重庆市人类精子库488例捐精志愿者地中海贫血筛查情况及基因型分析

Thalassemia screening and genotype analysis in 488 sperm donors in Chongqing Human Sperm Bank

摘要

目的：通过对重庆市人类精子库捐精志愿者地中海贫血筛查情况和基因突变类型分析，了解重庆地区捐精志愿者地中海贫血的携带情况，为重庆地区捐精志愿者地中海贫血筛查方案提供参考依据。方法：选择2021年12月至2024年8月重庆市人类精子库488例捐精志愿者（进入检疫期所有合格捐精志愿者）的血液样本，采用全血细胞分析法检测红细胞平均体积（mean corpuscularvolume,MCV）、平均血红蛋白含量（mean corpuscu larhemoglobin,MCH），采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）/琼脂糖凝胶电泳法检测缺失型α-地贫基因突变，采用PCR和DNA反向点杂交法检测3种常见非缺失型α-地贫基因突变和17种常见β-地贫基因突变，并对检测结果进行分析。结果：488例捐精志愿者，年龄（25.64±4.95）岁，共检出地中海贫血携带者15例（3.07%）且均为汉族，低于重庆地区地中海贫血人群携带率9.24%。地中海贫血携带者15例中，包括α基因缺失型13例，分别为-α3.7基因型11例（73.33%）、-α4.2基因型1例（6.67%）以及-SEA基因型1例（6.67%）;α基因非缺失型2例，均为WSM杂合突变。地中海贫血携带者中MCV、MCH 2项指标均异常仅有1例（筛查阳性率6.67%）。结论：重庆市人类精子库捐精志愿者地中海贫血筛查结果具有区域性（籍贯以川渝地区为主）和人群分布差异性（健康育龄男性），地中海贫血携带率较低，因地中海贫血对供精出生子代具有重要的影响，建议人类精子库在捐精志愿者中开展地中海贫血基因筛查。

Abstract

Objective To investigate the carriage of the thalassemia gene in sperm donors in Chongqing，China by analyzing the thalassemia screening and gene mutation types of sperm donors in Chongqing Human Sperm Bank（CHSB），and to provide a reference for thalassemia screening in sperm donors in Chongqing. Methods Blood samples were collected from 488 sperm donors in CHSB（donors with all tests qualified during the quarantine） from December 2021 to August 2024. A complete blood count analysis was performed to measure the mean corpuscular volume（MCV） and mean corpuscular hemoglobin（MCH）. Polymerase chain reaction（PCR）/agarose gel electrophoresis was used to detect deletional α-thalassemia mutations. PCR and DNA reverse dot blot hybridization were used to detect 3 common non-deletional α-thalassemia mutations and 17 common β-thalassemia mutations. The test results were then analyzed. Results Among the 488 sperm donors aged 25.64±4.95 years，15（3.07%，all Han nationality） tested positive for thalassemia. This carriage rate was lower than that of the thalassemia population in Chongqing（9.24%）. Among the 15 thalassemia carriers，13 had deletional α-gene mutations（-α3.7 genotype in 11 cases［73.33%］， -α4.2 genotype in 1 case［6.67%］，and -SEA genotype in 1 case ［6.67%］），and 2 had non-deletional α-gene mutations（both with the WSM heterozygous mutation）. There was only 1 case of abnormal MCV and MCH2 indicators among thalassemia carriers（screening positive rate was 6.67%）. Conclusion Thalassemia screening in sperm donors in CHSB reveals a low thalassemia carriage rate，reflecting geographic （predominantly Sichuan and Chongqing origins） and demographic （healthy men of childbearing potential） characteristics. Given the significant impact of thalassemia on the offspring conceived through sperm donation，it is recommended to conduct thalassemia gene screening among sperm donors in human sperm banks.

关键词

重庆地区 / 捐精志愿者 / 地中海贫血 / 基因型分析

Key words

Chongqing / sperm donor / thalassemia / genotype analysis

人类精子库是以治疗不育症及预防遗传病和提供生殖保险等为目的，利用超低温冷冻技术，采集、检测、保存和提供精子并进行相关研究的公益性机构。现阶段我国执行的人类精子库技术规范要求人类精子库提供用于辅助生殖技术治疗的健康精子，是保障应用精子治疗项目的生殖安全和生殖健康的前提。人类精子库的基本任务之一是对供精者进行严格的医学和医学遗传学筛查，并建立完整的资料库。2021年《关于筛查合格供精志愿者的标准更新的中国专家共识》^[1]中指出：建议根据地区发病率针对性进行供精者基因筛查检测（如地贫基因、耳聋基因），同时可将全外显子测序作为供精者筛选补充手段。重庆市人类精子库严格按照要求筛查捐精志愿者的同时，也加强捐精志愿者地中海贫血的筛查。通过全血细胞计数中的红细胞平均体积（mean corpuscularvolume，MCV）、平均血红蛋白含量（mean corpuscu larhemoglobin，MCH）进行地中海贫血的初筛且在其捐精完成6个月后HIV复查时检测地中海贫血基因，从而减少供精子代罹患地中海贫血的风险。地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血，简称地贫，是由于血红蛋白中珠蛋白基因缺陷，导致有1种或几种珠蛋白肽链合成减少或不能合成，致使珠蛋白链的比例失衡，血红蛋白的组分改变，引起的1组遗传性溶血性贫血疾病。根据临床表现分为静止型、轻型、中间型、重型地贫。根据基因缺陷分类为α型、β型、δβ型、δ型，其中以α型和β型地中海贫血较为常见。我国已发现20余种α珠蛋白基因突变，缺失型常见为-SEA、-α4.2、-α3.7，非缺失型有αCS、αQS、αWS；60余种β珠蛋白基因突变，常见为CD41-42、CD17、IVS-Ⅱ-654等17种。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2021年12月至2024年8月重庆市人类精子库488名合格捐精志愿者的血液样本。年龄（25.64±4.95）岁，籍贯统计以户籍所在地为准，所有对象均知情告知并签署了知情同意书，并经重庆市人口和计划生育科学技术研究院医学伦理审查委员会批准同意后实施[批准号：（2024）伦审第（001）号]。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞分析

受检者进行血常规检查，嘱其静坐30 min，情绪稳定的情况下采集外周静脉血2 mL，保存在EDTA抗凝真空试管中，摇晃试管，使抗凝剂与血样充分混合，避免血液凝固，用XN-1000-B1全自动血液分析仪及配套的试剂盒进行血细胞分析，检测MCV、MCH等红细胞参数，其值参考《地中海贫血携带者筛查及防控专家共识》^[2]中关于地中海贫血诊断依据：MCV<80 fl和（或）MCH<27 pg提示血液学检测异常。

1.2.2 基因型分析

采集EDTA 抗凝全血2 mL，按缺失型α-地中海贫血基因检测采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）/琼脂糖凝胶电泳法；非缺失型α-地中海贫血基因检测采用PCR和DNA反向点杂交法；β-地中海贫血基因检测采用PCR和DNA反向点杂交法，由亚能生物技术（深圳）有限公司提供的试剂盒说明提取细胞DNA、PCR扩增（PCR扩增仪为eppendorf flexlid）、杂交后分析结果。3种常见的α-地贫基因缺失型：-SEA、-α3.7、-α4.2；3种α-地贫基因非缺失型：αCS、αQS、αWS；17种常见β-地贫基因突变型：CD41-42（-TCTT）、IVS-Ⅱ-654（C-T）、-28（A→G）、CD17（A→T）、CD71-72（+A）、βE（GAG→AAG）、-29（A→G）、CD43（G→T）、CD27/28（+C）、CD14-15（+G）、CD31（-C）、-32（C→A）、-30（T→C）、IVS-I-1（G→T）、IVS-I-5（G→C）、CAP+1（-AAAC）、IntM（ATG→AGG）。

1.3 统计学方法

本研究所有数据采用使用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，使用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线比较MCV、MCH诊断地贫基因的敏感度及特异度。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 基本情况

本研究中488名捐精志愿者，年龄(25.64±4.95)岁，来自全国28个省（市、自治区），其中华东地区21人、华南地区5人、华北地区16人、华中地区17人、西南地区411人、西北地区10人、东北地区8人。其中汉族457人（93.65%）、苗族12人（2.46%）、土家族12人（2.46%）、回族2人（0.41%），蒙古族、哈尼族、壮族、布依族、满族各1人（各占0.20%），符合重庆市民族分布特点，15名地中海贫血携带者均为汉族。

2.2 MCV、MCH分析情况

本研究中研究对象共488名捐精志愿者，包括地贫基因阴性组473人（96.93%）和地贫基因阳性组15人（3.07%），15名地贫基因阳性组中MCV异常1人（6.67%）、MCV正常14人（93.33%），MCH异常3人（20%）、MCH正常12人（80%）,MCV和MCH两者联合异常1人（6.67%）、正常14人（93.33%），见表1。

MCV、MCH的ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.227、1.000，MCV与地中海贫血基因携带有相关性（P=0.000），MCH与地中海贫血基因携带有相关性（P=0.000），其中MCH敏感度（1.000）、特异度（1.000）均较好，见表2。

2.3 地贫基因

15例地贫基因携带者中包含α基因缺失型13例:-a3.7缺失杂合子 11例（73.33%）、-α4.2缺失杂合子1例（6.67%）、-SEA缺失杂合子1例（6.67%）；α基因非缺失型2例：WSM杂合突变（13.33%）。

3 讨论

据文献报道，全球约有2.7亿人群携带地中海贫血基因，我国地中海贫血基因携带者超过3 000万人^[3]。通过488例捐精志愿者地贫基因检测，提示地中海贫血携带率3.07%（15例/488例），高于湖南省人类精子库地中海贫血基因携带率2.4%（80例/3 231例）^[4]，低于广西壮族自治区人类精子库地中海贫血基因携带率6.73%（23例/342例）^[5]，推测携带率的差异与样本量大小和区域性质有关。基于地理信息系统的患病率地图显示，地中海贫血的地理分布在中国南部最高，包括广东、广西、贵州、云南等，并从南向北逐渐减少^[6]。杨嫄等^[3]统计重庆地区地中海贫血发病率为9.24%，α-地贫和β-地贫分别为5.04%、4.04%；林琪茵等^[7]报道了广州地区育龄人群地贫基因携带率为14.16%，α-地贫、β-地贫、α-地贫合并β-地贫分别为10.70%、2.90%、0.56%；黄志卓等^[8]统计广西柳州地区地贫基因携带率为43.66%，α-地贫、β-地贫、α-地贫合并β-地贫分别为26.97%、14.49%、2.20%；何金龙等^[9]分析了海口地区育龄夫妇检出率为41.57%，α-地贫、β-地贫及α-β复合型地贫分别占75.02%、18.61%及6.36%。推测其原因与本研究对象为捐精志愿者这一特殊人群有关，捐精志愿者多为健康育龄男性，且本研究地贫基因携带者筛查仅纳入精液合格的健康育龄男性，故地中海贫血阳性率明显低于健康人群携带率。本研究中所有研究对象汉族占93%，15例地中海贫血基因携带者均为汉族，与马金花等^[10]研究报道的112例地贫基因阳性者中，少数民族占比（83.9%）高于汉族，且基因型种类也较汉族多不一样。究其原因考虑捐精者多为重庆常住人口，少数民族占比少，待日后收集到更详尽的数据再作补充和讨论。

本研究488人中地贫基因阴性组473人，地贫基因阳性组15人，15例地中海贫血基因携带者中MCV异常1人（6.67%）、MCV正常14人（93.33%），MCH异常3人（20%）、MCH正常12人（80%），从ROC曲线分析可以看出，MCH特异度、敏感度均较好。本研究试图通过MCV、MCH这2种血液学检测指标用于筛查地中海贫血携带者，MCV和MCH两者联合异常 1人（6.67%）、正常14人（93.33%），表明15例地中海贫血携带者仅通过MCV、MCH联合筛查，有14例漏诊。与林琪茵等^[7]的研究结果一致，其团队通过比对地中海贫血筛查和地中海贫血基因检测结果发现：31 455例研究对象中共有731例地中海贫血漏筛病例，所有的漏筛病例其红细胞渗透脆性、血红蛋白电泳、红细胞参数均无异常，且绝大多数为静止型α-地贫。马金花等^[10]对200例可疑地贫患者进行血常规和血红蛋白电泳检测发现地贫初筛阳性120例，阴性80例，初筛阳性组中地贫基因的阳性率为70%，而初筛阴性者中地贫基因阳性率为35%，证实血常规及血红蛋白电泳筛查地贫存在较高漏诊率。因此有必要进行地中海贫血的基因检测。

常规的地贫筛查方法主要有血常规筛查、红细胞脆性检测、血红蛋白电泳等传统方法，但是地中海贫血作为一种单基因遗传病，以上方法均不能有效明确具体的地贫基因型，同时还存在一定的漏诊率，因此本研究也在其捐精完成6个月后HIV复查时，进行地中海贫血基因检测。本研究共检测到15例α-地中海贫基因携带者，未检测出β-地中海贫血基因携带者，这与国内绝大多数学者报道的α-地中海贫血发病率高于β-地中海贫血发病率一致。15例确诊为α-地中海贫血携带者中，以基因型构成比排序，以-α3.7最为常见，与重庆地区曾建涛等^[11]、严关平等^[12]的研究一致。本研究α-地中海贫血以-α3.7（73.33%）最为常见，与重庆地区杨嫄等^[3]、李思阅等^[13]（-SEA最为常见）的研究不一致，也与国内大部分报道不一致（-SEA最常见）^{[7-8，14-18]}。推测原因与本研究对象有关，其基因型分布也存在差异。

人类精子库外供冷冻精液标本在临床应用时，针对明确携带地中海贫血基因的受精者，其待使用的冷冻精液标本对应的捐精志愿者还需进一步排除携带地中海贫血的可能。因此，通过对重庆市人类精子库捐精志愿者进行地中海贫血基因分析，有助于为人类精子库志愿者筛查提供有价值的参考依据，从而提高外供冷冻精液标本的安全性，保障外供冷冻精液标本受者及其后代的生殖安全和生殖健康^[19]。

综上所述，重庆市人类精子库在捐精志愿者中开展地中海贫血筛查和基因型的分析具有重要价值和意义，有助于了解重庆市捐精志愿者中地中海贫血的流行情况和基因携带频率，为制定相关的生殖健康策略提供数据支持。此外，对于人类精子库的规范化管理和质量控制具有指导作用，能够更好地保障所提供的冷冻精液标本的质量，从而降低地中海贫血基因供精子代遗传的风险。

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基金资助

重庆市医学科研（卫生健康委员会和科技局联合）资助项目(2022msxm063)