毛蕊异黄酮减轻IL-1β引起的软骨细胞炎症损伤和纤维化

Calycosin alleviates IL-1β-induced chondrocyte inflammatory injury and fibrosis

摘要

目的 探究毛蕊异黄酮在软骨细胞炎症损伤和软骨分化进程中的作用，以期为软骨损伤相关疾病的治疗提供理论基础和可用药物证据。 方法 碘乙酸用于骨关节炎（osteoarthritis，OA）小鼠模型的制备并从构建的OA模型小鼠中分离骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）；白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）用于诱导ATDC5软骨细胞炎性损伤；酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞中炎性因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的水平；商业试剂盒检测细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；流式细胞术检测细胞凋亡水平；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测细胞活力；实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western blot检测细胞中成软骨标志物、肥大型软骨标志物、纤维化软骨标志物和成骨标志物的表达。 结果 与对照组相比，毛蕊异黄酮干预组细胞活力和细胞凋亡水平无显著差异（P>0.05）。IL-1β处理后细胞活力显著降低（P<0.05），IL-6和TNF-α的含量显著上调（P<0.05），ROS水平显著升高（P<0.05）。经毛蕊异黄酮处理后，细胞活力显著升高（P<0.05），IL-6和TNF-α的含量显著降低（P<0.05），ROS水平显著降低，且呈浓度依赖性（P<0.05）。IL-1β处理后Collagen Ⅱ、SOX9和Aggrecan的表达降低（P<0.05），Collagen X和MMP-13和Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表达升高（P<0.05）。毛蕊异黄酮进一步处理后，Collagen Ⅱ、SOX9和Aggrecan的表达显著升高（P<0.05），Collagen X和MMP-13和Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表达显著降低。与对照组相比，OA组小鼠BMSCs中ALP和RUNX2表达显著下调（P<0.05），肥大型软骨标志物表达显著升高（P<0.05）。毛蕊异黄酮处理后，病理学改变有所缓解，且BMSCs中成软骨化标志物和成骨标志物表达显著上调（P<0.05），肥大型软骨标志物表达显著降低（P<0.05）。 结论 毛蕊异黄酮减轻了IL-1β引起的软骨细胞炎症反应，降低了纤维化表型的表达，并促进BMSCs的成软骨分化，抑制成骨分化。

Abstract

Objective To investigate the role of calycosin in chondrocyte inflammatory injury and cartilage differentiation，and to provide a theoretical basis and available drugs for the treatment of cartilage injury-related diseases. Methods Iodoacetic acid was used to establish a mouse model of osteoarthritis（OA），and bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs） were isolated from OA model mice. Interleukin-1β（IL-1β） was used to induce inflammatory injury of ATDC5 chondrocytes；ELISA was used to measure the levels of the inflammatory factors interleukin-6（IL-6） and tumor necrosis factor-α（TNF-α） in cells，and commercial kits were used to measure the level of reactive oxygen species（ROS） in cells；flow cytometry was used to measure the level of cell apoptosis；CCK-8 assay was used to measure cell viability；qRT-PCR and Western blot were used to measure the expression levels of chondrogenic markers，hypertrophic cartilage markers，fibrous cartilage markers，and osteogenic markers in cells. Results There were no significant differences in cell viability and apoptosis level between the control group and the calycosin intervention group（P>0.05）. After IL-1β treatment，there was a significant reduction in cell viability（P<0.05） and significant increases in the content of IL-6 and TNF-α（P<0.05） and the level of ROS（P<0.05）. After calycosin treatment，there was a significant increase in cell viability（P<0.05） and significant reductions in the content of IL-6 and TNF-α（P<0.05） and the level of ROS（P<0.05） in a concentration-dependent manner. After IL-1β treatment，there were significant reductions in the expression levels of Collagen Ⅱ，SOX9，and Aggrecan（P<0.05） and significant increases in the expression levels of Collagen X，MMP-13，Collagen Ⅰ，and Collagen Ⅲ（P<0.05）. After further treatment with calycosin，there were significant increases in the expression levels of Collagen Ⅱ，SOX9，and Aggrecan（P<0.05） and significant reductions in the expression levels of Collagen X，MMP-13，Collagen I，and Collagen Ⅲ. Compared with the control group，the OA group had significant reductions in the expression levels of ALP and RUNX2 in BMSCs（P<0.05） and significant increases in the expression levels of hypertrophic cartilage markers（P<0.05）. The alleviation of pathological changes was observed after calycosin treatment，with significant increases in the expression levels of chondrogenic markers and osteogenic markers and significant reductions in the expression levels of hypertrophic cartilage markers in BMSCs（P<0.05）. Conclusion Calycosin alleviates inflammatory response of chondrocytes induced by IL-1β，reduces the expression of fibrotic phenotype，promotes the chondrogenic differentiation of BMSCs，and inhibits the osteogenic differentiation of BMSCs.

Graphical abstract

关键词

毛蕊异黄酮 / 骨关节炎 / 软骨分化 / 软骨细胞 / 骨髓间充质干细胞

Key words

calycosin / osteoarthritis / cartilage differentiation / chondrocyte / bone marrow mesenchymal stem cell

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是全球最常见的关节疾病之一，其显著特征包括关节软骨的逐步退化、继发性滑膜炎和骨重建^[1]。炎症相关分子，尤其是白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），在OA的病理生理学中起到了关键的作用^[2]。目前，临床上OA的治疗以手术和药物治疗为主。其中，手术治疗主要针对重度关节炎患者，而对于轻度及中度的OA患者，主要采用药物治疗从而达到抗炎、消肿、止痛以及恢复关节功能的效果^[3]。研究表明，长期使用一些OA治疗药物会导致患者机体产生不良反应^[4]，因此，全球对于补充和替代药物的接受度正在逐渐上升，同时随着中药在OA中的应用不断增加，从而使OA的中药治疗日益受到临床的关注。

毛蕊异黄酮主要来源于豆科植物，特别是蒙古黄芪的干燥根。此外，毛蕊异黄酮还存在于其他豆科植物中，如黄芩和甘草等^[5-6]。多项研究报道，毛蕊异黄酮具有多种药理作用，包括抗氧化、抗肿瘤、抗细胞凋亡、抗炎以及促进血管生成的特性^[7-9]。研究表明，毛蕊异黄酮对软骨炎性和损伤具有抑制作用^[10-12]，但毛蕊异黄酮在软骨分化过程中的作用研究却鲜有报道。因此本研究旨在探究毛蕊异黄酮在关节软骨分化进程中的作用，以期为软骨损伤相关疾病的治疗提供理论基础和可用药物证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

30只C57BL/6雄性小鼠，12周龄，24~26 g，购于中国医学科学院医学实验动物研究所，动物饲养于温度为（22±3）℃，相对湿度约（39±3）%，12 h/12 h昼夜交替的清洁环境中。本实验按伦理委员会关于实验动物饲养和使用的原则进行，并审核通过。

1.1.2 细胞

ATDC5小鼠成软骨细胞系由东北农业大学兽医外科教研室提供，培养基为DMEM/F12，于37 ℃和5% CO₂的培养箱中进行培养。

1.1.3 主要试剂

毛蕊异黄酮（纯度：98%，上海户实医药科技有限公司）；1%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基补充剂（ITS）（美国Sigma，货号：11074547001）；10%胎牛血清（以色列BI，货号：04-010-1A）；DMEM/F12 培养基（美国Gibco，货号：SH3002302）；胰蛋白酶-EDTA（美国Thermo Fisher，货号：25200114）；PBS（中国索莱宝，货号：P1020）；ECL化学发光试剂盒（中国Vazyme，货号：E423-01/02）；trizol试剂（Invitrogen公司，批号：15596026）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Scientific，批号：K1621）；1%青霉素-链霉素、CCK8试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、脱脂奶粉和SDS-PAGE凝胶超快速配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：ST448S、C0038、P0013C、P0011、P0216和P0690）；Collagen Ⅰ抗体、Collagen Ⅱ抗体、Collagen Ⅲ抗体、Collagen X抗体和β-actin抗体（北京博奥森生物科技有限公司，货号：bsm-52478R、bs-10589R、bsm-33129M、bs-0554R和bsm-33036M）；Aggrecan抗体、SOX9抗体、MMP-13抗体和RUNX2抗体（Abcam，英国，货号：ab3778、ab185966、ab39012和ab236639）；ALP抗体（上海康朗生物科技有限公司，货号：kl472Mu01）；山羊抗小鼠-IgG抗体（北京Lablead公司，货号：S0100）；ROS检测试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，货号：50101ES01）；ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-M0044c、E-EL-M3063）。

1.1.4 主要仪器

双目正置荧光显微镜（BX-51，日本奥林巴斯）；蛋白电泳装置（Mini-PROTEAN Tetra型，美国Bio-Rad公司）；全波长酶标仪（EPoch型，美国BioTek公司）；化学发光凝胶成像仪（ChemiDoc XRS，美国Bio-Rad公司）；流式细胞仪（FACS Calibur，美国BD公司）；SW-CJ-1FD型超净工作台（苏净安泰公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及处理

将小鼠随机分为对照组、模型（OA）组和药物处理（OA+毛蕊异黄酮）组，每组10只。给药方式参考钟宇辰等^[13]方法进行小鼠OA模型制备及药物处理：模型组和（OA+毛蕊异黄酮）组小鼠给予戊巴比妥钠麻醉后剔除右侧膝关节处毛发，将0.2 mg碘乙酸溶于10 μL磷酸盐缓冲液中注入膝关节腔；随后，模型组小鼠给予1 mL/d生理盐水灌胃，（OA+毛蕊异黄酮）组灌胃毛蕊异黄酮200 mg/（kg·d），均持续4周；对照组小鼠制备OA假模型：给予戊巴比妥钠麻醉后剔除右侧膝关节处毛发，膝关节腔注入10 μL磷酸盐缓冲液，并给予1 mL/d生理盐水灌胃，持续4周。4周后小鼠脱颈处死、浸入75%乙醇5 min、转置无菌培养皿中，以便后续实验。

1.2.2 BMSCs的获取及处理

从经药物和手术处理的小鼠双侧髋臼处离断双下肢，待分离后先后在75%乙醇、无菌PBS中充分漂洗3次，每次5 min；剔除股骨、胫骨上肌肉及结缔组织。用无菌剪分离股骨及胫骨、剪去骨骺并暴露骨髓腔。用1 mL无菌针头插入骨髓腔中，用骨髓间充质干细胞培养基缓慢冲洗，将含有红色骨髓细胞的骨髓冲洗液置于培养皿中，此部分方法参考前人研究^[14]。将收集的细胞悬液用70 μm孔径滤网过滤后置于加入1 mL骨髓间充质干细胞培养基的6 孔培养板中，放入37 ℃，5% CO₂细胞培养箱中培养。24 h后更换培养基去除未贴壁细胞;每48~96 h更换1次培养基。试验分为对照组、OA组、OA+毛蕊异黄酮组。

1.2.3 ATDC5细胞培养及分组

将ATDC5细胞置于37 ℃和5% CO₂的培养箱中进行培养，并配制含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% ITS的DMEM/F12培养基。在细胞达到80%融合时，用胰蛋白酶-EDTA消化细胞传代。添加ITS诱导ATDC5细胞分化为软骨细胞^[15]。试验分为对照组、IL-1β组（10 ng/mL）、IL-1β+毛蕊异黄酮组。

1.2.4 细胞凋亡的检测

选取处理后的对数生长期细胞，采用预冷的PBS洗涤3次，加入500 μL PBS重悬，加入5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和5 μL碘化丙啶，室温孵育10 min，然后采用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 细胞活力的检测

将对数期的细胞接种于96孔板（1×10⁷个/L），24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，2 h后用酶标仪检测450 nm处吸光度值。每个样本3个复孔，重复3次。

1.2.6 qRT-PCR

采使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA并测量其纯度和浓度。随后，根据说明书使用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应。以β-actin为内参，2^-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.2.7 ELISA

空白孔加入细胞培养基，样本孔加检测缓冲液和待测细胞样本，每组3个重复检测样本。按照ELISA试剂盒说明书进行操作。在30 min内采用酶标仪测定450 nm波长。

1.2.8 ROS含量检测

取生长状态良好的细胞铺于6孔板中，待细胞密度为60%~70%时，按照分组处理。

将DCFH-DA探针用PBS稀释至10 μmol/L，然后加入细胞悬液中，37 ℃避光孵育30 min。再次用PBS洗涤细胞，以去除未进入细胞的探针。将处理好的细胞悬液上机进行流式细胞术检测。

1.2.9 Western blot

将细胞接种于96孔板中，使用胰蛋白酶裂解，离心收集上清液。根据说明书使用BCA试剂盒检测蛋白质的浓度。随后，进行10%的SDS-PAGE电泳，完成后，将蛋白质转移到PVDF膜上。转膜完成后，将PVDF膜放入含有5%脱脂牛奶中，室温封闭2 h。将封闭好的膜放入稀释好的一抗溶液中，4 ℃过夜孵育。随后，将膜放入稀释好的二抗溶液中，室温下孵育2 h。结束后，将发光液均匀的涂抹在PVDF膜表面，进行发光显影。

1.2.10 HE染色

依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10 min，二甲苯Ⅱ 10 min，无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，95%乙醇Ⅰ 5 min，95%乙醇Ⅱ 5 min，蒸馏水洗。切片入苏木精染3~8 min，自来水洗，1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色1~3 min。将切片依次放入95%乙醇Ⅱ 5 min，95%乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，无水乙醇Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min，二甲苯Ⅰ 5 min中脱水透明，将切片从二甲苯中取出并晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0进行数据分析，试验数据（n≥3）均采用均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示。组间采用单因素方差分析，2组间采用t检验。柱状图作图软件为GraphPad Prism 9。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 毛蕊异黄酮对OA软骨细胞的细胞活力、炎性因子及ROS水平的影响

与对照组相比，不同浓度的毛蕊异黄酮处理对ATDC5细胞活力和细胞凋亡水平差异无统计学意义（图1A、B，P>0.05）。IL-1β处理的ATDC5细胞中，细胞活力显著降低，炎性因子IL-6和TNF-α的含量显著上调，ROS水平显著升高。经毛蕊异黄酮干预后，与模型组相比，毛蕊异黄酮各剂量组的ATDC5细胞中细胞活力显著升高，炎性因子IL-6和TNF-α的含量显著下调，ROS水平显著降低，且呈一定的剂量依赖性（图1C~F，P<0.05）。

2.2 毛蕊异黄酮抑制IL-1β引起的软骨细胞肥大及纤维化表型

与对照组相比，IL-1β组ATDC5细胞中成软骨化标志物Collagen Ⅱ、SOX9和Aggrecan的mRNA表达水平显著降低，经毛蕊异黄酮干预后，Collagen Ⅱ、SOX9和Aggrecan的mRNA表达水平显著上调（图2A，P<0.05）。与对照组相比，IL-1β组ATDC5细胞中肥大型软骨标志物Collagen X、MMP13 mRNA表达水平明显升高，经毛蕊异黄酮干预后，Collagen X，MMP13 mRNA表达水平明显下调（图2B，P<0.05）。此外，IL-1β处理显著提高ATDC5细胞中纤维化软骨标志物Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ的mRNA的表达水平；毛蕊异黄酮进一步处理降低了Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ的mRNA的表达水平（图2C，P<0.05），WB的结果进一步证实了该结论（图2D，P<0.05）。

2.3 毛蕊异黄酮促进OA大鼠BMSCs的成软骨分化

通过对3组（对照组、OA组、OA+毛蕊异黄酮组）大鼠膝关节软骨进行HE和番红固绿染色分析发现，与对照组相比，OA组大鼠的膝关节软骨表面完整性破坏，部分区域缺失，关节软骨浅表糜蚀、细胞减少，表现为中度病理性变化，而经毛蕊异黄酮处理后，病理学改变有所缓解，骨关节软骨表现出较少的破坏，软骨表面更完整，显著地减弱了软骨的降解（图3A、B）。与对照组相比，OA组大鼠BMSCs的成软骨化标志物Collagen Ⅱ，SOX9，Aggrecan的mRNA表达水平显著降低，经毛蕊异黄酮干预后，大鼠BMSCs的Collagen Ⅱ，SOX9，Aggrecan的mRNA表达水平显著上调（图3C，P<0.05）；与对照组相比，OA组大鼠BMSCs中肥大型软骨标志物Collagen X，MMP13表达水平明显升高，经毛蕊异黄酮干预后，大鼠BMSCs中的Collagen X，MMP13 mRNA表达水平明显降低（图3D，P<0.05）；与对照组相比，OA组大鼠BMSCs中成骨标志物ALP和RUNX2的mRNA和蛋白表达水平明显升高，毛蕊异黄酮进一步处理后，大鼠BMSCs中成骨标志物ALP，RUNX2的mRNA和蛋白表达水平显著降低（图3E、F，P<0.05）。

3 讨论

天然产物因其来源自然和较低的毒副作用等优势而受到青睐。越来越多的天然产物对OA具有抗炎、抗氧化或缓解OA的活性，已经成为治疗软骨损伤相关疾病的重要研究方向。据报道，齐墩果酸通过调节miR-148-3p/FGF2信号通路，减轻IL-1β诱导的软骨细胞功能障碍^[16]。槲皮素可抑制IL-1β诱导的细胞凋亡，并通过TSC2-RHEB-mTOR通路调节OA软骨细胞自噬发挥软骨保护作用^[17]。本研究结果显示，毛蕊异黄酮呈剂量依赖性抑制促炎因子IL-6和TNF-α的表达，降低氧化因子ROS的水平，表明毛蕊异黄酮有可能在OA的治疗中发挥一定作用。在OA的疾病发展过程中，骨关节软骨细胞的肥大表型和纤维化表型以及成软骨标志物是疾病发展的重要特征。研究报道，NF-κB信号通路的激活促进软骨细胞外基质的降解和纤维化^[18]。同时，有证据表明毛蕊异黄酮能够调控NF-κB信号通路的激活。比如，有研究发现毛蕊异黄酮可以降低脑组织NF-κB蛋白水平，减轻炎性损伤，在脑缺血再灌注损伤中发挥保护作用^[19]。因此，本研究通过建立OA小鼠和细胞模型，探究毛蕊异黄酮对软骨肥大表型和纤维化表型维持的影响及对BMSCs的成软骨分化的影响，探讨毛蕊异黄酮在软骨细胞损伤和软骨分化过程中的调控作用。

OA是一种慢性退行性关节疾病，是导致残疾的主要原因，其特征细胞外基质降解、软骨损伤、蛋白多糖以及胶原的减少和破坏。在健康状态下，关节软骨中的成熟软骨细胞保持静止，再生潜力有限，并维持细胞外基质成分^[20]。当软骨的损伤超过机体自我修复能力时，损伤区域会被纤维软骨所取代，其在生物化学组成和生物力学性质方面与透明软骨不同，无法满足运动的需求，导致软骨组织学和生物学等环境的紊乱，从而扩大病变范围并引发炎症。本研究结果表明毛蕊异黄酮可抑制IL-1β引起的软骨细胞肥大及纤维化表型标志物的增加，同时促进其透明化维持。

干细胞作为体内具有自我更新能力的多潜能细胞，在特定条件下，它可以分化为多种功能的细胞。间充质干细胞作为干细胞的重要一员，由于其具有良好的体外增殖、分化能力和较高的自我更新能力以及向软骨分化的潜力，因此成为最具有临床应用前景的多潜能干细胞。自上世纪70年代年Friedenstein首次描述并分离得到BMSCs以来，大量研究报道了BMSCs的多能性。尽管BMSCs只占有核骨髓细胞总数的0.2%，但其具有很强的分裂潜力，可以通过体外扩增获得高数量的细胞，用于填补软骨缺损^[21，22]。据报道，桑橙素通过调控miR-203a-3p/Smad1促进BMSCs成软骨细胞分化^[23]。棕榈酸通过上调SOX9基因表达促进BMSCs成软骨分化^[24]。众所周知，ALP和Runx2是关键的成骨标志物。其中，ALP是成骨细胞的表型标志物之一，可以直接反映成骨细胞的活性和功能状况。Runx2表达于成骨细胞的前体细胞中，其失活可防止成骨细胞分化，是成骨细胞分化和软骨细胞成熟必需的转录因子^[25]。研究报道，在Runx2缺陷的突变小鼠中，成骨细胞分化被阻滞；此外，在软骨细胞进程中，Runx2在增殖性软骨细胞中表达较少，但随着软骨细胞退出细胞周期，Runx2表达明显上调，形成前肥大和肥大软骨细胞^[25]，这表明Runx2在调节软骨和骨发育方面具有关键的调节作用^[26]。本研究发现，毛蕊异黄酮对小鼠BMSCs干预后，肥大型软骨标志物和成骨标志物表达显著降低，而成软骨化标志物表达显著升高，说明毛蕊异黄酮治疗可促进BMSCs的成软骨分化，并抑制成骨分化。

综上所述，本研究通过建立OA小鼠和细胞模型，发现毛蕊异黄酮能抑制IL-1β引起的软骨细胞肥大及纤维化表型，同时促进其透明化维持，并促进BMSCs的成软骨分化，并抑制成骨分化，为软骨损伤相关疾病的治疗提供了一定的理论基础。

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