂盒（中杉金桥，中国）；TUNEL染色试剂盒（Roche，瑞士）；Edu-555细胞增殖检测试剂盒、HRP标记山羊抗兔IgG（碧云天，中国）；AKT、P-AKT兔抗（CST，美国）；GAPDH、Bax兔抗（proteintech，中国）；Bcl-2兔抗（圣克鲁斯，美国）；7-AAD、Annexin V-PE（BD，美国）。

1.2.4 动物实验分组、放创复合伤动物模型构建和处理措施

参考文献[8]方法建立模型，随机将实验小鼠分为单纯创伤组、放创复合伤对照组和放创复合伤治疗组（n=14）。单纯创伤组不辐照，其余2组给予单次4 Gy γ射线全身照射，辐照结束待小鼠麻醉后，用电动剃毛刀去掉背部毛发，在小鼠背部正中剪一直径为1 cm的全层皮肤缺损创面，随后治疗组给予腹腔注射5 mg/kg uMSC-CM，单纯创伤组、放创复合伤对照组注射等体积无血清DMEM培养基（1次/2 d），持续治疗至14 d。分别于建模后4、15 d随机安乐死7只小鼠，取背部创面皮肤及心、肝、脾、肺、肾等脏器，部分皮肤及脏器组织常规脱水、包埋后，制成4 μm病理切片，剩余组织放入-80 ℃冰箱冷冻保存以备用。

1.2.4.1 小鼠质量称量和创面愈合评价

模型构建后0、4、7、10、15 d称量小鼠质量并拍摄创面照片，用Image J软件计算创面愈合率[创面愈合率=（初始创面体积-当前创面体积）/初始创面体积×100%]。

1.2.4.2 HE染色

病理切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化，用苏木素染液染色3 min，流水冲洗后，将切片放入1%盐酸乙醇中分化10 s，然后置于60 ℃温水中返蓝1 min，接下来将切片放入伊红染液中浸染20 s，烘干透明后封片，于显微镜下采集图像。

1.2.4.3 Masson染色

病理切片经常规脱蜡复水，用浆染液滴染60 s、分色液分色6 min、复染液滴染3 min，然后将切片烘干透明后封片，于显微镜下采集图像。

1.2.4.4 免疫荧光染色

病理切片经常规脱蜡复水，柠檬酸钠抗原修复液高温修复20 min、免疫染色封闭液室温封闭10 min，4 ℃过夜孵育兔抗Ki67、兔抗CD31，接下来，室温避光孵育山羊抗兔荧光二抗1 h，最后，DAPI染色液染核、抗荧光淬灭封片液封片，于荧光显微镜下采集图像。

1.2.4.5 免疫组化染色

将常规脱蜡复水后的病理切片，放入EDTA抗原修复液中修复20 min，然后用内源性过氧化物酶阻断剂阻断过氧化物酶，及免疫染色封闭液室温封闭10 min，随后，4 ℃过夜孵育兔抗α-SMA、室温孵育HRP标记山羊抗兔IgG 1 h，接下来，用DAB显色液显色、苏木素染核，最后将切片烘干透明后封片，于显微镜下采集图像。

1.2.4.6 TUNEL染色

病理切片常规脱蜡复水后，用20 μg/mL蛋白酶K室温孵育20 min，PBS清洗后，加入适量TUNEL工作液，在37 ℃孵箱中避光孵育40 min，随后，用DAPI染色液染细胞核，最后加入抗荧光淬灭封片液封片并在荧光显微镜下采集图像。

1.2.4.7 Western blot

用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上提取总蛋白，并用BCA试剂盒进行上样蛋白定量，然后凝胶电泳分离样品并转移到PVDF膜上，随后4 ℃过夜孵育按照1∶1 000比例稀释的兔抗GAPDH、Bax、Bcl-2、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT，接下来室温条件孵育按照1∶1 000比例稀释的HRP标记的山羊抗兔二抗1 h，最后在化学发光条件下进行蛋白条带显色。

1.2.5 细胞实验分组及处理措施

小鼠原代真皮成纤维细胞分为对照组、辐照组和辐照治疗组。对照组不辐照，辐照组及辐照治疗组给予4 Gy γ射线照射，辐照结束后，辐照治疗组给予10 μg/mL的uMSC-CM。

1.2.5.1 Edu染色

各组细胞处理72 h后，向培养基中加入配好的Edu试剂，使其最终浓度为10 μmol/mL，在培养箱中继续孵育2 h，然后用4%多聚甲醛室温固定15 min、0.3% Triton X-100室温通透15 min、Click反应液室温避光孵育30 min、Hoechst室温避光孵育10 min，最后用洗涤液清洗后在荧光显微镜下采集图像。

1.2.5.2 集落形成实验

各组细胞培养至9 d，用4%多聚甲醛固定10 min，然后结晶紫室温染色10 min，随后清洗后晾干并采集图像。

1.2.5.3 细胞凋亡检测

各组细胞处理72 h后，用胰酶消化并收集细胞，每个样品加入5 μL PE和5 μL 7-AAD室温避光染色20 min，然后用流式细胞仪检测凋亡细胞比例。

1.2.5.4 细胞划痕实验

待接种于6孔板的各组细胞长满后，用200 μL枪头在6孔板上划痕，分别于0、24 h在显微镜下拍照，并用Imaje J软件计算24 h细胞的相对迁移率。

1.2.5.5 Transwell实验

将各组处理后的细胞悬液加入Transwell小室中，孵育24 h后取出，用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，PBS清洗后，于显微镜下观察并采集图像。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用t检验，3组及以上采用单因素方差分析，进一步组间多重比较采用LSD-t法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 uMSC-CM促进CRWI创面愈合

为了评估uMSC-CM对CRWI创面的促愈合作用，本研究采用如图1A所示的实验方案，在15 d的观察周期中，与单纯创伤组比较，放创复合伤对照组在各个时间点的创面愈合率均明显降低，而uMSC-CM处理明显促进CRWI的伤口愈合（F=17.470、14.410、18.320、44.500，P_{放创复合伤对照组}=0.000、0.000、0.000、0.000，P_{放创复合伤治疗组}=0.000、0.000、0.006、0.000，图1B）；接下来，通过HE染色评价创面愈合质量，结果表明，与单纯创伤组比较，放创复合伤对照组皮肤真皮和表皮成熟延迟，15 d未形成完整的皮肤结构，创面仍有较多的肉芽组织和炎性细胞浸润，而放创复合伤治疗组15 d细胞排列整齐，形成较连续的真皮和表皮，且未见明显的炎性浸润（图1C）；本研究治疗期间对放创复合伤对照组和治疗组小鼠的质量进行测量，结果显示，2组小鼠质量变化差异无统计学意义（t=0.632、0.925、0.945、0.918，P=0.539、0.373、0.364、0.377，图1D）。此外，放创复合伤对照组和治疗组的重要脏器HE染色结果无明显区别（图1E）。以上结果表明，uMSC-CM可以有效挽救辐射对伤口闭合的抑制效应，且不会造成明显的毒副作用。

2.2 uMSC-CM促进CRWI创面血管生成、细胞迁移和胶原纤维沉积

本研究通过免疫荧光染色检测了新生血管特异性标志物CD31的表达，结果显示，与单纯创伤组比较，放创复合伤对照组15 d新生血管数量减少，而uMSC-CM治疗明显增加创面新生血管的形成（F=17.020，P_{放创复合伤对照组}=0.002，P_{放创复合伤治疗组}=0.034，图2A）；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在创面修复过程中促进细胞迁移并收缩创面，结果表明，uMSC-CM治疗能明显促进α-SMA在CRWI创面中的表达（F=13.340，P_{放创复合伤对照组}=0.004，P_{放创复合伤治疗组}=0.017，图2B）；Masson染色结果显示，与单纯创伤组比较，放创复合伤对照组15 d胶原纤维数量减少，uMSC-CM处理明显增加创面胶原纤维沉积（F=24.970，P_{放创复合伤对照组}=0.001，P_{放创复合伤治疗组}=0.002，图2C）。这些结果表明，uMSC-CM可促进CRWI创面血管生成、细胞迁移和胶原纤维沉积。

2.3 uMSC-CM改善CRWI创面细胞增殖抑制并减少细胞凋亡

Ki67免疫荧光结果显示，治疗4 d，与单纯创伤组比较，放创复合伤对照组细胞增殖水平降低，而uMSC-CM能够改善CRWI创面细胞的增殖抑制（F= 20.990，P_{放创复合伤对照组}=0.001，P_{放创复合伤治疗组}=0.031）；治疗15 d，随着单纯创伤组和放创复合伤治疗组的创面修复结束，细胞增殖水平逐渐恢复到正常水平，而放创复合伤对照组由于尚未完成创面组织修复，从而出现放创复合伤对照组在15 d的细胞增殖水平高于其余两组，这进一步证实其增殖异常（F= 11.470，P_{放创复合伤对照组}=0.006，P_{放创复合伤治疗组}=0.026，图3A）。TUNEL染色结果显示，与单纯创伤组比较，放创复合伤对照组4 d和15 d细胞凋亡比例增加，而uMSC-CM治疗有效减少CRWI创面细胞凋亡（F=115.800、17.540，P_{放创复合伤对照组}=0.000、0.003，P_{放创复合伤治疗组}=0.000、0.005，图3B），此外，Westen blot结果表明，uMSC-CM可降低凋亡相关蛋白Bax的表达(F= 48.690，P_{放创复合伤对照组}=0.000，P_{放创复合伤治疗组}=0.000)，并增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平（F= 13.300，P_{放创复合伤对照组}=0.004，P_{放创复合伤治疗组}=0.047，图3C）。本研究检测了4 d各组皮肤创面组织PI3K/AKT通路蛋白表达水平，结果显示，uMSC-CM能够上调磷酸化PI3K和磷酸化AKT蛋白表达水平（F=84.410、8.812，P_{放创复合伤对照组}=0.000、0.016，P_{放创复合伤治疗组}=0.000、0.025，图3D）。这些结果表明，uMSC-CM可能通过激活PI3K/AKT信号通路，从而改善CRWI创面细胞增殖抑制并减少细胞凋亡。

2.4 uMSC-CM促进辐照后成纤维细胞增殖、迁移并抑制凋亡

根据体内实验结果，本研究通过提取小鼠原代真皮成纤维细胞作为体外实验研究对象，以进一步明确uMSC-CM对细胞增殖、迁移和凋亡的影响。Edu和集落形成实验结果表明，与对照组比较，辐照后成纤维细胞增殖水平明显降低，而uMSC-CM可以挽救辐照对细胞的增殖抑制（F=47.520、43.890，P_辐照组=0.000，0.000，P_{辐照治疗组}=0.000、0.009，图4A、B）；细胞划痕和Transwell试验结果显示，与对照组比较，辐照后成纤维细胞迁移能力明显降低，而uMSC-CM可促进辐照后成纤维细胞迁移（F=20.020、100.500，P_辐照组=0.001、0.000，P_{辐照治疗组}=0.015、0.000，图4C、D)；接下来，通过流式细胞术检测uMSC-CM对辐照后成纤维细胞凋亡的影响，如图4E结果所示，uMSC-CM可以有效降低辐照后细胞凋亡比例（F= 3671.000，P_辐照组=0.000，P_{辐照治疗组}=0.000）,最后，Western blot结果显示，uMSC-CM能够上调P-PI3K和P-AKT蛋白表达水平（F=13.440、29.610，P_辐照组=0.037、0.001，P_{辐照治疗组}=0.004、0.000，图4F）；以上结果表明，uMSC-CM促进辐照后成纤维细胞增殖和迁移，并减少凋亡，这可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。

3 讨 论

CRWI由于辐射和创伤的相互影响，使得创面愈合延迟，甚至难以闭合，多年以来人们研究了多种干预策略。然而，传统的辐射保护剂不良反应大^[9]；红光治疗尚缺乏统一、规范、标准的参数^[10]；3D生物材料生产效率低、适应证受限、安全性不高^[11]；维生素B12易引起皮肤不良反应^[12]；中药找寻、提取和分离活性成分困难^[13]；瘦素^[14]、生长因子^[15]、生长激素释放肽^[16]半衰期短，不能在体内持续、稳定发挥作用。因此，临床上迫切需要更加安全有效的治疗方案。近年来，MSC-CM作为新的无细胞疗法，因在难愈性创面突出的治疗效果越来越受到研究者的关注。

MSCs主要通过旁分泌因子介导发挥生物学效应^[17-18]，已有研究报道MSC-CM保留了亲本细胞的治疗效果，含有大量生物活性因子，同时能够最大限度地减少受体排斥反应，且满足大量生产需求，以及对储存和运输要求条件较低^[19]，此外，课题组前期研究结果表明uMSC-CM可促进慢性放射性皮肤溃疡创面愈合^[7]。因此，虽尚无uMSC-CM促进CRWI创面愈合的相关研究报道，但基于课题组前期数据，从而推测uMSM-CM在CRWI中具有治疗效果。本研究结果表明，uMSC-CM能够明显提高小鼠皮肤CRWI模型的创面愈合率和愈合质量，且不会造成明显的毒副作用。

CRWI创面难愈与辐射直接导致伤口修复过程中细胞增殖、迁移下降和凋亡增加有关，尤其是成纤维细胞增殖、迁移受抑会影响肉芽组织形成、伤口收缩、胶原纤维沉积和组织重塑^[20]。Xia WZ等^[21]研究表明，增强创面组织中成纤维细胞的增殖和迁移能力有利于小鼠皮肤创面修复。还有研究发现，MSC-CM可刺激成纤维细胞的增殖、迁移和分化为新的肌成纤维细胞，这是组织重塑所必需的^[22]。Zhang B等^[23]报道，人脐带间充质干细胞来源的外泌体可通过调节细胞增殖、迁移和凋亡，从而促进大鼠皮肤烧伤模型的伤口愈合。本研究结果表明uMSC-CM可促进胶原纤维沉积，并改善CRWI创面增殖能力降低，抑制细胞凋亡，进一步通过Edu、集落形成、细胞划痕、Transwell和细胞凋亡检测实验结果表明，uMSC-CM可促进辐照后成纤维细胞增殖、迁移及抑制凋亡。

PI3K/AKT信号通路是调节细胞增殖、迁移和凋亡的重要途径，通常由血小板衍生因子和表皮生长因子与受体酪氨酸激酶结合而启动，活化的PI3K将磷脂酰肌醇二磷酸磷酸化为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate，PIP3），AKT通过3-磷酸肌醇依赖的蛋白1和雷帕霉素靶标C2的磷酸化激活，然后与PIP3结合，磷酸化的AKT导致mTORC1激活，进而调控促增殖和迁移mRNA翻译^[24]。有研究表明，人羊膜来源的MSC-CM通过上调P-AKT蛋白水平激活PI3K/AKT通路，从而促进细胞增殖并抑制凋亡，及加速小鼠皮肤烧伤模型的伤口愈合^[25]。本研究结果表明，uMSC-CM可增加P-PI3K、P-AKT蛋白表达水平，进一步分析发现uMSC-CM可能通过激活PI3K/AKT信号通路，促进辐照后成纤维细胞增殖、迁移并抑制凋亡，从而加速CRWI创面愈合。

综上所述，uMSC-CM作为一种新的无细胞疗法在CRWI创面治疗中具有广阔的应用前景，其促愈作用可能与激活PI3K/AKT信号通路促进成纤维细胞增殖、迁移和抑制凋亡有关，但CRWI由于辐射和创伤的相互作用使得伤口愈合过程非常复杂，uMSC-CM对CRWI创面愈合的影响还可能与其他信号通路和修复细胞激活有关，这将成为下一步研究工作的重点。

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基金资助

国家自然科学基金重点资助项目(82030056)