间充质干细胞及其外泌体治疗早发性卵巢功能不全的研究进展

Research advances in mesenchymal stem cells and their exosomes in treatment of premature ovarian insufficiency

摘要

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是一种严重影响女性生理和生殖功能的复杂内分泌疾病，已成为育龄期女性不孕的主要原因之一，其临床特征为闭经或月经稀发、低雌激素或雌激素缺乏以及促性腺激素水平升高。POI的发病率呈上升趋势，且病因及发病机制尚不明确。目前临床上针对POI的常规治疗方法仍无法从根本上改善卵巢功能和解决生育问题。随着再生医学的发展，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）已成为POI治疗的研究热点之一，其外泌体也作为一种新型的“无细胞治疗”方法而备受关注。多项动物研究显示，MSCs及其外泌体通过调控颗粒细胞增殖与凋亡、促进卵巢血管新生、增强抗氧化应激能力、抑制卵巢组织纤维化、促进卵泡发育与成熟以及调节卵巢局部免疫微环境等多重机制，发挥对POI的治疗作用。此外，相关临床研究也已取得一定进展。本文对MSCs及其外泌体治疗POI的相关机制及临床疗效进行综述，旨在为POI的深入研究及临床转化提供参考和依据。

Abstract

Premature ovarian insufficiency（POI） is a complex endocrine disorder that significantly affects the physiological and reproductive functions of women，and it has become one of the main causes of infertility in women of childbearing age. The clinical features of POI include amenorrhea or oligomenorrhea，low estrogen or estrogen deficiency，and an increase in the level of gonadotropin. The incidence rate of POI tends to increase，yet its etiology and pathogenesis remain unclear. At present，the conventional treatment methods for POI have limited efficacy in fundamentally improving ovarian function or addressing the fertility issue. With the development of regenerative medicine，mesenchymal stem cells（MSCs） have become one of the research hotspots in POI therapy，and their exosomes have attracted wide attention as a promising “cell-free therapy”. A number of animal experimental studies have shown that MSCs and their exosomes can exert a therapeutic effect on POI by affecting granulosa cell proliferation and apoptosis，promoting ovarian angiogenesis，reducing oxidative stress and fibrosis，enhancing follicular development，and regulating immunity. In addition，related clinical studies have also made some progress. This article reviews the mechanisms and clinical effect of MSCs and their exosomes in the treatment of POI，in order to provide a reference for further research and bench-to-bedside translation of POI therapies.

关键词

早发性卵巢功能不全 / 间充质干细胞 / 外泌体 / 再生医学

Key words

premature ovarian insufficiency / mesenchymal stem cell / exosome / regenerative medicine

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是原始卵泡的过早耗竭所导致的卵巢功能缺失，指女性在40岁之前出现月经稀发或停经4个月及以上，伴有血清卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）升高和雌激素下降，继而生育力下降^[1]。其发病率随年龄增长而升高，病因包括遗传缺陷、医源性抗癌治疗、自身免疫、代谢紊乱、环境影响等^[2]。目前临床上主要使用激素替代治疗改善围绝经期症状^[2]，但无法从根本上恢复卵巢功能和生育能力。近年来间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因来源广泛、分化潜能高和旁分泌活性强等特点已成为多种疾病治疗研究的热点，也是POI的潜在新型治疗手段。本文总结了MSCs治疗POI的相关机制，并总结相关研究、概括临床疗效，阐述治疗优化策略，以期为POI治疗的深入研究和临床转化提供依据。

1 MSCs及其外泌体

MSCs作为应用最广泛的成体干细胞，存在于多种组织如骨髓、脐血及脐带组织、胎盘组织、脂肪组织、月经血等。早期研究认为干细胞可通过再生、分化和替代损伤组织发挥治疗作用。然而近年来研究表明MSCs的治疗潜力主要归因于其旁分泌活性，即分泌多种生长因子、细胞因子和细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）等发挥免疫调节、促血管生成、抗凋亡和抗氧化等作用^[3]。外泌体作为体积最小的EVs，操作和储存较容易，且生物相容性、稳定性和自主靶向性高，免疫原性较低，是理想的小分子递送系统，对多种慢性疾病具有明显治疗作用^[4]。

已有研究表明，卵巢内注射MSCs来源的条件培养基或分泌组可达到与MSCs相似的治疗效果^[3]，且减少了活细胞移植相关的安全性问题，这种“无细胞治疗”可能成为POI的新型治疗方法。而抑制外泌体释放则可导致MSCs的增殖和对缺氧的耐受力下降以及细胞间信息交流减少，影响MSCs的生物学功能^[5]。外泌体不仅具有MSCs的多种疗效，且微血管闭塞、致瘤促瘤和免疫排斥等风险更小，伦理争议更少^[6-7]，在临床上应用前景广阔。

2 MSCs治疗POI的作用机制

目前研究发现，MSCs可恢复卵巢的重量及形态、增加卵泡数量、调节激素分泌和改善异常动情周期，从而改善卵巢储备功能，提高生育能力。具体机制阐述如下。

2.1 影响卵巢颗粒细胞（granular cells，GCs）的增殖和凋亡

多项研究表明，MSCs通过调节增殖和凋亡相关基因表达，促进GCs增殖和抑制GCs凋亡，从而恢复卵巢功能。经血源性间充质干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells，MenSCs）可通过调节生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45 β（growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45 beta，GADD45b）、细胞分裂周期蛋白2（cell division cyclin 2，CDC2）和细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）的蛋白表达，解除GCs分裂周期中的G₂/M期阻滞，促进GCs增殖，抑制GCs凋亡，修复表柔比星诱导的卵巢损伤^[8]。Ma WQ等^[9]建立了自身免疫性POI的体外细胞模型，将骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）与人GCs体外共培养后发现BMSCs可促进GCs增殖，抑制细胞凋亡，且提高其激素合成能力。此外，Luo QQ等^[10]报道胎盘来源间充质干细胞（placenta-derived mesenchymal stem cells，PD-MSCs）可能通过上调血清和卵巢中抑制素亚基βB（inhibin subunit beta B，INHBB）、卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）的蛋白表达，减少化疗诱导的GCs凋亡，改善POI小鼠卵巢储备功能。

2.2 促进卵巢血管生成

改善卵巢血供在调节卵泡发育和卵巢功能中发挥关键作用，是POI治疗的关键机制之一。Qu QX等^[11]研究表明，脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）来源的外泌体携带的微小核糖核酸-126-3p（micro RNA-126-3p，miR-126-3p）下调磷脂酰肌醇-3激酶调节亚单位2（phosphoinositide-3-kinase，regulatory subunit 2，PIK3R2）的表达，激活磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路，促进GCs增殖和卵巢血管生成，从而恢复卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）大鼠的卵巢结构和功能。此外，Park HS 等^[12]用BMSCs分泌组处理人卵巢内皮细胞，发现其可通过PI3K/ALK通路促进卵巢血管内皮细胞增殖及血管生成标志物转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）、CC趋化因子配体11（CC chemokine ligand 11，CCL11）的表达，促进血管生成，增加新生血管密度。该研究提示MSCs分泌组可能含有增强卵巢血管生成的生物活性因子，但并未明确其中的具体作用成分。此外，由于新生血管形成与肿瘤生长之间存在一定关系，促血管生成作用是否与致瘤促瘤作用存在关联仍需进一步探究。

2.3 减轻氧化应激反应

氧化应激可诱导细胞损伤，活性氧（reactive oxygen species，ROS）是卵巢功能障碍的重要诱导因素，ROS过度累积会降低卵母细胞质量，诱导GCs凋亡，导致卵泡成熟障碍，引发不孕^[13]。Lu XY等^[14]发现UCMSCs通过抑制卵泡膜细胞（theca cells，TCs）中ROS产生，减少TCs凋亡，修复POI大鼠的卵巢组织损伤。Seok J等^[15]将PD-MSCs经尾静脉注射入去卵巢大鼠模型，发现PD-MSCs提高卵巢组织中血红素加氧酶（heme oxyenase，HO）的2种同工酶HO-1/HO-2比值，增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的基因表达及抗氧化效能，降低ROS水平，减少细胞凋亡。

2.4 抗纤维化作用

卵巢组织纤维化是POI的基本病理变化之一。在卵巢组织中，卵巢基质细胞可增殖和分化为TCs或肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB），当基质细胞向MFB分化增多时，导致细胞外基质分泌增多，发生卵巢组织纤维化。目前已知Smad蛋白介导的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路与多器官组织纤维化过程密切相关^[16]。前期研究表明，UCMSCs植入POI大鼠模型后，MFB标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）及胶原蛋白（Collagen）Ⅰ和Ⅲ的蛋白表达水平明显下降，表明UCMSCs可能通过调控腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/孤核受体亚家族4A组成员1（nuclear receptor subfamily 4 group A member 1，NR4A1）信号通路促进卵巢基质细胞向TCs分化，抑制其向MFB分化，减少胶原纤维分泌，发挥抗纤维化作用，恢复卵巢功能^[17]。目前仅有少数研究探讨了MSCs的抗纤维化作用，关于外泌体是否也能发挥此类作用以及更为详细的作用机制仍需进一步探索。

2.5 激活原始卵泡、促进卵泡发育

除卵巢组织纤维化外，POI的另一基本病理变化即卵泡发育障碍。Kim KH等^[18]研究发现PD-MSCs可下调循环中的微小核糖核酸-145-5p（micro RNA-145-5p，miR-145-5p），激活卵巢内骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-SMAD 1/5信号通路，诱导原始卵泡激活，促进卵泡发育。此外，PD-MSCs可上调卵泡生成相关基因如LIM同源盒基因8（LIM homeobox 8，LHX8）、新生儿卵巢同源盒编码基因（newborn ovary homeobox encoding gene，Nobox）等的表达，促进卵泡发育^[19]；羊膜间充质干细胞（amniotic mesenchymal stem cells，AMSCs）通过上调卵泡发育相关生长因子如叉头框蛋白L2（forkhead box protein L2，FOXL2）、八聚体结合转录因子4、生长分化因子-9（growth differentiation factor-9，GDF-9）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和下调干细胞因子（stem cell factor，SCF）的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）表达水平，参与改善卵巢局部微环境^[20]。这些研究表明MSCs在刺激原始卵泡向成熟卵泡发育的过程中发挥重要作用，证实其治疗POI的潜力。

2.6 免疫调节作用

T细胞免疫失衡是自身免疫性POI和炎症性卵巢损伤的重要致病机制，主要表现为外周血辅助性T细胞（Th细胞：CD4⁺）/细胞毒性T细胞（Tc细胞：CD8⁺）比值和调节性T细胞（Treg细胞）/Th17比值下降，促炎和抗炎因子分泌紊乱，导致卵巢组织炎症加重，阻碍卵泡发育，加速卵泡闭锁，促进POI发生发展^[21]。MSCs可通过免疫调节作用促进卵巢功能恢复。Song KJ等^[22]报道脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）与雌激素联合治疗可协同促进Treg细胞增殖和发挥免疫调节作用，改善受损的卵巢功能。另有研究发现，UCMSCs可通过降低Th1/Th2细胞因子比例和调节自然杀伤细胞的数量来恢复自身免疫性POF小鼠的卵巢功能^[23]。

3 MSCs治疗POF的临床研究进展

目前，多项MSCs治疗POF的临床试验已开展（表1），均未报告干细胞移植后不良反应，且发现MSCs移植可改善卵巢功能，其中部分患者月经复潮，获得临床妊娠及活产。由于样本量有限，目前无法就MSCs恢复POF女性的生育能力得出肯定结论，仍需开展样本量更大的随机对照研究证实其临床效果。

4 MSCs外泌体治疗POI的研究进展

目前绝大多数研究认为MSCs发挥作用并不依赖于其分化能力，而主要通过分泌大量生物活性物质如EVs等发挥治疗作用。其中研究最为深入的是外泌体，故本文对近年MSCs外泌体治疗POI的部分动物实验研究结果进行总结（表2），但MSCs外泌体治疗POI/POF的临床研究尚未见报道。

5 MSCs及其外泌体的治疗优化策略

虽然MSCs及其外泌体治疗POI已取得了一定成效，但仍存在一些缺陷或弊端限制了其广泛应用。近年来已经开发出许多方法来提高MSCs及其外泌体的部位靶向性、存留时间及生物学活性等，以提高治疗效率。

5.1 给药途径选择

MSCs常见的给药途径包括全身给药（静脉注射）和局部给药（卵巢原位注射），关于MSCs给药途径对化疗性POI治疗效果的影响已有较多研究。其中最新研究发现，UCMSCs尾静脉注射可从整体水平改善POI大鼠的全身状态，如体重及性激素水平等；而卵巢原位注射更有助于改善卵巢结构和功能^[40]。Zhang ML等^[41]研究发现2种注射方式对POI大鼠卵巢结构和功能的恢复效果相似，但尾静脉注射造成的损伤更小，在制定整体治疗方案时更具灵活性，且静脉注射后MSCs可分布于卵巢、子宫、肝、肾等多个器官，对化疗所致的多器官损伤具有修复作用，全身治疗效果更好，因此MSCs静脉注射治疗化疗性POI更具优势，但静脉给药也存在血栓形成风险，且全身分布作用未必对特发性和免疫性POI患者有益，对于此类人群给药途径的选择仍需进一步研究。

5.2 联合应用生物材料

MSCs及其分泌组注射入体内后易扩散，稳定性和持久性较差，导致靶组织中存留不足，严重影响疗效。因此，有研究利用各种生物材料作为生物相容性细胞支架提供机械支持，进一步提高作用效率和治疗效果。胶原支架和自交联透明质酸凝胶支架均可增加MSCs在卵巢中的存留时间、增强旁分泌功能，更加有助于卵巢功能和生育能力的恢复^[42-43]。Matrigel支架在POF小鼠模型中促进UCMSCs存活和增殖，减少其凋亡。UCMSCs/Matrigel移植增加POF小鼠的卵泡数量，抑制卵巢纤维化，促进GCs增殖和卵巢血管生成，从而修复卵巢损伤和改善卵巢功能^[44]。此外，将可水解支架及合成性MSCs（包封MSCs分泌组）组成的卵巢再生贴片在腹腔镜下移植入POF大鼠体内，可有效恢复卵巢功能和生育能力^[45]。该策略减少了直接移植活细胞可能的致瘤和免疫排斥等风险，同时维持MSCs分泌组的持续释放，发挥更有效的治疗作用，可能为POF提供可行的临床治疗方法。

5.3 预处理

预处理能够改变MSCs的生物学活性，提高增殖、迁移和存活能力，促使其归巢至损伤组织，并增强旁分泌功能。与单纯AMSCs移植相比，低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）预处理的AMSCs移植更有利于减轻POI大鼠卵巢的炎症反应，抑制GCs凋亡，改善卵巢局部微环境，这可能是由于LIPUS预处理通过基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）/趋化因子受体4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）轴促进AMSCs归巢和分泌生长因子如胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等发挥旁分泌作用^[46-47]。Huang QY等^[48]发现褪黑素预处理可促进AD-MSCs增殖并增强其旁分泌功能，从而恢复POI小鼠血清性激素水平、卵泡数量和生育能力。此外，有研究表明过氧化氢预处理可能通过提高MSCs的迁移能力和存活率增加POF小鼠卵巢中MSCs的数量，增强MSCs对POI的治疗效果^[49]。

5.4 联合基因修饰

基因修饰可将目的基因导入MSCs，使其不仅具有本身的全部特性，还能高效表达某些外源基因，提高疗效。很多研究表明经过基因修饰的MSCs在组织修复中发挥更有效的作用。例如，Chen JY等^[50]发现HGF基因修饰的UCMSCs在改善化疗诱导POI大鼠卵巢储备功能方面比单纯UCMSCs移植更有优势，这可能与过表达的HGF抑制卵巢组织纤维化和GCs凋亡、促进卵巢血管生成有关。因此，MSCs移植联合基因修饰可能是获得理想治疗效果的有效途径，但目前在临床应用方面仍有较多伦理争议和限制。

6 结语

POI因其发病率高及缺乏根本有效的治疗方法，仍是生殖医学面临的巨大挑战。MSCs在POI中的治疗价值已在动物模型和临床试验中得到初步证实。此外，最新研究将MSCs来源的外泌体在化疗前注入小鼠卵巢内，可保护卵巢功能和生育能力免受化疗损伤^[51]，这表明外泌体不仅可以恢复生育力，还可作为保护生育力的1种重要手段，但尚缺乏临床试验证实其疗效。目前，基于MSCs及其外泌体治疗的多种优化策略已被探索，但目前也存在一些问题限制其广泛应用，如安全性、质量控制、临床级生产等问题。因此，仍需进行更多研究以解决以上局限性，加速MSCs及其外泌体的临床转化进程。

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基金资助

首都卫生发展科研专项资助项目(2024-2-40911)

国家重点研发计划课题资助项目(2021YFC2700605)

国家自然科学基金资助项目(82171632)

北京大学临床医学+X青年专项资助项目(PKU2024LCXQ047)