HSF1在HBx促进肝细胞癌进展中的作用研究

Investigation of the role of HSF1 in HBx-driven progression of hepatocellular carcinoma

摘要

目的:探讨热休克转录因子1(heat shock transcription factor 1,HSF1)在乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)促进肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞迁移、侵袭中的重要作用,并初步研究HSF1介导HBx促进HCC进展的作用机制。方法:通过4D Label-free定量蛋白质组学和Western blot检测发现HBx对HSF1表达水平的影响;在Huh7和MHCC97H肝癌细胞系中过表达HBx,运用RT-PCR、Western blot检测HBx对HSF1 mRNA、蛋白质水平、HBx蛋白稳定性的影响;运用TCGA数据库分析HSF1在HBV相关性肝癌组织中的表达水平及其与肝癌分期分级、患者预后的关系,并通过Westen blot检测HSF1在HBV相关性肝癌组织中的表达水平;在HCC细胞中过表达HBx并敲减HSF1或用HSF1特异性抑制剂KRIBB11处理细胞,运用Transwell迁移和侵袭实验、划痕实验及F-肌动蛋白染色实验,分析HSF1在HBx促进HCC细胞迁移和侵袭中的作用;运用GEO数据集和HCMDB数据库分析HSF1的下游靶点,并鉴定下游靶点c-Myb在HSF1介导HBx促进HCC进展中的作用。结果:HBx上调HSF1蛋白质水平而对其mRNA水平无明显影响,HBx通过增强HSF1的蛋白稳定性促进其表达;HSF1在HBV相关性肝癌组织中高表达,HSF1高表达与肝癌分期分级、患者不良预后相关;HBx过表达明显促进Huh7和MHCC97H细胞的迁移、侵袭、划痕愈合能力和伪足形成能力,而HSF1敲减或KRIBB11处理显著减弱HBx促进HCC细胞迁移和侵袭;HSF1促进转移相关蛋白c-Myb的表达,在HSF1敲减的HCC细胞中过表达c-Myb恢复HBx对HCC细胞迁移和侵袭的促进作用。结论:HBx增强HSF1蛋白稳定性并促进其表达,HSF1上调c-Myb在HBx促进HCC细胞迁移和侵袭中发挥重要作用,靶向HSF1可能有助于减缓HBV相关性HCC进展。

Abstract

Objective To investigate the role of heat shock transcription factor 1（HSF1） in hepatitis B virus X protein（HBx）-driven migration and invasion of hepatocellular carcinoma（HCC） cells，and to preliminarily explore the mechanism of HSF1 mediating HBx-driven HCC progression. Methods 4D label-free quantitative proteomics and Western blot were used to analyze the effect of HBx on HSF1 expression. HBx was overexpressed in the HCC cell lines Huh7 and MHCC97H，and its impact on the mRNA and protein levels and stability of HSF1 was assessed by RT-PCR and Western blot. The Cancer Genome Atlas database was used to analyze the expression of HSF1 in hepatitis B virus（HBV）-associated HCC tissues and its relationship with tumor stage/grade and patient prognosis，and Western blot was used to measure the expression of HSF1 in HBV-associated HCC tissues. HBx was overexpressed in HCC cells，followed by HSF1 knockdown or cell treatment with the HSF1 inhibitor KRIBB11，and Transwell migration and invasion assay，scratch assay，and F-actin staining experiment were performed to analyze the role of HSF1 in HBx-driven HCC cell migration and invasion. GEO and HCMDB datasets were used to identify the downstream target of HSF1，and the role of downstream target c-Myb in HSF1-mediated HBx-driven HCC progression. Results HBx upregulated HSF1 protein levels without significantly affecting its mRNA expression，through enhancing HSF1 protein stability. HSF1 was highly expressed in HBV-associated HCC tissues，and its elevated expression correlated with tumor stage/grade and poor prognosis. HBx overexpression significantly promoted the migration，invasion，wound-healing capacity，and pseudopodia formation capacity of Huh7 and MHCC97H cells，while HSF1 knockdown or KRIBB11 treatment significantly attenuated the HBx-driven migration and invasion of HCC. HSF1 promoted the expression of the metastasis-associated protein c-Myb，and c-Myb overexpression in HSF1-knockdown HCC cells restored the promotive effect of HBx on HCC cell migration and invasion. Conclusion HBx enhances HSF1 protein stability to promote its expression. Upregulation of c-Myb by HSF1 plays a pivotal role in HBx-driven HCC cell migration and invasion. Targeting HSF1 may help to delay the progression of HBV-associated HCC.

关键词

热休克转录因子1 / 乙型肝炎病毒X蛋白 / 肝细胞癌 / 迁移 / 侵袭

Key words

heat shock transcription factor 1 （HSF1） / HBx / hepatocellular carcinoma （HCC） / migration / invasion

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命健康^[1]。近年来虽然早期诊断技术和外科治疗技术有一定提高，但是HCC患者行根治性手术后的5年死亡率仍高达40%~60%，高复发转移率是HCC致死的主要原因^[2]。在中国，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染被认为是HCC发生的主要致病因素之一^[3]，其中HBV编码的乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）在HCC的发生与进展中发挥着至关重要的作用^[4]。HBx通过参与细胞信号转导^[5]、细胞氧化应激、细胞凋亡、DNA修复、基因组不稳定性等过程^[6]，对HCC细胞的增殖、凋亡、转移、侵袭等发挥重要的调控作用^[7]。研究发现，HBx在HCC细胞生长中发挥双向调控作用，既可以通过抑制肿瘤抑制蛋白p53引起的细胞凋亡，干扰细胞周期，激活磷脂酰肌醇3-激酶通路、抑制糖原合成酶激酶3β活性等促进细胞增殖^[8]；也可通过提高细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度，促进释放细胞色素C，抑制Bcl-2家族，激活p38和JNK信号通路诱导细胞凋亡^[9]。因此，HBx在HBV相关性肝癌发生发展过程中体现出促凋亡和抑制凋亡交替的矛盾作用，而HBx在促进肝癌细胞转移过程中的作用更为明确。HBx主要通过诱导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、促进基质金属蛋白酶产生、细胞骨架重排和伪足突起的发育^[9]以及激活细胞表面粘附分子CD44^[10]等多种抑制增强HCC细胞的侵袭转移能力。基于肝癌细胞转移是HCC高致死率的主要原因，进一步理解HBx促转移的作用机制，对于发展新的治疗手段，降低HCC死亡率具有重要的意义。

热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）是一种普遍表达的转录因子，在正常细胞中处于潜伏状态，而细胞暴露于应激因素时，HSF1则被激活，诱导产生热休克蛋白（heat shock protein，HSP），保持蛋白质稳态，在肿瘤增殖、迁移、侵袭等方面发挥重要作用^[11]。有意思的是肿瘤细胞也可通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶激活HSF1^[12]。研究发现，HSF1可通过促进转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）和C-X-C基序趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）（SDF-1）的表达，诱导EMT转化，与精氨酸结合蛋白相互作用重塑细胞骨架增强癌细胞迁移能力等机制促进癌细胞转移侵袭^[13]。此外，HSF1也可通过促进HSP27的表达和磷酸化促进HCC的侵袭和转移^[14]。而HSF1在HBx诱导的肝癌侵袭转移过程中作用的研究报道还十分少见。本研究基于4D Label-free定量蛋白质组学和Western blot分析发现HBx可促进HSF1的表达，进一步阐明了HSF1在HBx促进HCC细胞迁移和侵袭中的作用，分析了靶向HSF1是否拮抗HBx的作用，初步探讨了HSF1介导HBx促进HCC细胞迁移和侵袭的分子机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本、细胞、质粒及siRNA

组织标本：人HBV相关肝癌组织及非HBV相关肝癌组织来源于重庆医科大学第一附院，本研究方案通过重庆医科大学医学研究伦理委员会审批同意（审批编号：2024131）。

人肝癌细胞系HCCLM3购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所；人肝癌细胞系Huh7购自中国科学院上海细胞库；人肝癌细胞系MHCC97H购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所。

pcDNA3.1-2×HA-HBx由复旦大学基础医学院陈捷亮教授馈赠并由本实验室长期保存；HBV表达质粒pCH9/3091、乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎病毒多聚酶（hepatitis B virus polymerase，HBp）、乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）表达质粒由本实验室长期保存；将c-Myb基因插入到pcDNA3.1 His/Myc质粒（Invitrogen公司，美国Carlsbad）中，构建c-Myb过表达质粒。

针对HSF1基因的特异性siRNA序列及HSF1、c-Myb、S100A9、TSPAN8等引物由北京擎科生物科技股份有限公司设计合成和纯化（表1和2）。

1.2 试剂

DMEM培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清购自上海双洳生物科技有限公司；青霉素-链霉素购自美国Gibco公司；Lipofectamine™3000转染试剂（Lipo-fectamine™ 3000 Transfection Reagent）购自美国Invitrogen公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购自美国MCE公司；PVDF膜购自美国GE公司；化学发光底物ECL购自德国Millipore公司；8 μm Transwell小室、8μm侵袭小室购自美国Corning公司；结晶紫染料购自美国Sigma公司；HSF1抑制剂KRIBB11购自美国MCE公司（货号：HY-100872）；CHX（Cycloheximide）购自德国Selleck公司（货号：S7418）；HSF1抗体、HA抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司（货号：51034-1-AP、66006-2-Ig）；GAPDH抗体购自北京中山金桥生物技术有限公司（货号：TA-08）；c-Myb抗体购自英国Abcam公司（货号：ab109127）。DyLight 488 Phalloidin购自美国CST公司（货号：12935S）；引物自行设计并由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

Huh7细胞、MHCC97H细胞均培养于DMEM培养（含10%胎牛血清和1%的青-链霉素），培养于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中。

1.3.2 细胞转染

在Huh7细胞系、MHCC97H细胞系中进行质粒及siHSF1转染。取对数生长期的Huh7细胞、MHCC97H细胞分别以2×10⁵个/孔、3×10⁵个/孔的密度接种于12孔板中，待细胞融合度达到70%~90%时，进行细胞转染。提前30~60 min更换无血清培养基，并按照Lipofectamine™ 3000转染试剂盒说明书进行转染，转染8 h 后更换新鲜培养基。

1.3.3 Western blot实验

提取细胞总蛋白质，BCA法检测蛋白质的浓度。取30 μg的蛋白质用10%的SDS-PAGE 分离，然后在90 V恒压下进行湿转，将蛋白质转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h后加入HSF1（1∶7 000）、HA-HBx（1∶3 000）、GAPDH（1∶10 000）等一抗，4 ℃孵育过夜。第2天用1×TBST洗去游离抗体，加入HRP标记的山羊抗小鼠（1∶5 000）或山羊抗兔IgG（1∶3 000）二抗，室温孵育2 h；1×TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显影，以GAPDH为内参。

1.3.4 细胞活力测定

将处理好的Huh7细胞和MHCC97H细胞分别以每孔1×10³个细胞的密度接种在96孔板中，每组3个孔。培养至相应时间后 ，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h。使用酶标仪在450 nm处测定吸光度（absorbance，A）值。

1.3.5 Transwell迁移/侵袭实验

使用8 μm Transwell小室、8 μm侵袭小室进行实验，分别将2×10⁵个Huh7细胞和1×10⁵个MHCC97H细胞培养在无血清培养基的小室内，小室外加入含10%胎牛血清的培养基。培养20~24 h后取出，用甲醇室温固定小室30 min后结晶紫染色10 min，清洗小室并将小室内部的细胞拭去后于显微镜下拍照记录，随机选取6个区域进行细胞计数。

1.3.6 划痕实验

将密度为90%的Huh7细胞和MHCC97H细胞铺于6孔板中，待细胞贴壁并形成均匀单层细胞后，使用200 μL无菌移液器尖端在单层细胞表面制造划痕伤口，分别于划痕后0 h和48 h在Incucyte ZOOM活细胞成像仪中拍摄细胞图像并使用ImageJ对伤口宽度进行量化，计算细胞迁移率。

1.3.7 F-肌动蛋白染色和丝状伪足分析

细胞以3×10⁴个/孔的密度接种于黏附的载玻片上，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h。随后使用PBS冲洗，再使用4%多聚甲醛固定细胞。用含0.1%TritonX-100的PBS洗涤3次后，在室温避光条件下使用鬼笔环肽（Actin-Tracker Green- phalloidin）进行F-actin染色15 min，使用DAPI进行细胞核复染。使用激光共聚焦显微镜成像。使用Image J对细胞丝状伪足进行定量分析。

1.4 统计学方法

统计学分析采用Graphpad Prism 9.5软件进行，计量资料以均数±标准差（x±s）的形式呈现。2组数据比较采用两独立样本t检验。数据来自至少3个独立重复实验的结果。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 HBx可能通过增强HSF1蛋白质稳定性增加其表达水平

为了进一步阐明HBx促进HCC进展的作用机制，本研究运用4D Label-free定量蛋白质组学分析了HBx过表达细胞与对照组细胞中的差异蛋白质，结果显示341个蛋白差异表达，其中经过HBx处理后表达水平上调的蛋白有201个（图1A），针对上调水平最高的前10个蛋白（B3GNT2、SYNE1、SIL1、GOLPH3L、IFT122、CEP192、PUDP、LTBR、HSF1、CLK3）进行验证，Western blot结果显示过表达HBx后，HSF1、CEP192、PUDP等蛋白质水平上调，其中HSF1表达水平升高最为明显（图1B），并且HSF1对多种肿瘤的进展具有促进作用。因此，本课题组聚焦到HSF1以进一步研究HBx促进HCC进展的作用机制。随后，在Huh7细胞系及MHCC97H细胞系中过表达HBx后检测其HSF1 mRNA及蛋白的表达水平，PCR结果显示过表达HBx后Huh7和MHCC97H细胞中HSF1 mRNA的表达水平无明显变化（图1C），Western blot结果显示过表达HBx后Huh7细胞和MHCC97H细胞中HSF1蛋白质明显升高（图1C）。进一步，用CHX处理细胞，Western blot实验结果显示，HBx过表达明显降低HSF1的降解速率，表明HBx表达增加了HSF1蛋白质稳定性（图1D）。此外，也在Huh7细胞中过表达HBV质粒pCH9/3091并检测HSF1蛋白质水平，结果显示HBV表达HBV导致HSF1蛋白质水平明显升高（图1E），而在Huh7细胞中过表达HBs、HBp、HBc表达质粒对HSF1蛋白质水平均无明显影响（图1F）。这部分结果表明在HBV表达肝癌细胞中，HBx可能通过增强HSF1蛋白质稳定性增加其表达水平。

2.2 HSF1在HBV相关HCC中高表达

接着分析了HSF1在肝癌组织中的表达水平及其与临床病理参数的相关性。TCGA数据库分析结果显示，HSF1在HCC组织中高表达（图2A），HSF1高表达与肿瘤的分期（图2B）、分级（图2C）、不良预后（图2D）呈正相关，提示HSF1是HCC进展的危险因素。进一步收集了10例HBV相关肝癌组织及10例非HBV相关肝癌组织，Western blot检测结果显示，HSF1在HBV相关肝癌组织中的蛋白水平显著高于非HBV相关肝癌组织（图2E，P<0.001）。这些数据表明，HBV感染能够增加HCC组织中HSF1的表达水平，HSF1表达增加可能进一步加重HCC进展。

2.3 HSFI敲减减弱HBx对HCC细胞的迁移和侵袭能力

进一步，研究了HSF1在HBx促进HCC进展中的作用。首先在Huh-7和MHCC97H细胞中转染了HBx表达质粒和靶向HSF1的siRNA，Western blot验证了HBx的表达效率和HSF1的敲减效率（图3A）。在此基础上，运用细胞骨架染色实验发现，与对照组相比，HBx表达明显增加HCC细胞伪足形成的数量，而同时敲减HSF1明显减少了表达HBx的HCC细胞伪足数量（图3B，P<0.001）；划痕实验表明，与对照组相比，HBx表达增强了HCC细胞的划痕愈合能力，同时敲减HSF1减弱了表达HBx肝癌细胞的划痕愈合能力（图3C，P<0.001）；Transwell实验结果表明，与对照组相比，HBx表达增强了HCC细胞的迁移和侵袭能力，同时敲减HSF1减弱了表达HBx的HCC细胞迁移和侵袭能力（图3D，P<0.001）。这部分的结果表明HSF1敲减明显减弱HBx对HCC细胞迁移和侵袭能力的促进作用。

2.4 HSFI抑制剂减弱HBx对HCC细胞的迁移和侵袭能力

KRIBB11是一种靶向HSF1的小分子抑制剂，首先对Huh-7和MHCC97H细胞用不同浓度的KRIBB11处理，通过CCK8实验检测了KRIBB11的细胞毒性，结果显示KRIBB11在Huh-7细胞中的CC50值为8.59 μmol/L，在MHCC97H细胞中的CC50值为13.96 μmol/L（图4A）。接着，在Huh-7和MHCC97H细胞中转染了HBx表达质粒并用4 μmol/L KRIBB11处理细胞，Western blot检测了细胞中HSF1和HBx的蛋白质水平（图4B）；细胞骨架染色实验分析发现，与对照组相比，HBx表达明显增加HCC细胞伪足形成的数量，而KRIBB11处理明显减少了表达HBx的肝癌细胞伪足数量（图4C，P<0.001）；划痕实验表明，与对照组相比，HBx表达增强了HCC细胞的划痕愈合能力，KRIBB11处理减弱了表达HBx肝癌细胞的划痕愈合能力（图4D，P<0.001）；Transwell实验结果表明，与对照组相比，HBx表达增强了HCC细胞的迁移和侵袭能力，KRIBB11处理减弱了表达HBx的HCC细胞迁移和侵袭能力（图4E，P<0.001）。这部分的结果表明HSF1抑制剂明显减弱了HBx对HCC细胞迁移和侵袭能力的促进作用，提示靶向HSF1可缓解HCC的进展。

2.5 HSF1可能通过c-Myb介导HBx对HCC进展的促进作用

GEO数据集GSE274408包括在Huh7细胞中通过RNA干扰沉默HSF1后的基因表达谱，为了初步阐明HSF1介导HBx促HCC进展的分子机制，对该数据集进行差异表达基因分析，与对照组相比，813个基因在siHSF1-1和siHSF1-2组差异表达（图5A），其中均表达下调的基因213个（图5B）。同时，从HCMDB数据库中下载了与肝细胞癌（HCC）转移相关的基因数据，将这2个数据集进行合并分析，得到26个基因。通过文献查阅，发现其中13个基因在肝癌的进展中发挥促进作用（图5C）。进一步，通过细胞实验验证了HSF1对上述13个基因表达水平的影响，发现Huh-7细胞中HSF1过表达明显上调了CRYAB、c-Myb、PLAUR等7个基因的表达。为了初步判断这7个基因在HSF1介导HBx促HCC细胞迁移和侵袭中的作用，在Huh-7细胞中过表达HBx，仅发现c-Myb、S100A9、TSPAN8的表达水平明显上调（图5D）。有研究表明，c-Myb是HBx的靶基因之一，在促进与肝癌的恶性进展密切相关，因此，推测c-Myb可能在HSF1介导HCC进展中发挥重要作用。接着，在转染了HBx表达质粒和靶向HSF1的siRNA，Western blot检测发现HBx表达明显增加c-Myb的蛋白质水平，而同时敲减HSF1则减弱了HBx对c-Myb的蛋白质水平的促进作用（图5E）。此外，在表达HBx的细胞中敲减HSF1并过表达c-Myb，Western blot验证了HSF1的敲减效率和c-Myb的过表达效率（图5F），Transwell实验结果表明敲减HSF1减弱了HBx对HCC细胞的迁移和侵袭能力，而过表达c-Myb恢复了HBx对HCC细胞的迁移和侵袭能力的促进作用（图5G，P<0.001）。

3 讨 论

在我国，HBV感染是HCC发生发展的主要危险因素，而HBx在HBV诱导的HCC发病机制中发挥重要作用^[15]。HBx通过多种机制促进HCC的进展。一方面，HBx基因整合到宿主染色体中明显影响基因组稳定性，干扰与HCC相关基因的表达^[16]；另一方面，HBx通过转录激活机制^[17]、DNA甲基化^[18]、组蛋白表观修饰^[19]、泛素-蛋白酶体系统调控^[20]等调节致癌基因或抑癌基因的表达。同时，HBx还能够诱导肝细胞氧化应激^[21]、细胞凋亡^[22]和DNA修复等促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在本研究中，采用4D无标记定量蛋白质组学分析受HBx调控的蛋白质，结合Western blot实验验证，发现过表达HBx后显著上调了HSF1的蛋白表达水平，而对其mRNA水平无明显的影响。进一步通过蛋白稳定性实验证明HBx过表达增强了HSF1的蛋白质稳定性。已有研究表明HBx通过泛素化和苏木化修饰等多种机制介导蛋白质稳定调控并参与HCC进展。HBx诱导染色体结构维持复合物5/6泛素化降解损害同源重组介导的DNA损伤修复促进HCC的发生^[23]；HBx通过抑制E3泛素连接酶复合物DDB1/Cullin-4与WD重复结构域蛋白5（WD Repeat Domain 5，WDR5）相互作用增强WDR5的稳定性发挥促HCC作用^[24]；此外，HBx也可通过增加SH3结构域蛋白1的小类泛素修饰化稳定人类表皮生长因子受体2蛋白并促进肝癌细胞的生长和迁移^[25]。这些研究揭示了泛素化和苏木化修饰在HBx促进HCC进展中的重要作用，然而HBx通过何种途径增强HSF1的蛋白质稳定性还需要进一步的研究。

HSF1是热休克反应的主要调节因子，在肿瘤的生长、侵袭和迁移等方面发挥了重要的作用。在本研究中，发现HSFI的敲减明显减弱了HBx所诱导的HCC细胞迁移和侵袭能力的增加，表明HSF1部分介导了HBx的促进HCC进展的作用。在肿瘤细胞中，HSF1处于激活状态，激活的HSF1可通过上调乳酸脱氢酶A^[26]、丙酮酸激酶2^[27]、细胞周期蛋白Cyclin D1的表达^[28]促进癌细胞增殖。在促进癌细胞转移能力方面，HSF1通过增加TGF-β表达诱导癌细胞上皮间充质转化^[29]；激活E2F转录因子家族促进肺腺癌脑转移^[30]；与蛋白质精氨酸甲基转移酶5相互作用通过调控组蛋白甲基化修饰促进淋巴增强子结合因子1、基质金属肽酶9等因子的上调促进膀胱癌转移^[31]。这些研究揭示HSF1可通过上调多种致癌基因的表达促进肿瘤的进展。在本研究中，结合数据库分析与细胞功能实验发现HSF1上调了c-Myb的mRNA和蛋白水平，HSF1介导了HBx对c-Myb的促进作用。c-Myb是细胞中重要的转录因子，对多种肿瘤的进展具有促进作用。与本课题组的发现一致的是，已有研究发现c-Myb可通过增强骨调素或非编码RNA SNHG10 和SCARNA13的表达在HCC细胞的迁移和侵袭过程中发挥促进作用^[32]。本研究进一步的研究结果表明c-Myb过表达恢复了HSF1敲减HCC细胞的迁移和侵袭能力，初步揭示了HBx/HSF1/c-Myb促进HCC进展的作用。HSF1是细胞应激反应信号传导的主要调节因子。HSF1的传统作用主要是结合在热休克反应基因启动子区域的热休克元件激活热休克蛋白家族的转录以保护细胞免受蛋白毒性应激诱导的损伤^[33]。近年来，新的证据表明HSF1也可与多种蛋白相互作用调控基因的转录。研究发现HSF1在非应激条件下与c-MYC/MYC-相关因子X复合物相互作用，从而促进c-MYC的转录活性^[34]；HSF1与PRMT 5相互作用，影响组蛋白甲基化并调控多种癌基因的表达^[31]；HSF1招募乙酰基转移酶P300增强LINC00857表达^[35]；HSF1与p53形成复合物，增强其转录活性，调控p21的动态变化^[36]。下一步需要鉴定HSF1是否直接结合于c-Myb启动子区域激活其转录或者通过与其他蛋白相互作用间接促进其表达，以阐明HSF1促进c-Myb表达的分子机制。

此外，本研究还发现HSF1抑制剂KRIBB11处理明显减弱了HBx对HCC进展的促进作用，表明了HSF1作为靶点在抗HBV相关性HCC方面的潜在价值。与本研究的发现一致的是靶向HSF1在多种肿瘤中同样具有较好的应用前景，如NXP800直接作用于HSF1导致多发性骨髓瘤凋亡^[37]；CCT251236抑制HSF1转录缓解卵巢癌进展^[38]；KNK437靶向AKT/HSF1抑制乳腺癌、结肠癌生长等^[39]。然而HSF1抑制剂在临床应用中都有其局限性。HSF1在应激状态下的癌细胞和正常细胞中都发挥着重要作用。抑制HSF1在发挥抗癌作用的同时对正常细胞不应具有毒性。因此，对于其在癌症治疗中的应用来说，需要对现有靶向HSF1化合物进行结构改造以使其特异性地识别和靶向癌细胞，并对正常细胞的细胞毒性作用最小化，例如，通过改变官能团/基序的合成方法，或者发现和分离能够克服潜在脱靶问题的新天然产物等。

本研究发现HBx通过增强HSF1蛋白稳定性促进其表达，HSF1进一步激活c-Myb的表达，从而促进HCC细胞的迁移和侵袭，HSF1抑制剂KRIBB11能够缓解HBx诱导的HCC的进展。综上，本研究揭示了HBx/HSF1/c-Myb调控轴在HCC细胞迁移和侵袭中的作用，为干预HBV相关性肝癌的进展提供了潜在的靶点。然而，本研究仍需要解决以下不足之处：①HBx增强HSF1蛋白质稳定性的分子机制有待阐明；②HSF1激活c-Myb表达的作用机制需要进一步解析；③需在动物模型中验证KRIBB11减缓HBx诱导的肝癌进展，以为明确HBx/HSF1/c-Myb调控轴在HCC进展中的重要作用提供理论和实验支撑。

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基金资助

重庆市自然科学基金面上资助项目(CSTB2022NSCQ-MSX0864)