Galectin-3通过GSK-3β/β-catenin通路增加肺动脉成纤维细胞中Ⅰ型胶原的表达

Galectin-3 increases the expression of collagen type Ⅰ in pulmonary artery fibroblasts by regulating the glycogen synthase kinase-3β/β-catenin pathway

摘要

目的 探讨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积在肺血管重塑和肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）中的作用及其分子机制。 方法 采用不同浓度（0、1、2、5、10 μg/mL）半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）刺激大鼠肺动脉成纤维细胞（pulmonary artery fibroblasts，PAFs）24 h，或者采用2 μg/mL Gal-3处理PAFs不同时间（0、12、24、48、72 h），酶联免疫吸附试验检测Ⅰ型胶原的蛋白水平；使用GSK-3β siRNA及β-catenin siRNA分别特异性沉默GSK-3β、β-catenin表达，qRT-PCR检测β-catenin mRNA水平，免疫印迹法检测β-catenin蛋白水平，免疫荧光染色检测β-catenin蛋白的亚细胞定位。 结果 Gal-3剂量和时间依赖性增加大鼠PAFs培养上清液中的Ⅰ型胶原蛋白；与对照组比较，Gal-3处理组细胞中GSK-3β磷酸化和失活，β-catenin蛋白含量增加（F=18.242，P=0.000）并从细胞质向细胞核移位。与对照组比较，Gal-3处理组或GSK-3β siRNA组均可增加β-catenin的蛋白水平，但不影响其mRNA水平；与Gal-3处理组比较，β-catenin siRNA+Gal-3组细胞中的Ⅰ型胶原蛋白水平有所下调（F=9.965，P=0.028）。 结论 Gal-3通过调节GSK-3β/β-catenin信号通路增加PAFs中Ⅰ型胶原的表达，表明干预Gal-3或GSK-3β/β-catenin信号通路在预防和治疗PH方面具有潜在价值。

Abstract

Objective To investigate the role and molecular mechanism of excessive deposition of extracellular matrix in pulmonary vascular remodeling and pulmonary hypertension（PH）. Methods Rat pulmonary artery fibroblasts（PAFs） were treated with galectin-3（Gal-3） at different concentrations（0，1，2，5，10 μg/mL） for 24 hours or 2 μg/mL Gal-3 for different periods of time（0，12，24，48，72 hours），and ELISA was used to measure the level of collagen type I. Glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β） siRNA and β-catenin siRNA were used to specifically silence GSK-3β and β-catenin，respectively；qRT-PCR was used to measure the mRNA level of β-catenin，Western blotting was used to measure the protein level of β-catenin，and immunofluorescent staining was used to determine the subcellular localization of β-catenin. Results Gal-3 increased the level of collagen type Ⅰ in culture supernatant of rat PAFs in a dose- and time-dependent manner. Compared with the control group，the Gal-3 treatment group had phosphorylation and inactivation of GSK-3β，a significant increase in the content of β-catenin（F=18.242，P=0.000），and the translocation of β-catenin from cytoplasm to nucleus. In addition，compared with the control group，Gal-3 treatment and GSK-3β siRNA increased the level of β-catenin and did not affect the mRNA level of β-catenin，and compared with the Gal-3 group，the β-catenin siRNA+Gal-3 group had a reduction in the protein level of collagen type Ⅰ in cells（F=9.965，P=0.028）. Conclusion Gal-3 increases the expression of collagen type I in PAFs by regulating the GSK-3β/β-catenin signaling pathway，suggesting that intervention of Gal-3 or the GSK-3β/β-catenin signaling pathway may have a potential value in the prevention and treatment of PH.

Graphical abstract

关键词

肺动脉高压 / 半乳糖凝集素-3 / GSK-3β / β-catenin / Ⅰ型胶原蛋白

Key words

pulmonary hypertension / galectin-3 / glycogen synthase kinase-3β / β-catenin / collagen type Ⅰ

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是一种危及生命的临床综合征，其特征是肺血管阻力和肺动脉压力增加，最终导致右心衰竭甚至死亡^[1]。PH的常见病理表现包括持续性肺血管收缩、血管重塑和原位血栓形成。其中肺血管重塑是极其关键的病理改变，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度积聚和胶原沉积的增加是肺血管重塑的关键和不可缺少的病理改变^[2]。因此，探讨ECM异常沉积的分子机制对于预防和治疗肺血管重塑和肺动脉高压具有重要意义。

半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）是galectin家族的成员^[3]。除了定位于细胞质和穿梭于细胞核外，Gal-3还分泌到细胞表面和生物体液中。Gal-3的不同位置有助于其各种功能，包括细胞生长和凋亡、细胞存活和转化、前体mRNA剪接、血管生成、炎症、纤维化和宿主防御，在多种肿瘤和非肿瘤疾病中发挥着重要作用^[4-5]。其中细胞外Gal-3被认为是一种关键的细胞激活因子，它调节细胞与细胞以及细胞与ECM之间的相互作用，参与多种疾病的发病机制，包括肿瘤、血管纤维化和心力衰竭^[6-7]。最近的研究发现，Gal-3在肺血管重塑和PH的发病机制中起着关键调节器的作用^[8-9]。然而，关于Gal-3导致PH的潜在分子机制尚不完全清楚。

β-catenin是WNT/β-catenin信号通路中的一个关键效应器，控制着许多重要的生物学过程，如细胞增殖、凋亡和分化^[10]。在缺乏细胞外WNT配体的情况下，胞质β-catenin蛋白被GSK-3β迅速泛素化和降解；而细胞外WNT配体导致GSK-3β磷酸化和失活，随后β-catenin蛋白稳定。最后，β-catenin蛋白可以积聚并移位到细胞核以诱导基因转录^[11]。研究发现，细胞核中积累的β-catenin蛋白可诱导多种类型细胞中的I型胶原蛋白表达^[12-13]。然而，GSK-3β/β-catenin途径的激活是否会增加肺动脉成纤维细胞（pulmonary artery fibroblasts，PAFs）中Ⅰ型胶原蛋白的表达，并与ECM过度积聚有关，目前尚不清楚。在本研究中，使用Gal-3刺激I型胶原蛋白生成，测定GSK-3β的磷酸化和β-catenin的表达，并进一步探索这些变化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和鉴定

大鼠PAFs购买自ProCell生物公司（中国，武汉）。细胞在含有杜尔贝科改良的Eagle培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）高糖培养基（Gibco，美国）、15%胎牛血清（四季青，中国杭州）和双抗（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）的培养瓶中培养，并置于37 ℃、5% CO₂培养箱中。当细胞达到80%密度时，使用0.25%胰蛋白酶（Invitrogen，美国）通过胰蛋白酶化法进行细胞传代培养，本研究使用第3~6代的细胞。使用针对vimentin 的免疫染色对PAFs的纯度进行鉴定（Abcam，英国）。通过在含有1%胎牛血清的DMEM培养基中培养细胞12 h，将血清对PAFs的诱导作用降至最低。使用Gal-3（R&D，美国）刺激Ⅰ型胶原表达。

1.2 方法

1.2.1 siRNA转染及分组处理

当细胞在6孔板中达到30%~50%的融合时，首先使用荧光FAM标记的阴性对照siRNA（FAM-NC siRNA）测定PAFs的转染效率。然后依据操作说明书使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）将200 nmol/L GSK-3β siRNA、β-catenin siRNA或阴性对照siRNA（GenePharma，中国上海）转染细胞。将细胞分为3组：对照组、阴性对照siRNA组、特异性沉默基因组（GSK-3β siRNA组或者β-catenin siRNA组）。最后，使用免疫印迹法分析siRNA沉默基因的效果。随后依据实验需求对PAFs做如下分组及处理。①不同浓度Gal-3处理组：采用不同浓度（0、1、2、5、10 μg/mL）Gal-3处理PAFs 24 h；不同时间Gal-3处理组：采用2 μg/mL Gal-3处理PAFs不同时间（0、12、24、48、72 h）。②对照组：PAFs正常培养24 h不做任何处理；Gal-3处理组：PAFs经2 μg/mL Gal-3处理24 h。③阴性对照siRNA组：将阴性对照siRNA转染至PAFs中；GSK-3β siRNA组：将GSK-3β siRNA转染至PAFs中。④阴性对照siRNA+Gal-3组：转染阴性对照siRNA后的PAFs经2 μg/mL Gal-3处理24 h；β-catenin siRNA+Gal-3组：转染β-catenin siRNA后的PAFs经2 μg/mL Gal-3处理24 h。

1.2.2 ELISA

按照说明书进行操作，使用大鼠I型胶原ELISA试剂盒（西塘，中国上海）检测PAFs培养上清液中的I型胶原蛋白水平。收集PAFs的培养上清液，并根据测量的光密度值进行换算，通过仪器软件计算样本中的I型胶原蛋白水平。此外，对多个样本进行了重复测试，所有结果均以平均值表示。

1.2.3 免疫荧光染色

免疫荧光染色用于检测β-catenin蛋白的亚细胞定位。在室温下使用4%多聚甲醛将PAFs固定20 min。用PBS清洗细胞3次，然后用0.3%Triton X-100渗透10 min。在室温下用5%BSA封闭30 min后，在4 ℃下用抗β-catenin（Abcam，1∶500）一抗孵育细胞过夜。接下来，用PBS洗涤细胞3次，然后在室温下用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔的二抗（Abcam，1∶200）在黑暗中培养1 h。此外，细胞核在室温下使用DAPI染色5 min。最后，使用共焦激光扫描显微镜随机扫描图像。

1.2.4 qRT-PCR

根据试剂盒说明书操作，使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）提取PAFs中的总RNA。使用RevertAid First Strand cDNA 合成试剂盒（Thermo，美国）进行反转录；然后使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（Thermo，美国）在CFX Realtime PCR系统（Bio-Rad）上，通过定量聚合酶链反应对所有样本进行分析。在95 ℃下进行30 s的扩增，然后在95 ℃下进行40个周期的扩增，扩增时间为5 s，在58 ℃下扩增时间为30 s，在72 ℃下扩增时间为30 s。相对于对照组样品的扩增倍数由2^-ΔΔCt法计算。β-catenin mRNA的对照为GAPDH，两者的引物均购于生工生物公司（中国上海），其引物具体序列如下。β-catenin：Forward，5′-CTGAGGACAAGCCACAAGATTA-3′，Reverse，5′-ATCCACCAGAGTGAAAAGAACG-3′；GAPDH：Forward，5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，Reverse，5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2.5 免疫印迹法

首先，按如下方式提取细胞裂解液：用冰的PBS轻轻冲洗PAFs 2次，然后在含有50 mmol/L Tris/HCl（pH 7.4）、1%Nonide P-40、0.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）、150 mmol/L NaCl、0.5%脱氧胆酸钠、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L-苯甲烷磺酰基氟化物、1 mmol/L-Na3VO4、1 mmol/L-NaF和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中进行裂解。在4 ℃以12 000×g离心10 min后，收集上清液作为样品蛋白质。接下来，在6%~10%的SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质，并通过湿转仪将蛋白转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad）上。然后在4 ℃下将膜与抗p-GSK-3β（CST，1∶1 000）、t-GSK-3β（CST，1∶1 000）和β-catenin（Abcam，1∶1 000）一抗孵育过夜。在PBST中洗涤15 min共3次后，在室温下用辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG二抗（Sigma-Aldrich，1∶5 000）孵育膜2 h。最后，使用化学发光液在ChemiDoc XRS系统（Bio-Rad）上显示蛋白质条带，并使用Quantity One软件（Bio-Rad）量化。

1.3 统计学方法

使用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示。采用单向方差分析和Tukey检验分析各组之间的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Gal-3增加大鼠PAFs中I型胶原蛋白的表达

与对照组（10 μg/mL）相比，Gal-3在24 h后剂量依赖性地诱导PAFs培养上清液中的I型胶原蛋白表达，2 μg/mL Gal-3诱导Ⅰ型胶原蛋白1.50倍地增加（F=8.283，P=0.036）。Gal-3以时间依赖的方式上调Ⅰ型胶原蛋白的表达；2 μg/mL Gal-3在72 h将其增加至对照组的2.06倍（F=20.162，P<0.001）。结果表明Gal-3可有效增加大鼠PAFs中Ⅰ型胶原蛋白的表达。见图1。

2.2 Gal-3激活大鼠PAFs中GSK-3β/β-catenin信号通路

用2 μg/mL Gal-3处理PAFs 5 min后，明显增加了GSK-3β的磷酸化水平，而不影响GSK-3β的总水平；Gal-3处理组的GSK-3β的磷酸化水平提高至对照组的1.51倍（F=11.344，P=0.019），见图2A。与对照组相比，Gal-3处理组的β-catenin mRNA水平没有变化（F=3.310，P=0.186）；但与对照组比较，Gal-3处理组的β-catenin蛋白水平增加至2.16倍（F=18.242，P<0.001），见图2B、C。然后用免疫荧光染色法检测PAFs中的β-catenin。对照组细胞中，β-catenin主要位于细胞质中，而Gal-3处理组的细胞核中荧光标记的β-catenin明显增加，见图2D。

2.3 抑制GSK-3β上调大鼠PAFs中β-catenin蛋白水平

siRNA的转染效率（转染阳性细胞数占总细胞数的百分比）超过80%（图3A）。与对照组相比，GSK-3β siRNA组的GSK-3β蛋白水平降低了59%（F=22.761，P<0.001），而与对照组相比，阴性对照siRNA组的GSK-3β蛋白表达水平未见明显变化（图3B）。与对照组相比，Gal-3处理组或GSK-3β siRNA组的β-catenin mRNA水平没有改变，但β-catenin蛋白水平明显增加，分别为对照组的1.88倍和1.93倍（F=15.281，P=0.022；F=16.962，P=0.009），见图3C、D。同时，Gal-3处理组或GSK-3β siRNA组细胞核中荧光标记的β-catenin明显升高，而对照组细胞中荧光标记β-catenin主要位于细胞质中（图3E）。结果表明，抑制GSK-3β促进了PAFs中β-catenin蛋白含量增加及β-catenin蛋白从细胞质转移至细胞核。

2.4 抑制GSK-3β/β-catenin通路上调大鼠PAFs中Ⅰ型胶原蛋白水平

GSK-3β的失活或敲除提高了大鼠PAFs培养上清液中Ⅰ型胶原蛋白的表达，与对照组相比，Gal-3处理组和GSK-3β siRNA组中Ⅰ型胶原蛋白表达分别升高至1.61倍和1.71倍（F=9.281，P=0.025；F=10.740，P=0.021），见图4A。与对照组相比，β-catenin siRNA组的β-catenin蛋白水平降低至31%（F=30.135，P<0.001），而阴性对照siRNA组的β-catenin蛋白水平未见明显变化（图4B）。与对照组相比，Gal-3处理组的Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显增加（F=17.618，P=0.005）；而与Gal-3处理组相比，β-catenin siRNA+Gal-3组的Ⅰ型胶原蛋白表达水平有明显回降。Gal-3处理组中，Ⅰ型胶原蛋白表达水平为对照组的1.45倍，而β-catenin siRNA+Gal-3组中Ⅰ型胶原蛋白表达水平回降至对照组的0.92倍（F=9.965，P=0.028），见图4C。

3 讨论

本研究表明，Gal-3导致GSK-3β磷酸化和失活，随后β-catenin蛋白含量增加，从而进一步提高PAFs中Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果提示，Gal-3通过调节GSK-3β/β-catenin信号通路，部分促进了ECM的过度积聚；抑制Gal-3从而抑制ECM重塑的策略可能对PH的预防和治疗具有重要价值。

研究表明，Gal-3通过调节多种基本细胞功能，如细胞间和细胞基质相互作用、细胞生长、增殖和分化，在包括癌症、纤维化、慢性炎症和心血管功能障碍在内的各种人类疾病中发挥着关键作用^[14-15]。最近研究进一步发现，PH患者和模型动物的肺组织中Gal-3明显增加；低氧或野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导的模型PH因Gal-3的上调而加重，但因Gal-3的抑制而改善，细胞外Gal-3通过激活细胞内的多种信号通路发挥其生物学功能^[16-17]。本研究表明，Gal-3通过激活PAFs中GSK-3β/β-catenin信号通路，增加Ⅰ型胶原蛋白的表达，这表明Gal-3可能是PH诊断和治疗中一个有前景的生物标志物和靶点。

WNT信号通路包括经典WNT通路和非经典WNT通路。经典WNT通路即WNT/β-catenin信号通路，由4个部分组成：细胞外信号、细胞膜段、细胞质段和细胞核段。细胞外信号主要由WNT蛋白介导，受细胞外刺激因素（如Gal-3）影响下，细胞外WNT蛋白与其细胞膜上的受体结合，从而激活细胞质中的GSK-3β/β-catenin通路，最终调节细胞核中下游靶基因的表达^[10]。亦有研究表明，galectin-3作为细胞外信号，通过激活PI3K/AKT信号轴，进一步使GSK-3β磷酸化和失活，最终导致β-catenin蛋白含量增加^[18]。GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在静息细胞中具有活性，因此对WNT/β-catenin信号通路具有负调节作用；而在细胞外刺激的存在下，GSK-3β被磷酸化和失活，并失去对β-catenin蛋白的降解作用。随后，β-catenin在细胞内集聚并移位到细胞核，通过影响多个靶基因的表达，在细胞增殖、凋亡和分化中发挥重要作用^[19-20]。最近，研究发现GSK-3β/β-catenin信号通路的激活参与PH的血管重塑，并导致多种人类疾病中ECM的过度生成^[21-22]。本研究表明，GSK-3β的失活或缺失不影响β-catenin mRNA水平，而仅提高了β-catenin蛋白水平；β-catenin siRNA可逆转Gal-3诱导的Ⅰ型胶原蛋白生成增加。这些结果表明，Gal-3使GSK-3β失活，然后增加β-catenin蛋白含量，进而提高PAFs中Ⅰ型胶原蛋白的表达。

PH的特征是肺动脉ECM重塑，胶原沉积增加^[23]。ECM重塑通过多种信号通路促进肺血管细胞增殖；抑制ECM重塑可以预防和逆转实验性PH，表明ECM重塑在PH发病机制中起着中心作用^[24]。在肺血管壁的各种类型的胶原中，Ⅰ型胶原蛋白是ECM最重要的组成部分之一。本研究发现，外源性Gal-3刺激PAFs激活GSK-3β/β-catenin信号通路，进而促进I型胶原蛋白生成。有研究发现，核内激活的β-catenin蛋白导致基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂之间的失衡，因此进一步提高了Ⅰ型胶原的生成^[25-26]，这有待于未来的研究证实。

综上所述，本研究发现Gal-3通过调节PAFs中的GSK-3β/β-catenin途径上调Ⅰ型胶原蛋白水平，进而加剧ECM的过度积聚，表明抑制Gal-3或GSK-3β/β-catenin信号通路可能在肺血管重塑和PH的预防和治疗中至关重要。

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基金资助

甘肃省自然科学基金资助项目(20JR10RA734)

甘肃省自然科学基金资助项目(20JR5RA341)