溶瘤病毒Rigvir^?对结直肠癌细胞系在体外的影响及其机制的研究

摘要

目的：探究溶瘤病毒Rigvir^?在体外对6种不同结直肠癌细胞系的杀伤作用及不同细胞系对Rigvir^?敏感性的差异，分析敏感细胞与不敏感细胞的差异基因及信号通路以探究其差异产生的原因并进行验证，根据实验结果初步探究溶瘤病毒Rigvir^?对结直肠癌细胞的杀伤机制，为溶瘤病毒Rigvir^?作为新型免疫治疗药物治疗结直肠癌提供理论基础。方法：采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）试验定量检测Rigvir^?对细胞的细胞抑制率，通过Annexin V-FITCPI法检测敏感细胞系的细胞凋亡率并初步分析其杀伤机制，利用生物信息学技术分析敏感细胞与不敏感细胞的差异基因及信号通路并应用蛋白质印迹法（Western blot,WB）进行验证和检测凋亡因子表达情况。高表达差异信号通路上游因子，并应用实时定量逆转录酶链式反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR）和WB检测Rigvir^?对敏感细胞系过表达细胞株目的基因及目的蛋白表达量的影响。结果：SW480和HT29对溶瘤病毒Rigvir^?敏感，而对其余4种细胞系相对不敏感（P<0.001），但2个浓度梯度的Rigvir^?对HT29的抑制作用更加明显（P<0.001），在感染48 h后SW480细胞随感染时间的延长，细胞抑制率不再增加（F=52.010,P=0.147），但其对病毒浓度的变化较敏感（F=13.490,P<0.001）。相反，病毒浓度的变化对HT29细胞的抑制率无明显影响（F=8.450,P=0.281），但在48 h后随着感染时间的延长，抑制率仍继续升高（F=24.380,P<0.001）。敏感组细胞随着感染时间的延长，凋亡率逐渐增加（P<0.001），且均以细胞晚期凋亡和坏死细胞为主。通过生物信息学技术观察到PI3K/Akt/mTOR经典信号通路在敏感组与不敏感组之间差异明显，WB实验表明，应用Rigvir^?后，敏感细胞组PI3K/Akt/mTOR上游蛋白表达量明显降低（P<0.001）。细胞凋亡因子caspase-3及caspase-8表达量升高，Bcl-2/Bax比值降低（P<0.001）。RTqPCR和WB结果表明，Rigvir^?作用于敏感细胞系HT29过表达细胞株后，PI3K/Akt/mTOR上下游信号分子（Akt,4EBP1和p70S6K）的表达量较对照组明显降低（P<0.05）。结论：Rigvir^?可以在体外有效杀伤部分结直肠癌细胞系（SW480、HT29），其作用机制部分是通过PI3K/Akt/mTOR经典信号通路诱导细胞凋亡。

关键词

溶瘤病毒 / 结直肠癌 / 凋亡 / PI3K/Akt/mTOR通路