重度爆炸冲击伤所致肾功能损伤与肾小管上皮细胞铁死亡

Renal impairment and ferroptosis of renal tubular epithelial cells due to severe blast injuries

摘要

目的：探讨重度爆炸冲击伤所致的肾功能损伤，以及与铁死亡相关的损伤机制。方法：山羊布置于距离8 kg三硝基甲苯（trinitrotoluene,TNT）当量的爆炸物中心3 m处开展爆炸致伤实验。测量爆炸冲击波物理参数，开展冲击伤病理严重度分级评分以评估伤情严重度；检测伤前及伤后1、3、6、24 h的生命体征、血气及肾功能指标，于致伤后24 h取肾脏组织进行组织切片苏木素-伊红染色、Fe²⁺含量及铁死亡相关标志蛋白胱氨酸-谷氨酸反向转运体（system Xc-transporter,xCT）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的表达变化检测，以及肾脏组织切片普鲁士蓝染色，以探查肾功能的损伤情况及肾脏组织细胞损伤的铁死亡相关机制。结果：爆炸致伤后实验山羊的冲击伤以重度为主（轻度2.8%、中度36.1%、重度47.2%、极重度13.9%），冲击伤病理严重度分级评分为2.56±0.15；与伤前相比，伤后山羊心率加快（F=12.750,P<0.01）、呼吸频率加快（F=6.500,P<0.01）、肛温下降（F=3.496,P<0.05），血氧分压降低（F=24.630,P<0.01）、血氧饱和度降低（F=18.560,P<0.01）；血尿酸升高（F=22.320,P<0.01）、血肌酐升高（F=15.350,P<0.01）、血尿素氮升高（F=22.310,P<0.01）。与对照组相比，爆炸冲击伤后24 h可见肾小管上皮细胞肿胀、管腔狭窄，肾组织Fe²⁺含量升高（t=5.933,P<0.01），肾组织GPX4蛋白相对表达量下降（t=7.924,P<0.01），肾组织xCT蛋白相对表达量下降（t=4.483,P<0.01），肾小管上皮细胞处大量铁离子沉积。结论：实验山羊布置于距离8 kg TNT当量的爆炸物中心3 m处可致重度爆炸伤冲击伤，引起缺氧、肾功能损伤及肾小管上皮细胞铁死亡的发生。

Abstract

Objective To investigate renal impairment and ferroptosis due to severe blast injuries and related mechanism. Methods The goats were placed 3 meters away from the center of an 8 kg TNT-equivalent explosive to carry out blast injury experiments. The physical parameters of blast waves were measured，and the pathological severity of blast injuries was graded and scored to assess the severity of injuries. Vital signs，blood gas parameters，and renal function markers were measured before injury and at 1，3，6，and 24 hours after injury. Renal tissue samples were collected at 24 hours after injury to prepare tissue sections，which were used to perform HE staining and measure the changes in the content of Fe²⁺ and the expression of the ferroptosis-related marker proteins xCT and GPX4 in renal tissue，and Prussian blue staining was performed for renal tissue sections to investigate the mechanism associated with renal impairment and ferroptosis of renal cells. Results Severe blast injuries accounted for the highest proportion of 47.2% in experimental goats，while mild，moderate，severe，and extremely severe injuries accounted for 2.8%，36.1%，47.2%，and 13.9%，respectively，and the pathologic severity score of blast injury was 2.56±0.15. For the goats after blast injury，there were significant increases in heart rate（F=12.750，P<0.01） and respiratory rate（F=6.500，P<0.01） and significant reductions in anal temperature（F=3.496，P<0.05），partial pressure of blood oxygen（F=24.630，P<0.01），and blood oxygen saturation（F=18.560，P<0.01），as well as significant increases in the levels of blood uric acid（F=22.320，P<0.01），serum creatinine（F=15.350，P<0.01），and blood urea nitrogen（F=22.310，P<0.01）. Compared with the control group，swelling of renal tubular epithelial cells and narrowing of tubular lumen were observed at 24 hours after blast injury，with a significant increase in the content of Fe²⁺ in renal tissue（t=5.933，P<0.01），significant reductions in the relative expression protein levels of GPX4（t=7.924，P<0.01） and xCT（t=4.483，P<0.01） in renal tissue，and deposition of a large amount of iron ions in renal tubular epithelial cells. Conclusion Experimental goats placed 3 meters away from the center of an 8 kg TNT-equivalent explosive can cause severe blast injuries，resulting in the onset of hypoxia，renal impairment，and ferroptosis of renal tubular epithelial cells.

Graphical abstract

关键词

爆炸冲击伤 / 铁死亡 / 肾损伤 / 肾小管上皮细胞

Key words

blast injury / ferroptosis / renal impairment / renal tubular epithelial cells

近年来由于国际上军事冲突及民间爆炸事件的频发，爆炸伤的发生率呈增高趋势，对军民的生命健康造成重大威胁^[1-4]。爆炸所产生的冲击波是其主要的致伤因素之一，冲击波作用于机体引起的原发性冲击伤通常呈外轻内重、发展迅速的特点，相应的诊断和治疗容易被忽视和延误，最终可导致不良的预后甚至死亡。国内外针对冲击伤的研究主要采用的实验动物为山羊、豚鼠和大鼠，其中山羊的主要组织器官大小和冲击波损伤阈值与人体接近，是实弹爆炸实验的良好动物模型^[5]。

由于冲击波主要累及含气组织器官，目前国内外针对爆炸冲击波所致肺脏、听觉器官等含气脏器的研究较多，而对肾脏等实质脏器的爆炸伤研究较少^[6-9]。尽管肾脏作为实质脏器不易受冲击波的直接影响，但肾脏作为机体供血最丰富的器官，对爆炸伤后发生的缺氧非常敏感，可能受到冲击伤后机体缺氧引起的继发性损伤^[10-14]。同时，缺氧是引发铁死亡的重要诱因，故推测铁死亡可能参与了肾冲击伤的发展^[6，15-17]。鉴此，本课题组采用山羊作为实验动物开展了实弹爆炸实验，以探讨重度爆炸冲击伤后肾功能的变化及肾脏组织铁死亡的发生情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

爆炸冲击波物理参数测试采用瑞轩GEN7T超压测试系统；山羊生命体征检测采用深圳瑞沃德RWD Life Science RM3000兽用监护仪；动脉血气指标检测采用雅培i-STAT300血气分析仪及雅培血气测试卡片；肾脏功能指标检测采用西门子Dimension RXL生化分析仪；苏木素伊红染色试剂盒（货号：G1120）、普鲁士蓝染色试剂盒（货号：G1422）购自北京索莱宝科技有限公司；胱氨酸-谷氨酸反向转运体（system Xc- transporter，xCT）一抗（货号：AB175186）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）一抗（货号：AB125066）、β-actin一抗（货号：AB8266）、鼠二抗（货号：AB6789）、兔二抗（货号：AB150077）购自英国Abcam公司；铁离子检测试剂盒Iron Assay Kit-colorimetric（货号：I291）购自东仁化学科技有限公司。

1.2 实验动物、实验场地及爆炸物

本实验动物共采用54只品系相同、年龄和性别不拘、体质量27.5~42.0 kg的重庆地区山羊，其中18只作为对照组不进行爆炸致伤，另外36只作为致伤组进行爆炸致伤。实验所采用的山羊购自陆军特色医学中心实验动物中心，本研究经陆军军医大学动物福利伦理审查委员会批准（批准号：AMUWEC20223572）。实验场地位于重庆某开阔地，海拔约300 m，气温25 ℃，风力2级，湿度42%。爆炸物采用8 kg三硝基甲苯（trinitrotoluene，TNT）当量的去弹壳的某型炸弹，固定于距离地面1.2 m高的木凳上。

1.3 方法

1.3.1 爆炸伤后山羊的损伤严重度评估

冲击波主要因其超压峰值、正压持续时间和冲量不同而对生物目标造成不同严重程度的冲击伤^[18-22]。为探索构建山羊重度爆炸冲击伤模型的最佳布置距离，本课题组开展了2次爆炸预实验，在距离8 kg TNT当量爆炸物中心2.5、3、4、5 m和6 m处分别布置传感器测量爆炸时冲击波超压峰值、正压持续时间，并计算冲量（图1）。根据以往的研究，当冲量为232.8 Pa·s时，重度冲击伤的发生率约为50%^[18-19]。故要使伤情以重度为主，冲量宜大于232.8 Pa·s，且不因冲量过大而造成大量实验动物死亡。根据预实验测量结果，距离爆心3 m处最满足这一条件（表1）。鉴此，将致伤组36只山羊采用站姿右侧朝向爆心固定的方式，分4次布置于距离爆心3 m处的重庆地区开阔地进行爆炸致伤，并于爆炸时测量该处冲击波物理参数，对照组18只山羊布置于距离爆炸场地100 m外。由于肺是冲击伤的主要靶器官，本研究通过对肺冲击伤的损伤评估以反映机体的冲击伤严重度^[23]。爆炸伤后24 h，将所有山羊进行解剖，并根据肺冲击伤病理严重度分级评分标准（pathologic severity scale of lung blast injury，PSSLBI）来评估山羊的冲击伤严重度^[24]。

1.3.2 爆炸致伤后生命体征检测、动脉血气检测

于爆炸致伤前和伤后1、3、6、24 h对致伤组山羊的生命体征检测、动脉血气及血液酸碱度指标进行检测。生命体征指标包括山羊的肛温（rectal temperatures，TR）、呼吸频率（respiration rate，RR）、心率（heart rate，HR）和平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）进行检测。采集股动脉血进行血气指标和血液酸碱度指标检测，包括氧分压（partial pressure of oxygen，PaO₂）、二氧化碳分压（partial pressure of carbon dioxide，PaCO₂）、氧饱和度（oxygen saturation，SaO₂）。

1.3.3 肾脏的功能和结构损伤检查

于爆炸致伤前和伤后1、3、6、24 h采集致伤组山羊颈静脉血进行肾功能指标检测，包括肌酐（creatinine，Cr）、尿素（Urea）、尿酸（uric acid，UA）。采集对照组及致伤组伤后24 h的山羊肾脏组织块立即置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h后，制作成石蜡切片并进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法以观察肾脏组织细胞的损伤情况。

1.3.4 肾脏组织铁离子沉积及铁死亡标志物检测

采集对照组及致伤组伤后24 h的山羊肾脏组织，采用铁离子检测试剂盒检测每100 mg肾脏组织中的Fe²⁺含量，蛋白免疫印迹技术（Western blot，WB）检测肾脏组织铁死亡相关蛋白GPX4和xCT的表达情况，普鲁士蓝染色观察肾脏组织切片铁离子沉积情况，以探查肾脏组织铁死亡的发生情况^[17，25]。

1.4 统计学方法

采用Graphpad Prism 9.5软件进行统计学分析，采用Shapiro-Wilk法对数据进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，其两两比较采用Dunnett’s检验，所有检验为双侧，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 距离8 kg TNT当量爆炸物中心3 m处布置山羊可致重度爆炸冲击伤

在爆炸预实验中，发现距离8 kg TNT当量爆炸物中心3 m处的爆炸冲击波适于构建重度爆炸伤模型（表1）。随后本课题组开展4次爆炸致伤山羊的实验，测得距离8 kg TNT当量爆炸物中心3 m处的冲击波超压峰值为（313±15） kPa，正压持续时间为（3.1±0.5） ms，冲量为（299±12） Pa·s。致伤组36只实验山羊中，轻度1例（2.8%）、中度13例（36.1%）、重度17例（47.2%）、极重度5例（13.9%），其中共有10只山羊在伤后24 h内死亡，死亡率为27.8%；爆炸伤后山羊的PSSLBI评分为（2.56±0.15）分。以上结果提示本次实验中距离8 kg TNT当量爆炸物中心3 m处布置山羊进行爆炸致伤造成的冲击伤以重度为主。

2.2 爆炸冲击伤后发生呼吸循环损伤和缺氧

生命体征监测显示：与伤前相比，心率和呼吸频率均在伤后3 h呈上升趋势，随后开始下降。伤后1 h至6 h心率与伤前相比差异有统计学意义（F=12.750，P<0.01），伤后1 h至6 h呼吸频率与伤前相比差异有统计学意义（F=6.500，P<0.01），伤前和伤后各时相点的心率和呼吸频率变化见图2A和2B；肛温和平均动脉压均在3 h内呈下降趋势，随后开始上升。伤后3 h肛温和伤前相比差异有统计学意义（F=3.496，P<0.05），伤后各时相点平均动脉压与伤前相比差异无统计学意义（F=0.504，P>0.05），伤前和伤后各时相点的肛温和平均动脉压变化见图2C和2D。动脉血气检测结果显示：PaO₂和SaO₂在伤后1 h内降低，随后逐渐升高。伤后1 h至24 h PaO₂与伤前相比差异有统计学意义（F=24.630，P<0.01），伤后1 h至3 h SaO₂与伤前相比差异有统计学意义（F=18.560，P<0.01），PaCO₂在伤后各时相点差异与伤前相比均无统计学意义（F=1.700，P>0.05），伤前和伤后各时相点的PaO₂、PaCO₂、SaO₂变化见图2E、2F和2G。以上结果提示重度爆炸冲击伤后呼吸循环受损并发生了缺氧。

2.3 重度爆炸冲击伤后肾功能损伤

静脉血液生化指标检测结果显示：与伤前相比，肾功能指标UA、Cr在伤后3 h内升高，随后开始下降，Urea在伤后24 h均呈升高趋势。伤后1 h至6 h UA与伤前相比差异有统计学意义（F=22.320，P<0.01），伤后3 h至6 h Cr与伤前相比差异有统计学意义（F=15.350，P<0.01），伤后3 h至24 h Urea与伤前相比差异有统计学意义（F=22.310，P<0.01），伤前和伤后各时相点的肾功能指标UA、Cr、Urea变化见图3。以上结果提示重度爆炸冲击伤后发生肾功能受损。

2.4 重度爆炸冲击伤后肾小管上皮结构损伤

病理组织切片HE染色可见相比于对照组，伤后24 h致伤组山羊肾组织主要镜下变化包括：肾小管上皮细胞肿胀、管腔狭窄（图4）。以上结果提示重度爆炸冲击伤后肾小管上皮结构损伤。

2.5 重度爆炸冲击伤后肾小管上皮细胞发生了铁死亡

肾脏组织Fe²⁺含量检测发现致伤组每克组织中Fe²⁺含量高于对照组，差异有统计学意义（t=5.933，P<0.01）（图5A）；肾脏组织WB检测发现伤后24 h致伤组xCT相对表达量低于对照组，差异有统计学意义（t=4.483，P<0.01），伤后24 h致伤组GPX4相对表达量低于对照组，差异有统计学意义（t=7.924，P<0.01），xCT及GPX4相对于内参β-actin的蛋白表达变化情况见图5B、5C和5D；肾脏组织切片普鲁士蓝染色可见相比于对照组，伤后24 h致伤组肾小管上皮细胞处可见大量含铁血黄素沉积（图5E、F）。以上结果提示重度爆炸冲击伤后肾小管上皮细胞发生了铁死亡。

3 讨 论

以往的研究表明，爆炸冲击波可通过内爆效应、碎裂效应和惯性作用等物理损伤机理直接损伤肺脏等含气组织器官，从而造成机体呼吸循环功能的损伤和缺氧，进而引起多种组织器官的继发损伤。而肾脏因为有丰富的血流量，对缺氧十分敏感，容易受到爆炸冲击波引发的缺氧等继发性因素损伤。目前国内外对冲击伤后肾脏损伤特点的研究已发现冲击伤后肾脏损伤可呈进展性发展趋势，并可最终引起急性肾损伤甚至急性肾衰竭，但爆炸冲击波引起的肾脏损伤的具体机制仍需进一步明确^[26-28]。因此，进一步探讨爆炸冲击波对肾脏的功能结构的损伤特点及损伤机制对伤后并发症防治有重要的意义。

由于实弹爆炸实验中收集准确的实验参数并在试验场地对动物进行早期功能检查非常困难，以及大量地使用大型动物会导致可控性降低、稳定性差、成本增加和危险性增加等问题，近年来对冲击伤所致的组织器官损伤的研究多以雷管等小当量爆炸物或生物激波管等作为冲击波激发装置，并主要采用大鼠、小鼠、兔子等小动物实验模型开展冲击伤研究。这类实验模型产生的冲击波的强度往往较低，造成的冲击伤伤情较轻，且由于小型实验动物的冲击伤损伤阈值和人体差异较大，故研究结果往往难以较好地反映军事冲突和民间爆炸事件中冲击波对人体造成的损伤^[29-30]。此外，由于含气脏器的冲击伤损伤阈值较低，轻度的冲击伤主要损伤含气组织器官，而重度的冲击伤可使伤情迅速加重并可累及肾脏等实质脏器，给临床救治工作带来很大困难^[30-31]。因此，研究重度爆炸伤后肾脏的损伤特点和机理对危重症爆炸伤员的临床救治有重要意义。为解决小当量爆炸实验室模型和小动物冲击伤实验的不足之处，本课题组研究依托兵器工业部门及军队后勤科研重大项目的支持，构建了重度冲击伤实弹爆炸致伤模型。通过研究明确了重度爆炸冲击伤后肾功能的损伤及缺氧的发生，并基于缺氧的损伤机理来进一步探讨冲击伤后肾脏组织细胞铁死亡的发生情况。

本研究中显示：重度爆炸伤后血氧含量在1 h内迅速下降，生命体征指标在3 h内恶化，表现为心率和呼吸频率加快、肛温和平均动脉下降，随后仍存活的山羊呈恢复趋势。肾功能指标UA、Cr在3 h内升高，随后呈恢复趋势，而Urea则持续升高。这可能是因为UA、Cr产生来源相对单一，主要受肾功能损伤影响，爆炸伤3 h后肾功能开始呈现一定的恢复趋势。而Urea的产生来源较多，由于重度冲击波对机体整体的创伤作用，使得机体持续呈高分解状态，故Urea在伤后24 h内呈持续升高的趋势。研究结果提示伤后1 h内是纠正缺氧的关键时期，伤后3 h内是开展生命支持和救治肾脏滤过功能下降的关键时期，这也提示了缺氧之后的继发性损伤可能与肾脏滤过功能的损伤和生命体征的明显改变有重要关联。通过进一步的研究证实了重度爆炸冲击伤后肾小管上皮细胞发生了铁死亡，而肾小管是维持肾脏滤过功能的重要结构，提示肾小管滤过功能下降可能与铁死亡的发生有关。本研究结果或可为明确爆炸冲击伤后生命体征受损、缺氧和肾脏滤过功能下降的紧急救治时限提供支撑，并为进一步探究爆炸冲击伤后肾脏的损伤机制提供支持。

本研究仍然有一些尚未明确的问题：当前的实验结果尚不能证实肾小管上皮细胞铁死亡的发生和肾功能损伤是否主要由重度爆炸冲击伤后发生的缺氧所致，以及铁死亡是否通过损伤肾小管上皮细胞来影响肾脏滤过功能，本课题组将在后续的研究工作中对具体的损伤机制开展进一步研究。

综上所述，重度爆炸冲击伤可造成呼吸循环功能损伤和缺氧，并引起肾功能的损伤及肾小管上皮细胞铁死亡的发生。伤后1 h内是纠正缺氧的关键时期，伤后3 h内是开展生命支持和救治肾脏滤过功能下降的关键时期。

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基金资助

后勤科研重大资助项目(ALJ18J001)