泛素化和去泛素化在多发性硬化发病机制中的作用

The role of ubiquitination and deubiquitination in the pathogenesis of multiple sclerosis

摘要

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种慢性、免疫介导的中枢神经系统（central nervous system，CNS）炎症性脱髓鞘疾病，其发病原因尚不明确，仍是具有挑战性和致残性的疾病，因而会对家庭和社会造成极大的负担。现在越来越多研究表明，泛素化和去泛素化在MS神经炎症反应、免疫功能调节、髓鞘形成和修复中起着关键作用。泛素化和去泛素化是重要的蛋白质翻译后修饰方式，泛素化是泛素分子对靶蛋白进行特异性修饰的过程，不仅调节蛋白质的降解，还调控蛋白质的功能和定位；去泛素化是泛素分子从靶蛋白上移除的过程，对泛素化有着平衡作用。二者之间的动态平衡在MS发病中发挥着重要作用。本文将结合最新的研究进展，介绍泛素化酶和去泛素化酶（deubiquitination enzymes，DUBs）在MS发病机制的生物学作用及潜在的分子机制，探索MS潜在的治疗靶点。

Abstract

Multiple sclerosis（MS） is a chronic，immune-mediated inflammatory demyelinating disease of the central nervous system. With an unknown pathogenesis，MS remains a challenging and disabling condition that imposes a significant burden on families and society. Increasing evidence suggests that ubiquitination and deubiquitination are of pivotal significance in the neuroinflammatory responses，modulation of immune functions，as well as the formation and repair of myelin in MS. Ubiquitination and deubiquitination represent crucial post-translational modifications of proteins. Ubiquitination entails the specific modification of target proteins by ubiquitin molecules，which not only governs protein degradation but also orchestrates the functionality and localization of proteins. Conversely，deubiquitination is the process through which ubiquitin molecules are detached from target proteins，which serves as a counterbalance to ubiquitination. The dynamic balance between these two processes plays a pivotal role in MS pathogenesis. This article integrates the latest research advancements to elucidate the biological roles and underlying molecular mechanisms of ubiquitinating enzymes and deubiquitinating enzymes in the pathogenesis of MS，with the aim of uncovering potential therapeutic targets for this challenging disease.

Graphical abstract

关键词

多发性硬化 / 泛素化酶 / 去泛素化酶 / 免疫炎症 / 髓鞘再生

Key words

multiple sclerosis / ubiquitinating enzyme / deubiquitinating enzyme / immune-mediated inflammation / myelin regeneration

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是中枢神经系统（central nervous system，CNS）慢性炎症免疫相关疾病^[1]，以脱髓鞘、胶质细胞改变和神经轴突损伤为基本特征。MS发病的主要驱动因素是抗原呈递细胞激活T细胞，使T细胞大量增殖，透过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）激活小胶质细胞和巨噬细胞，T细胞还可以诱导CNS中的少突胶质细胞（oligodendrocyes，OLs）死亡、导致髓鞘脱失和神经元丢失。同时，活化的T细胞分泌多种促炎因子，导致BBB通透性增加，促进免疫细胞渗透到CNS，而这些免疫细胞所介导的炎症反应，又促使脑内神经胶质细胞发生改变，进一步影响MS的发展进程。据估计，全球约有280万人患有MS^[2]。MS通常引起肢体无力、视觉异常、感觉异常和共济失调等，是18~40岁患者非创伤性残疾最常见的原因之一^[3-4]。MS的病因尚不明确，目前已知的潜在遗传和环境因素包括EBV感染、维生素D水平降低、日晒时间不足、吸烟和肥胖等^[5]。

泛素化是一种翻译后修饰（post-translational modification，PTM），可调节神经元中的多种生物功能，如 DNA 损伤或修复、内吞作用、神经元发育形成、神经网络形态发生、突触重塑、核糖体生物发生、细胞适应和信号转导等^[6]。泛素化和去泛素化在调节中枢和外周免疫耐受中起着至关重要的作用，以防止自身免疫性疾病如MS、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）^[7]等的发生。泛素化和去泛素化在MS中通过调节免疫细胞的功能，参与神经细胞的损伤应答，同时促进OLs的活化和增殖、调节神经元形态和突触可塑性，促进神经功能和髓鞘的修复。目前几种E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases，E3s）和去泛素化酶（deubiquitination enzymes，DUBs）的表达已在MS中发现。本文对泛素化酶和DUBs在MS发病中的作用，从分子机制到可能的药物靶点进行综述。

1 泛素化与去泛素化

MS是一种炎症性脱髓鞘疾病，自身抗原和炎症因子会引发炎症反应、神经变性和组织损伤等，进一步会触发多种病理事件的发生，包括线粒体功能障碍、内质网应激、氧化应激和神经元炎症等。泛素化和去泛素化之间的动态平衡在MS发病中发挥着重要作用。

泛素（ubiquitin，Ub）是一种8.5 kDa的小蛋白，在翻译后与靶蛋白共价结合，通过改变靶蛋白的活性、稳定性和相互作用网络等来调节各种细胞及生理过程。泛素化过程受到严格的酶级联反应控制，包括E1泛素激活酶（ubiquitin-activating enzymes，E1s）、E2泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2s）和E3泛素连接酶（E3s）。泛素分子的C末端甘氨酸残基在ATP供能下被E1s激活，随后被转移到E2s的活性位点半胱氨酸残基上，最后通过E3s将泛素转移到底物蛋白的赖氨酸残基上。E3s根据其催化机制可分为3类：环指型（really interesting new gene，RING）、E6AP 羧基末端同源型（homologous to E6AP C-terminus，HECT）和环-连接环-环型（RING-between-RING，RBP）^[8-9]，E3s有高度的底物特异性，几乎参与了所有的生物过程，其中RNF157、Cbl-b、Hectd3等与MS密切相关。蛋白质泛素化是一个可逆的过程，通过去泛素化将泛素从自身和底物蛋白中分离出来，可以抵抗泛素化的影响。DUBs是一类能够去除靶蛋白泛素链上的泛素酶，在调节蛋白质稳定性和细胞内信号转导中起着重要作用。人类基因组大约编码了100个DUBs，分为7个家族：泛素C端水解酶（ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH）、泛素特异性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，USP）、Machado-Josephin结构域蛋白酶（machado-Josephin domain protease，MJD）、卵巢肿瘤蛋白酶（ovarian tumorrelated protease，OTU）、含锌脂的泛素肽酶（zinc-containing ubiquitin peptidase，ZUP）、含泛素的新型DUB家族（novel ubiquitin-containing DUB family，MINDY）和Jab1-Mov34-MPN+蛋白酶家族（Jab1-Mov34-MPN+protease family，JAMM）^[10-12]。它们在人类健康中有着不同作用，其中USP16、UCHL1、OTUB1、A20在MS中发挥关键作用。

泛素化和去泛素化是细胞内蛋白质降解和调控的关键部分，它们之间的平衡对于维持蛋白质水平及其功能至关重要^[13]，且与多种疾病相关，包括癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等^[7，14-16]。现在，越来越多的证据证实泛素化和去泛素化参与MS的发病过程^[17]。泛素化和去泛素化通过调控转录因子或关键信号分子影响免疫细胞发生自身免疫反应，造成组织损伤，被认为是MS发病机制的关键因素（图1）。

2 泛素化酶影响MS神经炎症和髓鞘再生

MS及其小鼠模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是一种以T细胞介导的免疫炎症反应和髓鞘脱失为特征的CNS退行性自身免疫性疾病，其发病机制与神经炎症异常激活以及髓鞘再生受阻紧密相关。髓鞘是神经纤维的保护层，具有保护轴突和加速神经冲动传递的作用^[17]，由OLs产生和维持，负责加速神经信号的传导，OLs的丢失和功能障碍会导致正常髓鞘再生失败和神经元损伤。泛素化酶作为一种重要的蛋白质修饰酶，近年来被发现与神经炎症和髓鞘再生密切相关。

2.1 RNF157

RNF157是E3s之一，在调控神经元存活和形态、细胞周期、巨噬细胞M2极化等方面发挥着重要作用^[18-19]。研究发现RNF157是CD4⁺T细胞分化的重要调节因子，促进Th1和Th2的分化，RNF157通过介导K48促进组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase1，HDAC1）的泛素化和降解，以T细胞固有的方式减弱Th17的分化和CD4⁺T 细胞中CCR4、CXCR3的表达，从而限制EAE的发生和发展^[20]。HDAC1是一种关键的表观遗传调控因子，对Th1、Th2、Th17等Th细胞的功能和分化起着关键的作用^[21]。所以，RNF157可能是针对MS或其他自身免疫性疾病适应性免疫应答的潜在靶点。

2.2 Cbl-b

Cbl-b是一种负责调控T细胞活化的E3s，在人类和小鼠的CD4⁺和CD8⁺T细胞中均高水平表达，并阻止T细胞过度活化，从而限制T细胞介导的自身免疫^[22]。在MS患者全基因组关联研究中发现，Cbl-b的表达水平与人群患MS的风险存在相关性^[23]，在复发缓解型MS（relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS）患者发病期间，CD4⁺T细胞中的Cbl-b表达明显减少。研究发现Cbl-b基因敲除小鼠在体外和体内均表现出EAE严重程度的明显增加，T细胞向CNS的浸润增强，T细胞在炎症环境中产生的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）也明显增加^[24-25]。这表明在Cbl-b缺失时，T细胞更容易被活化，更易导致免疫反应的过度激活和自身免疫性疾病的发生。因此，Cbl-b缺失成为推动神经炎症反应的潜在关键因素。

2.3 Hectd3

Hectd3是一种E3s，在调节CNS炎症细胞功能方面发挥着作用。MALT1是胱天蛋白酶募集结构域蛋白1-B细胞淋巴瘤10-黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1复合物（CARMA1-BCL10-MALT1，CBM）复合物的重要组成部分，在EAE中与相关的致病性Th17细胞共同发挥作用。研究表明，在EAE中E3泛素连接酶Hectd3是致病性Th17细胞生成所必需的，Hectd3通过介导K27和K29的多泛素链促进MALT1泛素化，导致NF-κB通路的激活，促进EAE致病性Th17细胞的分化，在Hectd3缺陷小鼠EAE模型中，其症状和炎症的严重程度明显降低，Th17细胞的生成和分化效率下降，从而限制了EAE的发展^[26]。所以，Hectd3可能是MS治疗的潜在有利靶点。

2.4 CLEC16A

CLEC16A是一种膜相关C型凝集素蛋白，功能为E3s，是MS的易感基因，CD4⁺T细胞在T细胞活化时会诱导CLEC16A的表达^[27]。CLEC16A与其他CLEC蛋白不同，它缺乏活性碳水化合物识别结构域，并作为E3s参与自噬的调节^[28]。在CLEC16A基因敲除小鼠中，神经元细胞的分泌能力受损导致内质网应激，因而CLEC16A缺陷小鼠表现为更为严重的神经退行性变^[29]。内质网的生理应激反应是正常大脑发育过程中必不可少的，它作为蛋白质合成和代谢稳态的保护性和内在调节剂，然而，内质网应激水平的增加会导致胚胎发育过程中的神经变性和神经元缺失^[30]。研究证明CLEC16A在小鼠CNS中的功能对神经变性疾病具有保护作用。

2.5 TAK981

小泛素样修饰剂（small ubiquitin like modifiers，SUMO）是细胞内蛋白的翻译后修饰剂。SUMO蛋白包括SUMO激活酶E1、共轭酶E2和连接酶E3，通过酶联反应与靶蛋白结合发挥作用。髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）是髓鞘形成过程中的重要成分。TAK981是SUMO化途径E1酶的同类抑制剂，TAK981通过与SUMO蛋白形成复合物，阻止E1酶的激活，从而阻止SUMO化的进程^[31]。研究表明，TAK981存在时可抑制SUMO化使MBP的表达增加，导致脱髓鞘区域的再髓鞘形成增加，并可减少Th17细胞的表达，减轻了EAE脱髓鞘和免疫反应的严重程度^[32]。因此，TAK981通过促进髓鞘修复和减少T细胞反应，为解决髓鞘再生和炎症损伤提供了新的方法。

2.6 Nedd4

支架蛋白Daam2与缺氧相关的VHL之间存在拮抗关系，二者调节OLs发育过程中的分化^[33]。E3泛素连接酶Nedd4通过K63连锁泛素化稳定VHL，从而调节OLs发育过程中Damm2和VHL的表达，对OLs特异性Nedd4敲减小鼠的进一步研究表明，Nedd4的缺失会抑制少突胶质前体细胞（oligodendrocyle progenitor cells，OPCs）在发育过程中的分化和髓鞘形成，并抑制损伤后髓鞘的修复^[34]。因此，E3泛素连接酶Nedd4介导的翻译后修饰是损伤后髓鞘再生的关键机制。

2.7 RNF43

RNF43是一种DNA损伤应答蛋白，具有E3s的功能。在MS中，髓鞘的脱失是通过对成熟OLs的损伤或自身免疫损伤发生的，其特征是OPCs无法增殖分化为成熟的OLs。研究发现RNF43是OPCs中Wnt信号通路的靶标，可被Wnt信号在受损的OPCs中强烈激活，并标记激活的OPCs，但RNF43蛋白作为一种负反馈机制，需要通过抑制OPCs中的Wnt信号传导来促进髓鞘再生过程中的OLs分化^[35]。RNF43只在损伤病变中特异性表达，在周围正常区域中不表达，且只表达于OPCs中^[36]。在健康大脑发育期间，OPC分化为OLs不需要RNF43，但在损伤修复过程中，RNF43的缺失会导致髓鞘形成的明显延长和永久性缺陷^[35]。所以，RNF43是损伤后髓鞘再生的关键调节因子，为促进髓鞘再生提供了治疗靶点。

2.8 RNF220

RNF220是一种参与神经发育的E3s^[37]，是OLs发育所必需的，它在OLs谱系细胞中的特异性缺失会影响OPC的增殖、分化、随后的髓鞘形成以及脱髓鞘损伤后的再髓鞘形成，导致学习和记忆能力下降^[38]。ZC4H2是 RNF220的伴侣蛋白，起到稳定 RNF220的作用，同时在某些情况下还充当 RNF220和靶蛋白之间相互作用的介质^[39-41]。研究表明，在人类中，RNF220和ZC4H2的突变都与伴有复杂神经缺陷的疾病有关。在1项研究中，Olig1和Olig2是参与大脑OLs发育和髓鞘形成的基因调控网络的关键特定转录因子，也是RNF220的2个直接泛素化底物，RNF220通过K63多泛素化维持这2个特定转录因子的蛋白稳定性、OLs的发育和髓鞘形成以及再髓鞘形成^[38]。因此，RNF220在OLs的发育进程以及髓鞘再生的环节中发挥着至关重要的保障功能。

3 DUBs参与MS免疫功能调节

泛素化是1个高度动态化和可逆的过程，可以通过DUBs进行反调控，DUBs通过直接去除靶蛋白中的泛素或阻断泛素链的延伸来降低泛素化^[42]。DUBs在中枢和外周免疫耐受中调节免疫细胞的功能，恢复免疫耐受，以延缓自身免疫性疾病的发展，因此为自身免疫性疾病的治疗提供了潜在的治疗靶点。DUBs在T细胞介导的免疫反应中发挥重要作用，通过调节T细胞的功能，影响MS的发展。

3.1 USP16

USP16是一种DUBs，研究表明，自身免疫性疾病患者的T细胞中USP16的表达明显升高^[43]。细胞内钙在受刺激后，lys29钙调磷酸酶A（calcalineurin A，CNA）的多泛素化可以阻断活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）诱导基因的募集，而USP16可以减少这种多泛素化。USP16的缺失增加了CNA的泛素化，从而减少了NFAT诱导基因的转录。因此，在T细胞特异性USP16敲除小鼠中，T细胞的维持和增殖都存在缺陷，并且这类小鼠在应对由T细胞所驱动的一系列自身免疫性疾病（包括炎症性肠病和EAE等）时，表现出明显的难治性^[43]。特异性USP16抑制剂可能对治疗由T细胞介导的自身免疫性疾病有潜在疗效。

3.2 UCHL1

UCHL1是在大脑和脊髓的神经元中高度表达的DUBs成员之一^[44]。UCHL1密切参与多种神经退行性疾病和中枢神经系统创伤性疾病，对神经系统功能至关重要，通过泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）途径去除受损蛋白，保护神经元免受损伤，保护轴突功能以及改善中枢神经系统损伤后的感觉运动恢复，并在轴突完整性、轴突转运和突触功能中也起关键作用^[44-46]。研究发现过表面等离子体共振成像（surface plasmon resonance imaging，SPRI）生物传感器对100例RRMS患者和46名健康志愿者进行蛋白质浓度评估，发现RRMS患者血浆中UCHL1浓度高于对照组，UCHL1的浓度可能是区分RRMS患者和健康个体的高灵敏度生物标志物^[47]。UCHL1容易受到活性氧、活性脂质和一氧化氮的遗传修饰和翻译后修饰，从而损害其活性，导致其溶解度和聚集性降低^[48]。因此，恢复UCHL1活性并防止UCHL1的错误修饰可能是治疗神经退行性疾病和脑损伤的有效策略。

3.3 A20

A20是一种泛素修饰蛋白，负责调控NF-κB信号转导。与神经元一样，泛素化也在星形胶质细胞和小胶质细胞等胶质细胞中起作用，以维持大脑中的蛋白质稳态、细胞因子平衡和健康环境^[49]。编码A20的TNFAIP3基因的突变与MS易感性有关。研究发现CNS内皮细胞中A20的缺失增加了EAE的发生^[50]。A20通过抑制NF-κB和JAK-STAT信号通路抑制星形胶质细胞细胞因子和趋化因子的产生，限制EAE的发展^[50]。除星形胶质细胞外，EAE中小胶质细胞的功能也受到A20的调控，小胶质细胞中A20缺失增加了小胶质细胞的数量，影响了小胶质细胞对神经元突触功能的调节，也加重了EAE的严重程度^[51-52]。所以，在星形胶质细胞或小胶质细胞中特异性缺失A20进一步证明了A20在活动性EAE和自发性神经炎症的保护功能。

3.4 OTUB1

OTUB1是OUT家族的成员之一，与其他DUBs不同，OTUB1不仅具有典型DUBs活性，还可直接去除K48链接的多泛素化链，而且具有非典型DUB活性，可抑制K48或K63特异性泛素从E2s转移到E3s，从而阻碍蛋白的泛素化。OTUB1在调节参与各种细胞活动的关键分子方面具有多功能性^[53-54]，研究表明OTUB1通过抑制IL-15R信号通路抑制T细胞和NK细胞的活化^[55]，通过调节T细胞和NK细胞的功能来影响EAE的严重程度，选择性OTUB1缺乏的小鼠通常会发生更严重的EAE^[54]。OTUB1通过抑制星形胶质细胞中干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）所诱导的促炎因子和趋化分子的产生来改善 EAE^[54]。OTUB1在MS患者的星形胶质细胞中高表达，可能是改善神经炎症的机制。这表明星形胶质细胞特异性OTUB1可能参与了MS的发生和发展。

4 泛素化和去泛素化在MS中的潜在治疗靶点

现在针对MS的治疗包括疾病修饰治疗（disease-modifying therapies，DMTs）、对症治疗、生活方式的改变、心理支持治疗和康复干预等^[1]。目前多种泛素蛋白酶抑制剂、E3s抑制剂和DUBs抑制剂已被研究用于癌症相关治疗^[56]。由于E3s的高度特异性，可以更精准地识别靶蛋白，使之在蛋白修饰中发挥更广泛的作用^[9]，也提高了选择性E3s抑制剂的可能性，为泛素化治疗MS提供了可能。目前没有明确的证据表明泛素化抑制剂可用于MS的治疗，但泛素化在调节MS神经炎症反应、免疫细胞功能和髓鞘修复中发挥着关键作用，针对泛素化途径的药物可能对MS有潜在的治疗作用。

培维酮他司他（Pevonedistat /TAK-924/MLN4924）是一种小分子的NEDD8激活酶（NEDD8-activating enzyme，NAE）抑制剂，通过阻断特定蛋白的泛素化修饰，影响细胞周期和细胞增殖。研究表明在EAE中使用Pevonedistat，可抑制泛素化修饰，减少神经系统炎症来减轻EAE的严重程度^[57]。尽管Pevonedistat最初是作为一种治疗癌症的药物^[58]，但最近的研究提示它对免疫细胞功能也有着重要作用，该药物可作为自身免疫性疾病的潜在药物治疗靶点。姜黄素是一种多酚化合物，被认为具有抑制UPS的功能^[59]，通过降低特异性T细胞的增殖，减少促炎因子的分泌以及减少EAE模型中的脱髓鞘和神经炎症反应，大大降低了EAE的严重程度^[60]，因此可能会成为MS新的治疗药物。泛素化和去泛素化过程可以调节免疫细胞的活化、增殖和分化，还可调节神经元中的蛋白质稳态及调节髓鞘细胞的分化和成熟，从而影响MS的发病进程，泛素化酶和DUBs等都可能成为MS的治疗靶点，通过抑制或调节这些靶点的活性，可以调节免疫反应、保护神经元和促进髓鞘再生，从而为MS的治疗提供新的策略和方法。泛素化酶和去泛素化酶与MS的关系及参与发病的分子机制见表1。

5 小结与展望

本文就泛素化酶和DUBs在MS发生发展中的作用进行综述。MS是一种病因复杂的CNS疾病，T细胞和B细胞组成的特异性免疫应答在MS的发病机制中起着关键作用。泛素化酶和DUBs介导的蛋白质降解和调控参与神经炎症调节、免疫功能调节、髓鞘形成和修复影响了MS的发展。泛素化酶和DUBs的表达或缺失对MS及其动物模型EAE的严重程度具有重要影响，因此泛素化被认为是MS的潜在的发病机制和治疗靶点，尤其是E3s和DUBs，在抑制T细胞过度活化、抑制炎症因子及趋化因子的产生、促进OPCs分化及髓鞘再生方面发挥重要作用，它们具有很高的选择性，在候选药物中具有广阔的前景。目前的研究对泛素化和去泛素化在MS疾病发生发展的作用提供了有效的观点，监测泛素化酶和DUBs的变化水平可以帮助患者提供更有效的治疗方案和对治疗效果进行评估，更好地判断疾病进展和预后情况。随着蛋白质组学技术的进步，未来罹患MS或其他自身免疫性疾病的患者将会有更多的治疗选择。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82360254)

甘肃省自然科学基金资助项目(24JRRA359)

城关区科技人才创新创业项目(2023RCCX0012)