淫羊藿苷通过miR-29c/COL2A1轴改善骨关节炎软骨细胞功能

摘要

目的：探讨淫羊藿苷（icariin,ICA）对骨关节炎（osteoarthritis,OA）软骨细胞功能的影响及其机制。方法：用不同浓度（0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μmol/L）ICA处理软骨细胞后，采用噻唑蓝（methylthiazolydiphenyl-tetrazolium,MTT）法检测软骨细胞活力，选择最适浓度的ICA进行后续实验。利用白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β;10 ng/mL)刺激软骨细胞24 h构建OA细胞模型，用最适浓度1μmol/L ICA处理细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测微小RNA-29c(microRNA-29c,miR-29c)的表达水平，蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测Ⅱ型胶原α1链（collagen typeⅡalpha 1 chain,COL2A1）蛋白的表达水平，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP-3)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平，流式细胞术检测细胞凋亡水平。生物信息学网站预测miR-29c的靶基因，采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-29c与COL2A1之间的靶向结合作用。通过挽救实验阐明ICA对OA炎症反应及细胞凋亡的影响及作用机制。结果：与Control组相比，IL-1β组软骨细胞上清液中MMP-3(P<0.001)和TNF-α(P<0.001)含量明显增加，COL2A1的表达水平明显降低（P<0.001），细胞凋亡率明显增加（P<0.001）；与IL-1β组相比，ICA处理组中软骨细胞上清液中MMP-3(P=0.001、P<0.001)和TNF-α(P<0.001、P<0.001)含量明显减少，COL2A1的表达水平明显升高（P<0.001、P<0.001），细胞凋亡率明显降低（P<0.001、P<0.001）。与Control组相比，IL-1β组软骨细胞中miR-29c表达水平明显上调（P<0.001），而ICA处理则明显降低miR-29c表达水平（P<0.001）。与miR-NC组相比，miR-29c mimic组中软骨细胞上清液中MMP-3(P<0.001)和TNF-α(P<0.001)含量明显增加，COL2A1的表达水平显著降低（P=0.001），细胞凋亡率显著增加（P<0.001），而miR-29c inhibitor组则得到相反的结果。TargetScan7.1数据库显示miR-29c与COL2A1存在结合位点。双荧光素酶报告基因实验表明，miR-29c mimic明显抑制了野生型COL2A1载体的荧光素酶活性（P<0.001），而突变型的荧光素酶活性不受影响（P=0.152）。敲低COL2A1可部分逆转下调miR-29c对软骨细胞中MMP-3(P<0.001)和TNF-α(P<0.001)分泌量，COL2A1蛋白表达水平（P<0.001）以及细胞凋亡率（P<0.001）的影响。ICA处理可减轻过表达miR-29c对软骨细胞中MMP-3(P<0.001)和TNF-α(P<0.001)分泌量、COL2A1蛋白表达水平（P=0.009）以及细胞凋亡率（P<0.001）的影响。结论：ICA能减轻IL-1β诱导的软骨细胞炎症因子的分泌和细胞凋亡的发生，其作用机制可能与miR-29c/COL2A1轴有关。

关键词

骨关节炎 / 淫羊藿苷 / 微小RNA-29c / Ⅱ型胶原α1链 / 细胞凋亡