在现代医学研究中，骨折愈合的复杂性和骨不连的挑战性一直是骨科领域的热点问题。当骨折愈合过程因固定不当、手术干预失败、生物反应不足或感染而失败时会严重延迟愈合周期。5%~10%的骨折会导致延迟愈合或不愈合
[1]，这2种情况都需要重复治疗，并对生活质量产生重大影响，其给医疗系统带来的经济负担远远超越骨折本身。随着再生医学的兴起，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其独特的自我更新能力和多向分化潜能，成为促进骨修复和再生的有力工具
[2]。MSCs在骨不连治疗中的应用，不仅涉及到其直接成骨分化的能力，还包括其通过分泌多种生物活性因子而发挥的调节作用
[3]，这些因子能够促进血管生成、抑制炎症反应，以及调控细胞外基质的重建，共同促进损伤部位的骨组织修复。本文旨在综合分析MSCs在骨不连治疗中的最新研究进展，探讨其作用机制、治疗策略，以及MSCs递送系统的最新发展。首先回顾了MSCs在骨不连治疗中的核心作用，包括其成骨分化潜能和通过多种信号通路调控的复杂网络。接着，讨论了MSCs的来源选择、扩增与制备方法，以及干预方式和剂量的优化。此外，还探讨了生物材料在MSCs递送中的重要性，以及“启动”MSCs和MSCs分泌体在治疗中的潜在应用。尽管MSCs治疗的安全性和有效性已得到初步证实，但现有研究的异质性限制了对MSCs治疗最佳实践的确定。因此，本文为MSCs在骨不连治疗中的应用提供了全面的科学依据，以期推动MSCs治疗策略的优化和临床转化，改善骨不连患者的治疗效果和生活质量。
1 MSCs在骨不连治疗中的作用机制
MSCs在骨不连治疗中的核心作用体现在其成骨分化潜能。这些干细胞能在特定条件下表达骨特异性蛋白，如碱性磷酸酶、骨钙素和I型胶原，标志着它们向成熟骨细胞分化。Wnt/β-catenin信号通路在调控MSCs成骨分化中扮演着核心角色，通过稳定β-catenin并促进其入核，与TCF/LEF转录因子结合，激活如Osterix、DKx-5和Runx2等成骨相关基因的表达
[4]。此外，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路，尤其是BMP9，是已知诱导MSCs成骨分化能力最强的信号分子之一，通过激活Smad信号通路促进成骨相关基因的表达
[5]。Notch信号通路通过DLL1等配体与受体结合，影响下游基因表达，调控MSCs的成骨分化，并可能促进BMP9诱导的MSCs成骨分化。还有研究表明，Hedgehog信号通路通过调控Gli家族转录因子的活性，影响MSCs的成骨分化，在成骨分化的早期阶段起促进作用，而在后期可能抑制成骨
[6]。miRNA在MSCs成骨分化中也扮演重要角色，例如miRNA-433-3p通过减少Wnt信号通路的拮抗物DKK1的表达促进成骨细胞形成，而miRNA-450b和miRNA-224分别通过靶向BMP-3和Rac1促进hADSCs和MSCs的成骨分化
[4]。MAPK信号通路，包括ERK、JNK和p38通路，参与成骨细胞分化增殖的信号转导，其中ERK通路在ECM诱导的MSCs成骨分化中起驱动作用，通过磷酸化Runx2/Cbfa-1促进成骨基因的表达及钙离子的沉积
[7]。这些信号通路之间存在复杂的交互作用，共同构成了1个调控网络，影响MSCs的成骨分化，例如Wnt/β-catenin信号通路与Hedgehog信号通路在成骨分化的不同阶段可能具有协同或拮抗作用
[8]。近期有研究表明，在骨折愈合过程中，MSCs迁移至损伤部位，与细胞外基质相互作用，并分化为成骨细胞，直接参与新骨基质的形成，从而加速愈合
[9]。并且有研究发现其通过激活BMP-2/Smad1/RUNX2信号通路在成骨诱导中发挥作用。这一信号通路在促进非愈合性骨折愈合中起着重要作用
[1]。
MSCs通过分泌生长因子和细胞因子，如转化生长因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF），在骨愈合中发挥调控作用
[10-12]。这些因子不仅促进血管生成和细胞募集，还支持细胞增殖和分化，共同营造有利于骨组织修复的微环境。有研究表明，TGF-β家族成员，尤其是TGF-β1，在骨愈合中起着核心作用
[13]。它们通过与TβRI结合，使Smad 2/3磷酸化并与Smad 4结合，从而改变MSCs的迁移能力。在Tgfb1基因敲除的小鼠中，MSCs向骨小梁表面迁移能力下降，成骨细胞数目减少，骨形成能力降低。VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，能促进血管新生，这对于骨愈合过程中新生血管的生成至关重要。VEGF通过刺激血管新生，为骨愈合提供必要的营养和氧气供应
[14]。FGF家族成员，如bFGF，能刺激细胞的DNA合成增强，促进细胞的分裂与增殖，从而参与骨愈合过程中的细胞增殖和组织修复
[14]。PDGF通过调节巨噬细胞凋亡，促进平滑肌细胞增殖，从而促进血管新生。PDGF-AA能反馈性下调PDGFα，促进BMPR Ⅰ~Ⅱ复合物形成，激活BMP-Smad 1/5/8信号通路，分别通过Twist1/Atf4轴和Runx2/Osx轴促进MSCs迁移和成骨分化
[15]。
此外，MSCs的免疫调节功能在减轻炎症反应和抑制免疫排斥中至关重要
[16]。它们分泌的抗炎因子，如白细胞介素-10（interleukin，IL-10），有助于调节炎症微环境，同时对T细胞和B细胞增殖的抑制作用减少了移植后的免疫反应
[17]，为MSCs治疗提供了友好环境。MSCs通过上调细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）来抑制幼稚和记忆T细胞与抗原呈递细胞的通讯，这些分子是T细胞活化和白细胞募集到炎症部位的关键
[18]。MSCs与其他细胞类型的相互作用也是其间接作用的重要组成部分
[19]。这些相互作用通过旁分泌信号促进细胞间的协同效应，共同推动骨缺损区域的修复。
2 治疗策略
2.1 MSCs来源
在骨不连治疗中，选择适宜的MSCs来源对疗效至关重要。MSCs可从多种组织获取，包括骨髓、脂肪组织、滑膜、外周血、脐带和胎盘，各具特点及限制。自体MSCs因无疾病传播风险、患者接受度高和安全性而成为首选，但获取过程复杂，受患者健康状况影响，如骨髓MSCs（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可能导致供体损伤，脂肪MSCs可能引起供区并发症
[20]。自体MSCs活性亦受年龄和健康状况影响，尤其是心血管疾病。同种异体MSCs多为商业化产品，使用方便、经济，虽具免疫原逃避能力，但非免疫豁免，需警惕免疫反应
[21]。滑膜来源MSCs在软骨再生中表现良好，外周血MSCs获取损伤小但效率低，围生期组织MSCs活性高但存在疾病传播风险
[21]。综合细胞特性、患者状况和治疗需求，年轻无基础疾病患者可能更适合自体MSCs，而老年或系统性疾病患者可能更适宜同种异体MSCs，血液系统疾病患者应避免从骨髓或外周血提取MSCs。目前临床常在术前1 d进行骨髓间充质干细胞采集工作，局麻醉后，使用骨穿刺针髂前上棘处定位穿刺，根据缺损部位大小抽取一定量的骨髓血，将骨髓血无菌保存后通过原位组织再生医疗技术进行分离浓缩
[22]。
2.2 MSCs扩增与制备方法
近期的研究进展显示，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）分化而来的iPSC-MSCs在增殖能力、免疫调节能力和生物学效率方面展现出比传统组织来源MSCs更优越的特性
[23]。这一发现为解决组织来源MSCs体外扩增能力有限及临床不稳定性的挑战提供了新的方向。iPSC-MSCs的制备方法、在疾病模型中的应用以及临床相关产品的最新进展，已成为再生医学领域的研究热点。在细胞培养方面，传统的二维培养是MSCs体外扩增的标准技术，但存在局限性，如缺乏组织特异性结构和细胞间相互作用。三维培养方式，如生物反应器、超低吸附表面、悬滴培养或支架培养，可以更好地维持MSCs的干性
[24]。三维培养增强了细胞间和细胞与细胞外基质的相互作用，更接近自然组织微环境。微载体技术在MSCs的大规模扩增中发挥重要作用。有研究报道了1种新型多孔可降解的微载体片剂，配合全自动化生物反应器，为工业化大规模生产人源MSCs提供了可行的解决方案
[25]。间歇搅拌模式这种技术的应用适合细胞贴附微载体速率较慢或接种密度较低的情况，已被广泛应用于MSCs培养。在MSCs的制备方法方面，目前国内外常用的方法包括贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法。贴壁筛选法是基于MSCs的塑料黏附特性，排除无法附着于塑料表面的造血干细胞及造血细胞，并通过使用胰酶消化作用去除成纤维细胞等非干细胞杂质
[26]。这种方法可以更好地保护细胞活力，并且操作全程不会对细胞活性造成损伤，同时具有快速、简单、经济的特点，因此在实验室及临床上广泛应用
[27]。密度梯度离心法则通过使用低黏度和低渗透压的密度梯度溶液，根据MSCs与其他细胞密度的差异，从而将其分离出来
[28]。这种方法在进行离心分层的过程中，可以观察到红细胞及其他成熟细胞会以>1.080 g/dL的比例沉降于底部，而BMSCs、造血干细胞、单核细胞等会保持在密度为1.053~1.073 g/dL的血浆溶液中，直到离心过程结束
[29]。细胞表面标志物分选法包括流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法。流式细胞仪分选法利用MSCs细胞体积及其表达标志物的特征，将其从混合物中分离出来
[30]。免疫磁珠分离法则是根据MSCs表面抗原的存在或缺失进行正选或负选，通过包被抗体的磁珠从而获得相对纯化的MSCs
[30]。尽管贴壁筛选法因其简单、经济而在实验室及临床上广泛应用，但MSCs的分离纯化和培养扩增至今仍缺乏统一的标准。此外，长时间高速离心导致细胞活力降低，且密度梯度离心法操作技术难度大，推广困难；而流式细胞仪分选法和免疫磁珠法对实验条件要求高，费用昂贵，即使能短时间内培养出高纯度的MSCs，性价比低，临床上应用不多
[27]。肽移植微球技术开发了一种独特的磁选微球，以经济有效的方式获得相对纯净、高产的MSCs，也可用于MSCs的扩增。为了优化MSCs的培养条件，研究人员不断改良培养基成分或尝试无血清培养，以提高细胞培养的效率和质量。新型培养基的配制，如使用蛋氨酸脑啡肽代替传统配方中的谷氨酰胺，能够明显改善MSCs的生长。
2.3 干预方式及剂量
治疗策略需综合考虑细胞剂量、干预方式及与骨不连的外科常规干预措施相结合。MSCs的干预方式可分为局部给药与全身给药，研究表明，对于某些适应证，选择局部给药方式可以获得更好的药效。例如，在急性脑卒中模型中，动脉注入MSCs增强了其定植脑损伤部位的能力。在关节炎治疗中，关节腔内给药可提高MSCs的生物利用度和靶向定位。近期的临床研究强调了MSCs治疗的个体化和精准化，包括患者特定MSCs的分离、扩增及通过微创手术技术进行的精确植入。例如，微创植骨治疗中，通过C臂X线定位和套筒技术，可以直接对骨折断端进行清理和MSCs混合植骨材料的植入
[31]，这种方法减少了手术创伤并加速了愈合过程。其中细胞剂量多在（20~50）×10
6，混悬剂通常选用生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或细胞培养基。在近期1项Ⅰ/Ⅱ期剂量探索试验中
[32]，研究者分析了脐带MSCs（umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs）治疗多发性硬化症的剂量和临床效果。该试验显示，所有患者都能耐受UC-MSCs疗法，没有出现严重不良事件，治疗后6个月，2个剂量组的残疾量表和健康状况均明显改善。研究中A组接受2剂，每剂共150×10
6个UC-MSCs，分为2次注射（50×10
6通过静脉内给药，100×10
6通过鞘内注射），1个月后再次给药；B组仅接受1剂，共150×10
6个UC-MSCs，采用A组相同的方式给药。结果显示，低剂量组病情改善有限，而中高剂量组症状明显缓解，特别是在运动功能和疲劳感方面。这表明剂量与治疗效果之间呈正相关，且多次治疗比单次治疗更有益。此外多项临床研究表明，关节腔内注射MSCs可以明显改善膝骨关节炎患者的功能和减轻疼痛。不同来源的MSCs治疗对组织再生有积极影响，其中脐带血和BMSCs表现出更好的治疗效果。与单独使用透明质酸相比，MSCs组有更好的功能改善和MRI鉴定的软骨质量改善
[33]。因此，对于剂量与治疗效果的关系，研究结果并不一致
[2]。有研究指出治疗效果与细胞数量的增多无明显相关性，且高浓度细胞悬液可能引起更多不良反应
[34]。在同种异体MSCs治疗中，低剂量组往往获得更好的疼痛缓解和软骨修复效果，而高剂量组可能会遇到更多的不良反应
[34]。
3 MSCs递送
3.1 生物材料
在骨不连治疗中，生物材料的研究对于MSCs递送至关重要。这些材料不仅提供支架支持MSCs的黏附和存活，还保留其分泌的功能性成分，延长治疗效果。然而，植入生物材料可能引发免疫反应，导致纤维化和失败
[35]。为改善此问题，研究人员开发了多种适合MSCs的生物材料。小分子封装微粒（small molecule encapsulated microparticles，MPs）是一种可生物降解材料
[36]，能够延长MSCs产品的持续时间，且可根据组成和释放能力进行调整。在组织修复过程中，去细胞化基质和合成聚合物为MSCs运输提供了新途径，以多种形式存在，具有批次间一致性，但可能影响MSCs功能
[37]。遗传修饰的MSCs在特定模型中显示出促进骨再生的潜力，如大鼠颅骨缺损模型中水凝胶中MSCs与负压治疗的联合应用
[38]。MSCs常与骨支架材料结合，促进骨基质形成。例如，超临界二氧化碳脱细胞骨基质是增强MSCs附着和募集的有效支架
[20]。Masquelet技术通过诱导膜形成，为MSCs提供富含生物活性因子的环境，在感染性骨不连治疗中显示出高愈合率和低并发症发生率
[39]。动物实验表明，MSCs的直接注射或与生物材料如脱钙骨基质和多孔生物陶瓷的结合使用，可促进骨不连区域的愈合
[2]。
3.2 “启动”MSCs
为了增强MSCs的功能并满足临床需求，研究者提出了“启动”或预处理MSCs的策略，这在免疫学和干细胞领域已有应用。通过使用小分子、缺氧条件或生物材料对MSCs进行“启动”，可以增强其成骨能力、存活率和治疗效果
[40]。例如，“启动”MSC可以通过体外3D培养技术来实现
[41]，以更紧密地概括体内MSC生态位。由此产生的球状结构提供了细胞组织空间，增加了细胞间相互作用，稳定甚至增强了表型表达谱，并增加了营养和免疫调节功能。在这种情况下，MSC 3D球状体在体内移植时显示出增强的“药物信号”活性，并提高了归巢和存活能力。体外研究表明，血小板产物对MSCs的生物生理功能具有多方面的“启动作用”。血小板产物已被证明可以改善MSCs的增殖、迁移、成骨分化、对凋亡应激的反应以及免疫调节、促血管生成和促炎能力
[42]。随后富含血小板血浆载体的骨髓间充质干细胞对上颌骨快速扩张后骨形成影响的动物实验研究发现
[43]，注射骨髓来源的间充质干细胞+富含血小板血浆载体可明显增加骨缝骨密度，而单独注射骨髓来源的间充质干细胞或富含血小板血浆载体对骨缝骨密度无影响。在骨不连治疗中，相似的“启动”策略可能通过促进MSCs的成骨分化来提高疗效。
3.3 MSCs分泌体
在医学研究领域，MSCs的旁分泌能力已受到广泛关注。MSCs的旁分泌体是其发挥治疗作用的关键因素之一，这些旁分泌体包括生长因子、细胞因子、趋化因子及细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。EVs进一步细分为微囊泡（microvesicles，MVs；直径100~1 000 nm）和外泌体（exosomes，直径40~150 nm）
[44]。这些分泌体不仅携带了MSCs的多种治疗性蛋白，而且EVs本身已被证实具有与MSCs相似甚至更优的治疗特性
[45]。先前的研究表明，MSCs的治疗效率很大程度上是通过旁分泌效应介导的，其中EVs作为关键的旁分泌因子，通过其双层膜结构传递生物活性分子
[46]。EVs的类脂质体结构不仅反映了亲本细胞的生物物理特性，还使得EVs在体内的稳定性超越了其他外来颗粒
[47]。此外，EVs的内容物和表面特性的相对易修改性，为增强其治疗潜力或作为药物递送系统提供了广阔前景。例如，有研究证明来自骨髓间充质干细胞的外泌体在骨不愈合大鼠模型中通过促进骨生成和血管生成增强骨折愈合
[48]。
4 结语
为了精确评估MSCs在骨科疾病治疗中的效果，本文参考国际细胞治疗学会（International Society for Cellular Therapy，ISCT）的标准，总结通过至少1种表型标记（CD 73、CD 90和CD 105）验证MSCs的研究
[49]。然而，由于现有研究中患者群体、病理严重程度、治疗过程、对照组设置、结果测量和研究时长的差异，未能为MSCs单独治疗或确定适宜剂量提供证据。这些差异限制了对研究结果的汇总和比较。许多研究未能适当控制影响结果的病理特异性因素，如在骨折不愈合研究中未控制吸烟习惯等。因此，现有证据不足以指导患者选择MSC的来源、制备方法、剂量、疗效或疗效持续时间。此外，由于只有极少研究使用了异体MSCs，无法进行异体与自体MSCs的比较，但未来比较两者的安全性和有效性将是有意义的，因为异体MSCs可能减少额外的手术及操作（提取、制备等）。尽管如此，大多数研究详细记录了不良事件及其与MSC治疗的潜在联系，显示MSCs在多种病理中的使用总体上是安全的，不良事件的总体发生率较低，且大多数是轻微的，如疼痛、肿胀和渗出。但是值得注意的是治疗四肢骨折术后骨不连时，采用BMSCs结合自体骨植骨的方法具有明显优势：首先，自体BMSCs经过提取、分离、提纯、培养及浓缩等一系列处理后，与自体髂骨一同植入骨不连部位，理论上能够加速骨折愈合并提高愈合率。其次，自体BMSCs的取材过程简便，且由于使用的是患者自身的细胞，不存在伦理问题和免疫排异风险。并且结合这2种治疗方法可以有效治疗骨不连，从而减轻患者的经济负担。这一综合治疗方案提高了治疗效率，也考虑到了患者的实际经济状况，体现了医疗的人本关怀。
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