DExH-box解旋酶9 O-GlcNAc修饰对HBV相关肝癌细胞增殖能力的影响

Effect of DExH-box helicase 9 O-GlcNAc modification on the proliferation of HBV-associated hepatoma cells

摘要

目的 研究DExH-box解旋酶9（DExH-box helicase 9，DHX9）的氧连接-N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相关肝癌细胞增殖能力的影响。 方法 通过分子克隆构建pAdTrack-TO4-DHX9-3Flag重组腺病毒质粒，并将重组腺病毒质粒转染至HEK293细胞中，包装、扩增重组腺病毒AdDHX9。通过免疫共沉淀实验检测DHX9与O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）的相互作用，免疫荧光实验研究DHX9与OGT共定位情况。通过琥珀酰化小麦胚芽凝集素（succinylated wheat germ agglutinin，sWGA）和糖基化免疫沉淀实验（immunoprecipitation，IP）检测DHX9 O-GlcNAc修饰水平。通过克隆形成实验和细胞生长曲线探索DHX9 O-GlcNAc修饰对HBV相关肝癌细胞增殖能力的影响。 结果 成功获得了重组腺病毒AdDHX9，经Western blot鉴定了DHX9的表达。DHX9与OGT相互作用，2者共定位于细胞核。sWGA和糖基化IP实验证实了DHX9能够发生O-GlcNAc修饰，并且HBV感染促进了DHX9 O-GlcNAc修饰水平。克隆形成实验显示，与AdGFP对照组（142.667±7.572）相比，AdDHX9组（386.667±15.630）的细胞克隆数量增加（P<0.001）。细胞生长曲线结果显示，AdDHX9组（22.860±0.770）比AdGFP对照组（13.670±0.517）的细胞整体生长速率增加（P<0.001）。 结论 HBV感染促进DHX9 O-GlcNAc修饰；DHX9 O-GlcNAc修饰增强HBV相关肝癌细胞的增殖能力。

Abstract

Objective To investigate the effect of DExH-box helicase 9（DHX9） O-linked N-acetylglucosamine（O-GlcNAc） modification（O-GlcNAcylation） on the proliferation of hepatitis B virus（HBV）-associated hepatoma cells. Methods The pAdTrack-TO4-DHX9-3Flag recombinant adenovirus plasmid was constructed by molecular cloning and transfected into HEK293 cells for packaging and amplification of the recombinant adenovirus AdDHX9. The interaction between DHX9 and O-GlcNAc transferase（OGT） was confirmed using co-immunoprecipitation. The co-localization between DHX9 and OGT was measured by immunofluorescence. The level of DHX9 O-GlcNAcylation was determined using succinylated wheat germ agglutinin（sWGA） and glycosylated immunoprecipitation （IP）. The effect of DHX9 O-GlcNAcylation on the proliferation of HBV-associated hepatoma cells was assessed using the colony-forming assay and cell growth curves. Results The recombinant adenovirus AdDHX9 was successfully obtained，and DHX9 expression was confirmed by Western blot. DHX9 interacted with OGT，and the two proteins were co-localized on the nucleus. The sWGA and glycosylated IP experiments showed that DHX9 underwent O-GlcNAcylation，which was further enhanced by HBV infection. The colony-forming assay demonstrated that the number of cell clones was increased in the AdDHX9 group（386.667±15.630） compared with the AdGFP control group（142.667±7.572，P<0.001）. Moreover，cell growth curves demonstrated that the overall cell growth rate was enhanced in the AdDHX9 group（22.860±0.770） compared with the AdGFP control group（13.670±0.517，P<0.001）. Conclusion HBV infection promotes DHX9 O-GlcNAcylation，which enhances the proliferation of HBV-associated hepatoma cells.

Graphical abstract

关键词

DExH-box解旋酶9 / 氧连接-N-乙酰葡萄糖胺 / 肝细胞癌 / 细胞增殖

Key words

DExH-box helicase 9 / O-linked N-acetylglucosamine / hepatocellular carcinoma / cell proliferation

原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤发病率的第6位，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占75%~85%^[1]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染是导致HCC的主要诱因，我国约84%的HCC患者罹患HBV感染^[2]。相较于乙醇、黄曲霉素等因素导致的HCC，HBV相关HCC的发病更早、预后更差以及复发率更高^[3]。近年来研究发现，细胞代谢重编程在HBV相关HCC的发生发展中具有重要作用^[4]，但具体机制尚未完全阐明。

HBV相关HCC的细胞代谢重编程主要涉及糖酵解、核苷酸代谢和脂质合成等代谢途径^[5-6]。己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthesis pathway，HBP）是葡萄糖代谢途径之一。葡萄糖进入细胞后被磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，进一步代谢为果糖-6-磷酸，其中3%~5%的果糖-6-磷酸进入HBP，在限速酶谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基转移酶（glutamine fructose-6-phosphate aminotransferase，GFAT）及一系列酶的催化下转变为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖胺（uridine diphosphate-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）^[7]。UDP-GlcNAc是细胞内氧连接-N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰的底物。O-GlcNAc修饰是一种将GlcNAc连接到蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上的蛋白质翻译后修饰。O-GlcNAc修饰过程由O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）催化，而O-GlcNAc水解酶（O-GlcNAcase，OGA）则反向去除这一修饰^[8]。O-GlcNAc修饰可以通过影响蛋白质稳定性、亚细胞定位、活性等促进肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移^[6，9]。例如，YTH结构域家族蛋白2 O-GlcNAc修饰增强了微型染色体维持蛋白2/5（minichromosome maintenance protein 2/5，MCM2/5）m6A修饰和MCM2/5 mRNA稳定性，从而促进HBV相关HCC细胞的增殖、侵袭和迁移^[6]。斑点型锌指结构蛋白（speckle-type POZ protein，SPOP）O-GlcNAc修饰促进SPOP蛋白的核异位，促进HCC细胞增殖、侵袭和迁移^[9]。此外，O-GlcNAc修饰参与血管生成、免疫逃逸、干细胞特性增强和耐药性形成，还可以通过调控蛋白质功能，影响细胞信号传导、基因组稳定性以及肿瘤微环境等关键生物学过程，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用^[10]。

DExH-box解旋酶9（DExH-box helicase 9，DHX9）是人类RNA解旋酶DExD/H-box家族的成员之一，编码基因定位于人类染色体1q25^[11]，编码相对分子质量为140 kDa蛋白质^[12]。DHX9具有解开DNA和RNA双链体的能力，也在调控DNA复制、RNA加工和转运以及转录过程中发挥重要功能^[13]。此外，DHX9与多种肿瘤的发生发展相关，如肝癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、尤文肉瘤等^[14]。目前研究发现，DHX9在HCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织^[15]；在HCC中，泛素样含PHD和环指域蛋白2（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 2，UHRF2）抑制DHX9泛素化降解，稳定DHX9蛋白表达从而促进HCC的发展^[16]。HBV感染增强肝细胞内DHX9蛋白水平^[17]，还可增强细胞葡萄糖的摄取从而促进HBP途径的活化^[18]，但DHX9是否发生O-GlcNAc修饰及其对HBV相关HCC细胞增殖能力的影响尚不清楚。本研究首次发现了DHX9的一种新型蛋白质翻译后修饰-O-GlcNAc修饰，并且HBV感染促进DHX9 O-GlcNAc修饰水平。进一步发现DHX9 O-GlcNAc修饰通过影响DHX9蛋白表达促进HCC的增殖，从而在HBV相关HCC的发生发展中发挥重要作用，为解析HBV相关HCC的发生发展机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞系Huh7、人胚肾细胞HEK293和HEK293T为本实验室保存，人肝癌细胞系HepAD38（货号：CRL-3561）购自美国ATCC公司；pAdTrack-TO4质粒为本实验室保存；pcDNA3.1-DHX9质粒由上海生工生物公司构建；DMEM培养基（货号：C11995500BT）购于美国Gibco公司；胎牛血清（货号：SFBE-B）购于阿根廷NTC公司；青霉素-链霉素（货号：HY-K1006）、Protein A/G Magnetic Beads（货号：HY-K0202）购于美国MCE公司；TMG（货号：T6056）、OSMI-1（货号：T16409）、蛋白酶抑制剂Cocktail（货号：C0001）购于上海陶术生物公司；限制性核酸内切酶BamH Ⅰ（货号：1605）、Not Ⅰ（货号：1623）、Xho Ⅰ（货号：1635）、T4 DNA连接酶（货号：2011A）购于日本Takara公司；限制性核酸内切酶Pac Ⅰ（货号：15041ES）购于中国Yeasen公司；限制性核酸内切酶Pme Ⅰ（货号：R0560S）购于美国NEB公司；PNGase（货号：04169273）购于上海Admas life公司；PMSF（货号：WB-0181）购自北京鼎国昌盛生物公司；sWGA-conjugated agarose beads（货号：AL-1023S）购于美国Vector Laboratories公司；转染试剂Lipo8000（货号：C0533）、Western及IP细胞裂解液（货号：P0013）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0011）、免疫染色通透液Triton X-100（货号：P0096）、结晶紫染色液（货号：C0121）购于上海碧云天公司；DHX9抗体（货号：sc-137232）购于美国Santa公司；Flag抗体（货号：F3165）购于美国Sigma公司；HA抗体（货号：26183）购于美国Thermo Fisher公司；β-actin抗体（货号：TA-09）购于北京中杉金桥公司；O-GlcNAc抗体（货号：ab2739）、OGT抗体（货号：ab177941）购于英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

所有细胞均用含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，置于37 ℃、5％ CO₂的细胞培养箱中。HepAD38细胞培养时加入1 μg/mL四环素以抑制HBV转录。10 cm培养皿培养的Huh7细胞贴壁后加入2 μL AdHBV1.3及5 μg/mL polybrene，12 h换液后继续培养3 d即可得到AdHBV1.3感染的Huh7肝癌细胞模型，即为Huh7-HBV1.3。

1.2.2 pAdTrack-TO4-DHX9-3Flag重组质粒构建

以pcDNA3.1-DHX9质粒为模板，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增DHX9目的片段（前引物：ATTTGCGGCCGCACCATGGGAGATGTGAAAAATTTTC；后引物：CGCGGATCCGTAGCCGCCGCCGCCGCGGCCC），胶回收目的片段，利用限制性核酸内切酶BamH Ⅰ及Not Ⅰ对目的片段和pSEB-3Flag载体进行双酶切再用乙醇沉淀法纯化，利用T4 DNA连接酶连接16 h后，将连接产物转化入DH10B感受态细胞中，经过菌落PCR筛选、酶切鉴定和DNA测序鉴定pSEB-DHX9-3Flag重组质粒。利用相同的方法将pSEB-3Flag-DHX9重组质粒构建至pAdTrack-TO4载体上得到pAdTrack-TO4-DHX9-3Flag重组质粒，PCR扩增前引物：ATTTGCGGCCGCACCATGGGAGATGTGAAAAATTTTC；后引物CCGCTCGAGTTAAATCTTATCGTCGTCATCCT。限制性核酸内切酶为Not Ⅰ和XhoⅠ。

1.2.3 DHX9重组腺病毒构建

pAdTrack-TO4-DHX9-3Flag重组质粒经Pme Ⅰ酶切线性化，电转至AdEasy-1 BJ5183感受态细胞。挑取单菌落加于2 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB溶液中，37 ℃，2 000 r/min摇床过夜培养后通过Mini法提取质粒，Pac I酶切鉴定后电转至DH10B感受态细胞，加500 μL LB溶液，移取部分菌液涂于卡那霉素抗性的LB固体平板上，37 ℃培养过夜。次日挑取单菌落置于4 mL含卡那霉素的LB液中，37 ℃摇床孵育16 h后通过去内毒素试剂盒提取质粒，Pac Ⅰ酶切质粒后通过乙醇沉淀法纯化得到DHX9重组腺病毒质粒。将构建好的DHX9重组腺病毒质粒转染至HEK293细胞，当荧光产生彗星状后，细胞漂浮1/3时，收集腺病毒原液并继续扩增5轮至高滴度。

1.2.4 Western blot

细胞处理48 h后提取总蛋白，BCA定量细胞蛋白浓度。50 μg蛋白样本中加入6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液煮沸变性，经电泳后转移至PVDF膜上，5%封闭液室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜。次日室温孵育相应的二抗1 h，1×TBST洗膜3次，加入ECL化学发光试剂显影。

1.2.5 免疫荧光实验

细胞处理后，以30%的密度铺于放有细胞爬片的12孔板中，24 h后移去培养基，1 mL 4%冷的多聚甲醛固定25 min。滴加0.1% Triton X-100通透处理15 min。滴加山羊血清封闭液室温封闭1 h。4 ℃孵育一抗过夜（置于湿盒中）。次日滴加适量的荧光二抗避光室温孵育2 h。DAPI处理5 min。防荧光淬灭封片剂封片后置于激光共聚焦显微镜下观察。采用Image J软件进行免疫荧光的定量和统计分析，采用Pearson相关系数r描述蛋白之间的共定位关系（当0.49<r≤1时，表示2种蛋白存在强共定位关系）^[19]。

1.2.6 免疫沉淀实验

细胞用IP细胞裂解液（含1×蛋白酶抑制剂Cocktail和1 mmol/L PMSF）冰上裂解10 min后刮下细胞。超声（30%功率，工作10 s，停10 s，一共3次）裂解细胞后，置于4 ℃离心机中13 000×g离心15 min。留取50 μL上清作为Input。余下蛋白加入20 μL已洗涤proteinA/G磁珠封闭，弃磁珠后加入5 μg Flag或HA抗体置于4 ℃旋转孵育过夜。然后加至40 μL已洗涤proteinA/G磁珠中室温旋转孵育4 h。收集磁珠，加入2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液煮沸变性，Western blot检测蛋白表达情况。

1.2.7 琥珀酰化小麦胚芽凝集素（succinylated wheat germ agglutinin，sWGA）实验

细胞弃去培养基，加入300 μL含1×蛋白酶抑制剂Cocktail和1 mmol/L PMSF的细胞裂解液（50 mmol/L Tris-Cl，125 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1% Triton X-100）冰上裂解30 min，每5 min振荡一次。置于4 ℃离心机中13 000×g离心15 min。取50 μL上清作为Input。采用Western blot调齐各孔的DHX9水平后，余下蛋白利用终浓度为1 250 U/mL的PNGase处理。设置阴性对照组及实验组。阴性对照组：20 μL已洗涤的sWGA琼脂糖珠中加入0.5 mol/L GlcNAc置于4 ℃封闭sWGA珠子2 h，最后加入PNGase处理后的组织蛋白样品，用细胞裂解液补齐到500 μL；实验组：PNGase处理后的组织蛋白样品加至20 μL已洗涤的sWGA琼脂糖珠中，用细胞裂解液补齐到500 μL。实验组及对照组均置于4 ℃旋转过夜。次日，过夜样本置于4 ℃离心机5 000×g离心1 min，弃上清。用500 μL预冷的细胞裂解液洗涤沉淀3次。在洗涤后的沉淀中加入适量2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，水浴煮沸变性10 min。Western blot检测蛋白含量。

1.2.8 细胞增殖实验

以每孔8×10²个Huh7-HBV1.3细胞接种于96孔板中（设置3个复孔），37 ℃、5% CO₂条件下培养6 d。每隔48 h更换培养基，培养基中含相应药物（25 nmol/L DMSO或25 nmol/L OGT抑制剂OSMI-1）。通过细胞动态检测仪（ESCO，CCL-170T-8，Singapore）每24 h检测1次细胞增殖密度。

1.2.9 克隆形成实验

以每孔8×10²个细胞的浓度将Huh7-HBV1.3细胞接种于6孔板中（设置3个复孔），置于37 ℃、5% CO₂条件下培养。每隔48 h更换培养基，培养基中含相应药物（25 nmol/L DMSO或25 nmol/L OSMI-1）。待6孔板中细胞形成细胞集落时（1~2周）去除培养基进行结晶紫染色。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism 8.0软件进行作图及数据处理。计量资料的数据来自3次独立重复实验的结果，采用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验，采用Brown-Forsythe检验方差齐性。正态分布的数据以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 DHX9重组腺病毒的构建与鉴定

pAdTrack-TO4-DHX9-3Flag重组质粒（图1A）经Not Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴定正确（图1B），然后将2号pAdTrack-TO4-DHX9-3Flag重组质粒转染至HEK293细胞中包装、扩增为重组腺病毒AdDHX9。将DHX9重组腺病毒感染HEK293细胞，6 d后可见彗星状荧光（图1C），当细胞漂浮1/3时，收集腺病毒并继续扩增5轮至高滴度。通过Western blot检测AdDHX9过表达效果：相较于AdGFP对照组（1.126±0.239），AdDHX9组（3.342±0.476）中的蛋白表达水平升高（P<0.001，图1D~E）。

2.2 DHX9与OGT相互作用

本课题组前期通过O-GlcNAc修饰蛋白质组学在O-GlcNAc修饰蛋白复合物中筛选到了DHX9蛋白（图2A）^[18]，提示DHX9可能发生O-GlcNAc修饰。为了检测DHX9与O-GlcNAc修饰之间的关系，通过Co-IP技术检测了DHX9是否与OGT发生相互作用。结果显示，在OGT富集的蛋白复合物中检测到DHX9表达（图2B），同时在DHX9富集的蛋白复合物中检测到OGT表达（图2C），说明DHX9能够与OGT发生相互作用；免疫荧光实验显示，DHX9与OGT存在共定位关系，且共定位于细胞核（图2D~E）。以上结果提示，DHX9与OGT存在相互作用。

2.3 DHX9可以发生O-GlcNAc修饰

为了进一步检测DHX9是否能够发生O-GlcNAc修饰，本研究在Huh7细胞中通过sWGA实验在O-GlcNAc修饰蛋白复合物中检测到DHX9存在，并且在OGT抑制剂OSMI-1处理后DHX9 O-GlcNAc修饰水平下调，在OGA抑制剂TMG处理后上调（图3A），糖基化IP实验得到了相似的结果（图3B）。以上结果提示，DHX9能够发生O-GlcNAc修饰。

2.4 DHX9 O-GlcNAc修饰增加DHX9蛋白水平

随后，在HepAD38细胞中检测了DHX9 O-GlcNAc修饰对自身蛋白水平的影响。Western blot结果显示，TMG处理可以上调DHX9蛋白水平，而OSMI-1处理会下调DHX9蛋白水平（图4A），说明DHX9 O-GlcNAc修饰增强DHX9蛋白水平。在Huh7细胞中，也得到了类似的结果（图4B）。

2.5 HBV增强DHX9 O-GlcNAc修饰水平

然后，本课题组研究了HBV感染对DHX9 O-GlcNAc修饰的影响。在HepAD38细胞中，外源性sWGA实验发现HBV复制后sWGA可以富集更多的DHX9，表明HBV复制增强了DHX9 O-GlcNAc修饰水平（图5A），内源性sWGA得到了相同的结果（图5C）。进一步通过Huh7-HBV1.3细胞发现OSMI-1处理下调DHX9 O-GlcNAc水平，而TMG处理上调DHX9 O-GlcNAc水平（图5B）。内源性sWGA得到了相同的结果（图5D）。糖基化IP实验发现，在HBV复制样本中，Flag抗体富集的蛋白复合物内可以检测到更多的DHX9 O-GlcNAc蛋白（图5E），并且在OSMI-1处理后DHX9 O-GlcNAc修饰减少，而TMG处理后DHX9 O-GlcNAc增加（图5F）。以上研究结果表明，HBV复制增强DHX9 O-GlcNAc修饰。

2.6 DHX9 O-GlcNAc修饰促进HBV相关HCC细胞的增殖能力

最后，本课题组检测了DHX9 O-GlcNAc修饰对HBV相关HCC细胞增殖能力的影响。克隆形成实验显示，与AdGFP对照组（142.667±7.572）相比，AdDHX9组（386.667±15.630）的细胞克隆数量增加（P<0.001），而OSMI-1处理后，AdDHX9组（163.333±10.260）细胞的细胞克隆数量降低（P<0.001）（图6A~B）。细胞生长曲线结果显示，AdDHX9组（22.860±0.770）比AdGFP对照组（13.670±0.517）的细胞整体生长速率增加（P<0.001），而OSMI-1处理后，AdDHX9组（15.240±0.480）细胞的细胞整体生长速率减慢（P<0.000，图6C）。以上研究结果说明DHX9的O-GlcNAc修饰促进HBV相关HCC细胞增殖能力。

3 讨论

DHX9蛋白翻译后修饰在多种疾病如肝癌^[16]、乳腺癌^[20]、食管鳞状细胞癌^[21]的发生发展中扮演着重要角色。研究发现，LINC01016可抑制DHX9泛素化修饰和降解，增强DHX9蛋白稳定性，激活PI3K/AKT信号通路，促进三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭^[20]。DHX9 SUMO化修饰可调节细胞R环平衡，DHX9 K120位点上的SUMO化修饰可导致细胞R环失调，引起DNA损伤和诱发细胞凋亡^[22]；DHX9的磷酸化促进其与RNA结合蛋白的相互作用从而调控R环平衡，DHX9 S321位点去磷酸化抑制DHX9与RNA结合蛋白的相互作用，导致细胞对DNA损伤的敏感性增加和细胞凋亡^[23]。本研究中，本课题组首次鉴定了DHX9蛋白的一种新型翻译后修饰-O-GlcNAc修饰，并在HBV相关HCC细胞中发现HBV复制增强DHX9的O-GlcNAc修饰水平。首先通过免疫共沉淀证实了DHX9与OGT的相互作用，免疫荧光实验进一步发现DHX9与OGT共定位于细胞核；然后通过sWGA实验及糖基化IP实验证实DHX9能够发生O-GlcNAc修饰，并利用TMG及OSMI-1处理证实DHX9 O-GlcNAc修饰可以调控DHX9蛋白水平；进一步在HepAD38细胞及Huh7-HBV1.3细胞中证实了HBV感染能够促进DHX9的O-GlcNAc修饰。

蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化等）可能存在相互串扰，共同参与蛋白质功能的调控。例如，跨膜和泛素样结构域蛋白1可以与PD-L1相互作用，抑制PD-L1 K281的泛素化，增强PD-L1 N-GlcNAc修饰和蛋白稳定性，从而促进肿瘤免疫逃逸^[24]。p21活化激酶与雄激素受体（androgen receptor，AR）发生相互作用，增强AR S578位点的磷酸化水平进而促进AR泛素化降解最终抑制前列腺癌细胞的迁移^[25]。研究报道，在HBV相关HCC中，HBx诱导UHRF2 S643磷酸化，抑制UHRF2的E3泛素连接酶活性，导致DHX9经泛素-蛋白酶体途径的降解减少，提高了DHX9蛋白水平，从而增强HBV的复制并促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力^[16]；此外，HBx与DHX9发生相互作用，抑制鼠双微体基因2介导的DHX9泛素化修饰，从而上调DHX9蛋白水平^[17]。本研究中发现HBV感染可以增强DHX9 O-GlcNAc修饰水平。因此，推测HBV可能通过抑制HBx介导的DHX9泛素化修饰，增加DHX9 O-GlcNAc修饰，增强DHX9蛋白的稳定性和水平，这将在本课题组今后研究中进一步探讨。

DHX9与多种肿瘤的发生相关，在不同肿瘤中发挥促癌或抗癌的功能^[21，26-28]。在结直肠癌中，DHX9通过激活NF-κB信号通路促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡^[26]。在食管鳞状细胞癌（oesophageal squamous carcinoma cells，ESCC）中，小核仁RNA42与DHX9相互作用抑制DHX9泛素化降解，同时触发DHX9/p65轴促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭^[21]。DHX9也是一种肿瘤抑制因子。例如，DHX9可通过STAT3抑制肺腺癌上皮-间充质转化从而抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力^[27-28]。本研究首次鉴定了DHX9 O-GlcNAc修饰对HBV相关HCC细胞增殖能力的影响。在Huh7-HBV1.3细胞中通过克隆形成实验、细胞生长曲线发现DHX9 O-GlcNAc修饰促进HBV相关HCC细胞增殖能力，而OSMI-1处理后减弱了DHX9促进肝癌细胞增殖的效应，说明DHX9 O-GlcNAc修饰可增强HBV相关HCC细胞的增殖能力，这与现有文献报道的结果一致^{[15-16，29-30]}。研究发现，DHX9通过抑制肝癌细胞凋亡和促使上皮间质转化，从而调控肝癌细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为^[15]。引起细胞凋亡的因素可以分为内源性和外源性两大类，其中DNA损伤是细胞凋亡的重要的内源性诱导因素之一^[31]。DNA损伤的研究中，R环对基因组稳定性具有重要的调控作用。R环是基因转录过程中形成的一种由单链DNA和DNA：RNA杂交体组成的三链核酸结构，其广泛参与肿瘤的发生发展过程^[32]。DHX9作为一种解旋酶，其在消除R环、维持基因正常转录过程中发挥了重要作用^[33]。例如，研究报道DHX9能够被组蛋白修饰阅读器TDRD3招募至靶基因的启动子处，以解旋酶活性依赖的方式解除TDRD3靶基因启动子处的“R环^[34]。因此，DHX9 O-GlcNAc修饰可能通过消除R环以维持基因正常转录，从而减少DNA损伤和抑制肝癌细胞凋亡，增强HBV相关HCC细胞的增殖，这也是未来研究中需要深入探究的内容。

O-GlcNAc修饰在肝癌的发生发展中扮演着重要角色。例如，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1的缺失增强细胞周期检测点激酶CHK2蛋白的O-GlcNAc修饰，导致肝癌细胞增殖^[35]。S期激酶相关蛋白2 O-GlcNAc修饰可促进细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p27和p21的泛素化修饰和蛋白质降解，调控细胞周期G₁~S期进而促进肝癌细胞增殖^[36]。以上研究均表明，靶向干预O-GlcNAc修饰是一种潜在的肝癌治疗新策略。本研究首次鉴定了DHX9蛋白也能发生O-GlcNAc修饰，并且HBV感染可以增强DHX9 O-GlcNAc修饰水平，这些研究结果可为靶向干预DHX9 O-GlcNAc修饰治疗HBV相关HCC提供了新的靶点和理论支持。

本研究也存在一定的局限性，主要体现在尚未对DHX9的O-GlcNAc修饰位点进行详细鉴定，采用TMG和OSMI-1处理细胞可能存在一定的实验偏差；DHX9 O-GlcNAc修饰如何影响HBV相关HCC的其他恶性生物学功能仍需进一步探讨；DHX9的完整O-GlcNAc修饰位点图谱及O-GlcNAc修饰对DHX9蛋白质亚细胞定位、活性等需要深入研究。

综上所述，本研究发现HBV感染可以增强DHX9 O-GlcNAc修饰水平，促进HBV相关HCC细胞的增殖，这些结果为研究HBV相关HCC发生发展的机制提供了理论支持。

参考文献

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(U20A20392)