尿液外泌体mRNAs评分指导坏死性小肠结肠炎患儿手术时机相关研究

Value of urinary exosome mRNA score in guiding surgical timing in children with necrotizing enterocolitis

摘要

目的 探索坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）患儿尿液外泌体（exosomes，Exo）mRNAs表达特征。构建mRNAs评分用于指导NEC患儿手术时机。 方法 选取本院2021年1月至2024年3月收治的196例NEC患儿作为研究对象。根据是否进行手术干预分为手术组和非手术组。对4例手术组患儿和4例非手术组患儿尿液Exo-mRNAs进行微阵列数据分析。使用Metascape在线数据库进行京都基因和基因组（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路分析。通过拓扑特征分析筛选核心基因并在临床队列中利用酶联免疫吸附法验证核心基因表达特征。通过logistic回归分析构建尿液Exo-mRNAs评分。通过受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析和比较风险变量曲线下面积（area under the curve，AUC）。 结果 196例患儿中，需要手术干预患儿48例（32.4 %）。手术组和非手术组患儿尿液Exo-mRNAs微阵列数据分析识别出565个差异表达基因，其中441个基因表达上调，124个基因表达下调。KEGG信号通路主要富集在细胞色素P450、胆汁分泌和脂肪消化吸收等信号通路中。2次拓扑特征分析发现11个核心基因：前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide Synthase 2，PTGS2）、白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）、细胞色素P450 3A4（cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4，CYP3A4）、Toll样受体2（toll-like receptor 2，TLR2）、钙黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）、细胞色素P450 2C9（cytochrome P450 family 2 subfamily C member 9，CYP2C9）、细胞色素P450 2C19（cytochrome P450 family 2 subfamily C member 19，CYP2C19）、CXC基序趋化因子配体8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）和载脂蛋白C-3（apolipoprotein C-Ⅲ，APOC3）。手术组患儿尿液Exo中PTGS2、IL-1β、MMP9和TLR2表达量增加，CYP3A4、CDH1和CYP2C9表达量降低（P<0.05）。Exo-mRNAs评分公式为0.704×PTGS2_表达量+0.426×IL-1β_表达量+0.198×TLR2_表达量-1.166×CYP3A4_表达量。多因素logistic回归分析显示，Exo-mRNAs评分、胎龄和肠脂肪酸结合蛋白（I-FABP）是NEC患儿手术干预风险独立影响变量（P<0.05）。ROC曲线分析结果显示，Exo-mRNAs评分预测手术干预风险的AUC为0.888（0.836-0.929），均高于单独Exo-mRNA、胎龄和I-FABP的AUC。 结论 尿液Exo-mRNAs评分可作为指导NEC患儿手术时机的非侵入性标志物，为NEC患儿积极早期干预和治疗提供理论依据。

Abstract

Objective To investigate the expression characteristics of urinary exosome（Exo） mRNAs in children with necrotizing enterocolitis（NEC），and to construct an mRNA score for guiding surgical timing in children with NEC. Methods A total of 196 children with NEC who were admitted to our hospital from January 2021 to March 2024 were enrolled as subjects，and according to whether surgical intervention was performed，they were divided into surgical group and non-surgical group. A microarray data analysis was performed for the urinary Exo-mRNAs of four children in the surgical group and four in the non-surgical group. Metascape online database was used to perform the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） signaling pathway analysis. Topological characterization was performed to identify core genes，and ELISA was used to validate the expression profiles of core genes. A logistic regression analysis was used to construct the urinary Exo-mRNAs score. The receiver operating characteristic（ROC） curve was used to analyze and compare the area under the ROC curve（AUC） of risk variables. Results Among the 196 children，48（32.4%） required surgical intervention. The microarray data analysis of urinary Exo-mRNAs identified 565 differentially expressed genes between the surgical group and the non-surgical group，among which there were 441 upregulated genes and 124 downregulated genes. The KEGG signaling pathways were mainly enriched in the signaling pathways such as cytochrome P450，bile secretion，and fat digestion and absorption. Two sessions of topological characterization identified 11 core genes，i.e.，prostaglandin-endoperoxide synthase 2（PTGS2），interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6，matrix metallopeptidase 9（MMP9），cytochrome p450 3A4（CYP3A4），toll-like receptor 2（TLR2），cadherin-1（CDH1），cytochrome p450 2C9（CYP2C9），cytochrome p450 2C19，C-X-C motif chemokine ligand 8，and apolipoprotein C-3. For the children in the surgical group，there were significant increases in the expression levels of PTGS2，IL-1β，MMP9，and TLR2 and significant reductions in the expression levels of CYP3A4，CDH1，and CYP2C9 in urinary Exo（P<0.05）. The formula for Exo-mRNAs scoring was 0.704×PTGS2_expression + 0.426×IL-1β_expression + 0.198×TLR2_expression - 1.166×CYP3A4_expression. The multivariate logistic regression analysis showed that Exo-mRNAs score，gestational age，and intestinal fatty acid-binding protein（I-FABP） were independent influencing variables for the risk of surgical intervention in children with NEC（P<0.05）. The ROC curve analysis showed that Exo-mRNAs score had an AUC of 0.888（0.836-0.929） in predicting the risk of surgical intervention，with a significantly higher AUC than Exo-mRNA，gestational age，and I-FABP alone. Conclusion Urinary Exo-mRNAs score can be used as a noninvasive marker for guiding surgical timing in children with NEC，which provides a theoretical basis for the early intervention and treatment of children with NEC.

Graphical abstract

关键词

坏死性小肠结肠炎 / 新生儿 / 外泌体 / 信使核糖核酸 / 手术 / 时机

Key words

necrotizing enterocolitis / neonate / exosomes / mRNA / surgery / timing

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿中常见的急性坏死性肠道疾病，表现为腹胀、腹泻和血便，具有发病急、进展快和死亡率高等特点^[1]。随着早产儿（特别是极低和超低体重儿）存活率提高，NEC发病率逐渐增加，约为13%^[2]。荟萃分析显示NEC致死率可达10%，而61%幸存者会出现严重神经发育迟缓^[3]，9%幸存者因出现肠衰竭需肠外营养支持治疗^[4]。这些并发症会导致患儿生活质量低下，给医疗和社会保健系统带来沉重经济负担。

有效预防NEC有助于提高治疗效果，这也意味着需要更精确地确定疾病自然进展和手术干预最佳时机。然而，超过一半需进行手术干预NEC患儿因缺乏明确手术体征而未得到及时治疗，患儿死亡概率增加^[5]。为此，研究者从病因、早期诊断和更有效预防措施等方面进行探索，包括识别反映疾病严重程度或进展的生物标志物或免疫学指标来增强手术干预决策^[6]。然而，现有研究结论仍无法提供一种准确且有效辅助手术干预时机的决策方法。因此，寻找更为准确有效的早期生物标志物，对提高患儿生存率具有重要意义。

近年来，外泌体（exosomes，Exo）作为一种新型的细胞间通讯介质，受到广泛关注，其是由细胞分泌的小囊泡，直径40~160 nm，能够携带蛋白质、脂质、mRNAs、miRNAs等多种生物分子，在细胞间传递信息^[7]。Exo广泛存在于血液、尿液和唾液等各种体液中，其内容物反映了来源细胞状态和功能，因而被认为是理想的疾病标志物来源。研究发现肠上皮细胞和中性粒细胞衍生的Exo可通过多种病理学机制介导NEC发病和进展机制^[8]。尿液作为一种非侵入性、易获取体液样本，其含有的mRNAs已被用作早期诊断和预测NEC的新型标志物^[9]，此外，Exo在多囊体与顶端浆细胞膜融合过程中或通过浆膜直接出芽释放到尿液中，与尿液中mRNAs相比，尿液Exo-mRNAs因包裹在膜结合囊泡内，具有更高生物学稳定性^[10]。

因此，可以合理地假设，通过分析NEC中尿液Exo-mRNAs特征变化，可以确定NEC进展标志物，并指导NEC早期手术干预时机的决策过程。为此，本研究通过分析NEC患儿尿液Exo中mRNAs的表达谱特征，筛选出与手术干预密切相关的Exo-mRNAs，随后在临床队列中验证；最后构建Exo-mRNAs评分旨在指导NEC患儿手术干预时机。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2021年1月至2024年3月收治的NEC患儿。纳入标准：①符合NEC诊断标准，NEC为Bell分期Ⅱ期及以上；②入院时间≤24 h；③患儿监护人均知情同意本研究并签署同意书；④具有手术指征者均进行手术治疗。排除标准：①其他传染病者；②先天性代谢疾病或染色体异常者；③先天性肠道畸形者；④严重先天性心脏病者；⑤围生期及住院治疗资料不完整。最终本研究共纳入NEC患儿196例，入院1周后，根据患儿是否进行手术干预分为手术组和非手术组。本研究获得伦理委员会批准通过（伦理审查批件号：EC-KY-2024114）。

1.2 方法

1.2.1 数据收集

收集NEC患儿入院当天的临床资料，包括胎龄、性别、出生体质量、分娩方式、喂养方式、宫内感染史、白细胞（white blood cell，WBC）、中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）、血小板（platelet，PLT）、血糖（blood glucose，BG）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、白蛋白（albumin，Alb）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid-binding protein，I-FABP）和降钙素原（procalcitonin，PCT）。

1.2.2 尿液收集与Exo提取

入院当天患儿确诊后，使用10 mL无菌容器收集患儿晨尿标本，采用差速离心法去除细胞和其他大颗粒杂质后置于-80 ℃保存。按照制造商说明，使用ExoQuick exosomes快速提取试剂盒（EXOQ5A-1，SBI）提取3 mL尿液Exo。简言之，尿液样本在4 ℃下以10 000×g离心30 min除去较大颗粒。随后将上清液转移至超速离心管中，按1∶1比例添加ExoQuick试剂，在4 ℃下以100 000×g离心70 min。弃去上清液后将尿液Exo重悬于磷酸盐缓冲液中保存于-80 ℃，以备后续实验。48例手术组患儿手术时间与尿液采集时间的差值为（4.25±1.08） d。

1.2.3 纳米颗粒跟踪分析

使用Nanosight NS300系统（Malvern Instruments，英国）对Exo进行纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA），以确定颗粒大小和数量。根据制造商说明，将尿液Exo样品在无颗粒磷酸盐缓冲溶液中稀释（1∶3 000）。随后在25 ℃恒流（流速=50）条件下进行分析。使用NTA 3.1.54软件分析数据。

1.2.4 透射电子显微镜

使用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）鉴定Exo形态。简言之，将10 µL Exo溶液静置于200目铜网上20 min。随后用蒸馏水冲洗网格3次，用乙酸铀酰对Exo进行阴性染色2 min后风干铜网，随后用TEM进行观察鉴定。

1.2.5 蛋白质印迹（Western blot，WB）

使用WB分析确认Exo相关膜蛋白存在。根据制造商说明，使用BCA^TM蛋白定量试剂盒（P0010，碧云天）定量蛋白质浓度。经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至聚偏二氟乙烯膜上，随后以5% BSA封闭膜1 h。随后使用抗鼠CD9（1∶1 000，ab236630，Abcam）和抗鼠TSG101（1∶1 000，ab30871，Abcam）在4 ℃下孵育过夜。二抗室温孵育1 h。随后使用Tanon3500凝胶成像和照相系统显影。

1.2.6 尿液Exo-mRNAs提取与微阵列数据分析

从手术组和非手术组患儿中各随机选择4例进行尿液Exo的mRNAs微阵列数据分析。根据制造商说明，使用miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit（217204，Qiagen）提取尿液Exo中总RNA。使用500 μL含异硫氰酸胍的Qiazol缓冲液溶解尿液Exo。加入100 μL氯仿将混合物涡旋并在4 ℃下以14 000×g离心15 min。随后在上清液中加入1.5 mL无水乙醇，混合物由提取柱（Qiagen S.A.）离心后分别用RWT缓冲液和REP缓冲液洗涤。用20 µL无RNase水洗脱RNA，随后用Nanodrop进行定量。如前所述，使用miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit（217204，Qiagen）提取尿液Exo中总RNA。并用NanoDrop光谱仪评估RNA质量和浓度，随后通过PrimeScript RT试剂盒逆转录为cDNA并将其标记为荧光探针，将标记后的cDNA片段杂交到微阵列芯片上，随后使用安捷伦扫描仪对微阵列芯片进行扫描，使用Feature Extraction软件分析微阵列图像并获取原始数据。NEC患儿尿液Exo-mRNAs微阵列数据分析

1.2.7 差异表达基因和功能富集分析

使用R包limma分析差异表达基因，阈值设置为|LogFC|>2和adj.P<0.05。将差异表达基因导入Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）平台中，在“Input as species”和“Analysis as species”中均选择“H.sapiens”进行京都基因和基因组（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路分析，绘制尿液Exo-mRNAs功能富集分析图。

1.2.8 基因拓扑特征分析

将差异表达基因导入STRING数据库（http://string-db.org/cgi/input.pl）中构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。随后将输出数据导入Cytoscape 3.8.0软件中，使用“cytoNCA”插件进一步进行拓扑特征分析，并根据每个节点的度中心性（degree centrality，DC）和中介中心性（between centrality，BC）识别核心基因。

1.2.9 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）验证核心基因

根据制造商说明，使用相应ELLSA Kit试剂盒验证核心基因表达量。简言之，将待验证抗人抗体包被于酶标板上，随后依次加入生物素化的相应抗人抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，使相应抗人抗体与结合在包被抗体上的待验证抗人抗体结合，生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物。随后加入显色底物TMB，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。随后用酶标仪在450 nm波长处测吸光度（absorbance，A）值，基因浓度与A₄₅₀值之间成正比，通过绘制标准曲线计算出样品中核心基因浓度。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.5、Medcalc 22.0和Cytoscape 3.8.0软件处理数据。计数资料用百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验。正态分布的计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，采用独立样本t检验。多因素logistic回归分析NEC患儿手术干预风险的独立影响因素。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析并计算相关变量曲线下面积（area under the curve，AUC）。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 手术组和非手术组患儿临床资料比较

196例患儿中，需要手术干预患儿48例（32.4%）。手术组患儿胎龄（P<0.001）和PLT（P=0.002）低于非手术组患儿，宫内感染史比例（P=0.038）、NLR（P=0.003）、BG（P=0.003）、CRP（P=0.011）、IL-6（P<0.001）、I-FABP（P<0.001）和PCT（P=0.016）高于非手术组患儿，2组差异有统计学意义（表1）。

2.2 尿液Exo鉴定

采用NTA（图1A）和TEM（图1B）鉴定Exo。Exo大小不一，呈类圆形或椭圆形双层脂质膜囊泡，直径约为150 nm。WB分析证实尿液Exo中存在CD9和TSG101表达（图1C），表明本研究已成功提取尿液Exo。

2.3 手术组和非手术组患儿尿液Exo-mRNAs差异表达、功能富集及拓扑分析

通过对手术组和非手术组患儿尿液Exo-mRNAs的微阵列数据分析，共识别出565个差异表达基因，其中441个基因表达上调，124个基因表达下调（图2A）。将565个差异表达基因导入Metascape数据库中，KEGG信号通路主要富集在细胞色素P450、胆汁分泌和脂肪消化吸收等信号通路中（图2B）。为探索核心基因，对565个基因进行2次拓扑特征分析（每次保留前20%基因），共发现11个核心基因：前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、IL-6、基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、细胞色素P450 3A4（cytochrome p450 3A4，CYP3A4）、Toll样受体2（toll-like receptor 2，TLR2）、钙黏蛋白1（cadherin-1，CDH1）、细胞色素P450 2C9（cytochrome p450 2C9，CYP2C9）、细胞色素P450 2C19（cytochrome p450 2C19，CYP2C19）、CXC基序趋化因子配体8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）和载脂蛋白C-3（apolipoprotein C-3，APOC3）（图2C）。

2.4 尿液Exo中11个核心基因表达特征验证

非手术组及手术组在IL-6、CYP2C19、CXCL8、APOC3方面的比较差异无统计学意义（P>0.05）。与非手术组患儿相比，手术组患儿尿液Exo中PTGS2（P<0.001）、IL-1β（P<0.001）、MMP9（P=0.004）和TLR2（P=0.004）表达量增加，CYP3A4（P<0.001）、CDH1（P=0.002）和CYP2C9（P=0.018）表达量降低，2组差异有统计学意义（表2）。

2.5 影响Exo-mRNAs评分构建及多因素logistic回归分析

将表2中单因素有差异的7个核心基因（PTGS2、IL-1β、MMP9、TLR2、CYP3A4、CDH1、CYP2C9）作为自变量纳入多因素logistic回归模型中，以NEC患儿入院1周内是否进行手术为因变量（非手术＝0，手术＝1），结果显示，尿液Exo中核心基因PTGS2、IL-1β、TLR2、CYP3A4是NEC患儿手术干预风险独立影响变量（P<0.05）（表3）。基于多因素Logistic回归分析结果β值构建Exo-mRNAs评分：0.704×PTGS2_表达量+0.426×IL-1β_表达量+0.198×TLR2_表达量-1.166×CYP3A4_表达量。手术组患儿Exo-mRNAs评分（6.13±1.49）分高于非手术组患儿Exo-mRNAs评分（3.30±1.69）分，2组差异有统计学意义（t=10.394，P<0.001）。

2.6 影响坏死性小肠结肠炎患儿手术时机的多因素logistic回归分析

将胎龄、宫内感染（是=1vs.否=0）、NLR、PLT、BG、CRP、IL-6、I-FABP、PCT、Exo-mRNAs评分作为自变量纳入多因素logistic回归模型中，以NEC患儿入院1周内是否进行手术为因变量（非手术＝0，手术＝1），结果显示，胎龄、I-FABP和Exo-mRNAs评分是NEC患儿手术干预风险独立影响变量（P<0.05）（表4）。

2.7 相关变量ROC曲线分析

ROC曲线分析结果显示，PTGS2、IL-1β、TLR2、CYP3A4、胎龄、I-FABP及Exo-mRNAs评分预测手术干预风险的（AUC=0.735，95%CI=0.667~0.795）、（AUC=0.733，95%CI=0.665~0.793）、（AUC=0.627，95%CI=0.555~0.695）、（AUC=0.781，95%CI=0.716~0.837）、（AUC=0.704，95%CI=0.634~0.767）、（AUC=0.698，95%CI=0.629~0.761）和（AUC=0.888，95%CI=0.836~0.929），见表5。

3 讨 论

NEC是由多种致病因素引起的急性坏死性肠道疾病，可伴随肠狭窄、短肠综合征和生长发育异常等后遗症，严重影响患儿生活和健康^[1,11]。早期诊断和手术治疗是降低NEC患儿死亡率和改善预后最有效手段，但手术干预时机很难确定。目前，肠穿孔是NEC常用手术指征。然而，只有少数患儿有典型肠坏死表现，且当患儿出现典型表现时，提示病情已经恶化，手术为时已晚^[12]。因此，寻找简单有效指导新生儿NEC手术干预决策的新型生物标志物，对改善患儿预后至关重要。

尿液Exo中的mRNAs是一种稳定存在于人体尿液中的新型生物标志物，已被广泛用于预测多种临床疾病^[10]。本研究通过对手术组和非手术组患儿尿液Exo中mRNAs微阵列数据分析发现有565个差异表达基因。功能富集分析显示这些基因的功能主要富集在细胞色素P450、胆汁分泌和脂肪消化吸收等信号通路中，部分信号通路也被证实参与NEC进展^[13]。为进一步探索核心基因，对565个基因进行2次拓扑特征分析后发现11个核心基因。随后，通过ELLSA检测证实手术组患儿尿液Exo中PTGS2、IL-1β、MMP9和TLR2表达量增加，CYP3A4、CDH1和CYP2C9表达量降低。PTGS2又称环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2），NEC可引起肠细胞对促炎分子COX-2的p38依赖性释放增强全身炎症反应，加重NEC严重程度^[14]，此外，TLR2也可介导不成熟的先天性免疫反应加重NEC病情^[15]。IL-1β可促进新生儿NEC的急性肠损伤，加重NEC病情^[16]。这些研究结果表明PTGS2、IL-1β和TLR2通过不同生理病理学机制加重NEC病情，增加手术干预风险。而MMP9和CYP3A4在NEC中的具体机制尚未报道，本研究结合功能富集分析，认为MMP9和CYP3A4可能通过介导胆汁分泌和脂肪消化吸收等信号通路参与NEC发病机制^[17-18]。尿液Exo在形成过程中有选择性地富集了来源细胞的蛋白质、miRNA等信息分子，所以通过对尿液Exo所携带的生物学信息可以了解到结肠细胞的生理病理改变，进而有望寻找到新型生物标志物对NEC患儿手术时机进行早期预测。IL-1β作为白细胞介素家族中重要的一员，在异常状态下可以被大量激活，由无活性的前体在转化酶的催化下剪切后成为有活性的成熟的IL-1β，在被巨噬细胞分泌后不仅在局部组织发挥作用，更能通过内分泌的方式与远处的靶细胞表面受体相结合，引起全身的炎症反应。本研究结果显示，手术组尿液Exo中核心基因IL-1β表达水平明显高于非手术组，且尿液Exo中核心基因IL-1β是NEC患儿手术干预风险独立影响变量，这对NEC患儿手术时机的早期诊断具有一定的指导意义。

为提高预测手术干预风险准确性，减少单一标志物可能带来的误判风险，本研究构建包含PTGS2、IL-1β、CYP3A4和TLR2的Exo-mRNAs评分。多因素logistic回归分析结果证实Exo-mRNAs评分独立于胎龄和I-FABP与患儿手术干预风险相关，既往研究发现，胎龄越小新生儿在NEC发病前接受更多输血，手术干预风险更高^[19]；I-FABP是分布于肠黏膜中的蛋白质，可作为判断NEC小肠损伤严重程度和预测手术干预风险的有效指标^[1]。本研究通过ROC曲线分析比较诊断指标预测手术干预风险的性能，其结果显示Exo-mRNAs评分预测手术干预风险的AUC为0.888（0.836~0.929），显著高于单独Exo-mRNA、胎龄和I-FABP预测手术干预风险的AUC值。表明尿液Exo-mRNAs评分具有极高的准确预测手术干预风险性能，为预测患儿手术干预时机提供新思路。

本研究存在一定局限性。首先，患儿测序数据样本较小，可能无法充分反映患儿尿液Exo-mRNAs表达特征；其次，PTGS2、IL-1β、CYP3A4和TLR2影响NEC严重程度机制需体外实验验证；最后，未阐明PTGS2、IL-1β、CYP3A4和TLR2与信号通路间相互作用的具体机制。

综上所述，尿液Exo-mRNAs评分可指导NEC患儿手术时机，为患儿积极早期干预和治疗提供理论依据。

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