姜黄素通过诱导巨噬细胞极化促进化疗所致周围神经损伤后神经功能修复

Curcumin promotes neurological recovery after chemotherapy-induced peripheral neuropathy by inducing macrophage polarization

摘要

目的 探究姜黄素通过诱导巨噬细胞极化促进化疗所致周围神经损伤（chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）后神经功能修复的机制。 方法 30只小鼠随机分为对照组、紫杉醇（paclitaxel，PTX）组和PTX+姜黄素组，每组10只。腹腔注射PTX建立CIPN模型，通过机械性缩足阈值测试、冷异常痛敏测试，测定小鼠机械刺激及冷刺激的反应，检测血清、背根神经节炎症因子水平。免疫荧光检测后爪皮肤神经纤维密度、背根神经节巨噬细胞极化情况。收集小鼠腹腔巨噬细胞、新生小鼠背根神经节神经元。巨噬细胞分为对照组、PTX组、PTX+姜黄素组，与背根神经节神经元共培养。流式细胞检测巨噬细胞极化、细胞计数试剂盒-8（cell counting Kit-8，CCK-8）检测细胞活力、免疫荧光检测背根神经节神经元存活率与神经元形态。 结果 在CIPN小鼠模型中，与对照组相比，PTX组50%缩足阈值、白细胞介素（interleukin，IL）-10水平、表皮神经纤维密度、M2型巨噬细胞比例降低（P<0.05），痛觉反应时间、血清、背根神经节肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6水平、M1型巨噬细胞比例、M1/M2比值升高（P<0.05）；与PTX组相比，PTX+姜黄素组50%缩足阈值、IL-10水平、表皮神经纤维密度、M2型巨噬细胞比例升高（P<0.05），痛觉反应时间、血清、背根神经节TNF-α、IL-6水平、M1型巨噬细胞比例、M1/M2比值下降（P<0.05）。在体外细胞实验中，与对照组相比，PTX组M1型巨噬细胞比值、M1/M2比值升高（P<0.05），M2型巨噬细胞比例、背根神经节神经元存活率降低（P<0.05），轴突长度缩短（P<0.05）；与PTX组相比，PTX+姜黄素组M1型巨噬细胞比例、M1/M2比值下降（P<0.05），M2型巨噬细胞比例、背根神经节神经元存活率上升（P<0.05），轴突长度增加（P<0.05）。 结论 姜黄素可能通过调节巨噬细胞极化促进CIPN神经功能修复。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which curcumin promotes neurological recovery after chemotherapy-induced peripheral neuropathy（CIPN） by inducing macrophage polarization. Methods A total of 30 mice were randomly divided into control group，paclitaxel（PTX） group，and PTX+curcumin group，with 10 mice in each group. Intraperitoneal injection of PTX was performed to establish a model of CIPN. The mechanical paw withdrawal threshold test and the cold allodynia test were used to measure the response of mice to mechanical and cold stimuli，and the levels of inflammatory cytokines in serum and the dorsal root ganglia were measured. Immunofluorescence assay was used to measure the density of nerve fibers in the hind paw skin and the polarization status of macrophages in dorsal root ganglia. Mouse peritoneal macrophages were collected，and dorsal root ganglion neurons were collected from neonatal mice. Macrophages were divided into control group，PTX group，and PTX+curcumin group and were co-cultured with dorsal root ganglion neurons. Flow cytometry was used to detect macrophage polarization，and CCK-8 assay and immunofluorescence assay were used to observe the viability and morphology of dorsal root ganglion neurons. Results In the mouse model of CIPN，compared with the control group，the PTX group had significant reductions in 50% paw withdrawal threshold，interleukin-10（IL-10），epidermal nerve fiber density，and the proportion of M2 macrophages（P<0.05），as well as significant increases in pain response time，the levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α） and interleukin-6（IL-6） in serum and dorsal root ganglia，the proportion of M1 macrophages，and M1/M2 ratio（P<0.05）；compared with the PTX group，the PTX+curcumin group had significant increases in 50% paw withdrawal threshold，IL-10，epidermal nerve fiber density，and the proportion of M2 macrophages（P<0.05），as well as significant reductions in pain response time，the levels of TNF-α and IL-6 in serum and dorsal root ganglia，the proportion of M1 macrophages，and M1/M2 ratio（P<0.05）. In vitro cellular experiments showed that compared with the control group，the PTX group had significant increases in the proportion of M1 macrophages and M1/M2 ratio（P<0.05） and significant reductions in the proportion of M2 macrophages and the viability of dorsal root ganglion neurons（P<0.05），as well as a significant reduction in axon length（P<0.05）；compared with the PTX group，the PTX+curcumin group had significant reductions in the proportion of M1 macrophages and M1/M2 ratio（P<0.05） and significant increases in the proportion of M2 macrophages and the viability of dorsal root ganglion neurons（P<0.05），as well as a significant increase in axon length （P<0.05）. Conclusion Curcumin may promote neurological recovery after CIPN by regulating macrophage polarization.

Graphical abstract

关键词

姜黄素 / 巨噬细胞极化 / 化疗致周围神经损伤 / 神经功能修复 / 紫杉醇

Key words

curcumin / macrophage polarization / chemotherapy-induced peripheral neuropathy / neurological recovery / paclitaxel

化疗致周围神经损伤（chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）是癌症治疗中最常见的剂量限制性不良反应，影响多达半数接受单药治疗的癌症患者，而采用2种及以上的化疗药物进行联合治疗时，CIPN发生率可高达75%^[1-3]。随着长期癌症幸存者数量的增加，CIPN已成为1个日益严重的临床问题。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等实体瘤的最有效的化疗药物之一，与CIPN的发生发展相关^[4-6]。尽管PTX诱导CIPN的具体机制尚不清楚，但有多项证据表明，先天免疫系统的激活在CIPN发病机制中起关键调控作用，例如，臭氧可通过上调单磷酸腺苷活化蛋白激酶/细胞因子信号转导抑制因子3信号通路抑制RAW264.7细胞p38丝裂原活化蛋白激酶/组织因子信号通路，防止草酸铂诱导的坐骨神经脱髓鞘，抑制小胶质细胞激活，从而缓解CIPN^[7]；有研究显示，通过中和高迁移率族蛋白B1、耗竭巨噬细胞以及阻断嘌呤能受体P2X7或P2X4，可预防小鼠PTX诱导的CIPN^[8]。姜黄素是1种从姜黄中提取的酚类化合物，具有抗炎、抗氧化和神经保护作用，能够缓解CIPN中观察到的神经结构和功能缺陷，改善化疗引起的脱髓鞘现象^[9]。Caillaud M等^[10]预先使用含有姜黄素磷脂复合物制剂饲养小鼠，有效预防了PTX诱导的机械性超敏反应并改善了小鼠坐骨神经线粒体病变。姜黄素激活的嗅鞘细胞可通过载脂蛋白E/髓样细胞触发受体2/核因子-κB信号通路调节小胶质细胞极化，促进脊髓损伤后的功能恢复^[11]。本次研究将通过体内外实验探究姜黄素是否通过诱导巨噬细胞极化促进CIPN后神经功能修复以及可能的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选用34只SPF级6周龄健康雄性BALB/c小鼠及4只SPF级7日龄雄性BALB/c新生小鼠购自广州中医药大学动物实验中心[动物合格证号：SCXK（粤）2023-0068]。所有小鼠于SPF级动物房内适应性饲养1周，饲养期间自由摄食饮水。实验过程严格遵循动物实验3R原则（替代、减少、优化）。

1.1.2 主要试剂

PTX（货号：5.08227）和姜黄素（货号：C1386），购自美国Sigma公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，货号：ml002095）、白细胞介素（interleukin，IL）-6（货号：ml098430）、IL-10（货号：ml037873）检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；蛋白基因产物9.5（Protein gene product 9.5，PGP9.5，货号：ml23654）、Ⅳ型胶原蛋白（Collagen Ⅳ，货号：ml54875）、离子钙结合适配器分子1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1，货号：ab178846）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide，iNOS，货号：ab178945）、CD206（货号：ab64693）、βⅢ-微管蛋白（βⅢ-tubulin，货号ab18207）购自英国Abcam公司；牛血清白蛋白（货号：37520）、胎牛血清（货号：16140063）、DMEM培养基（货号：11965092）、L15培养基（货号：11415064），购自美国Thermo Fisher公司；神经元基础培养基（货号：BR3000195），购自上海百生跃生物科技有限公司；CD68抗体（货号：562117）、CD86抗体（货号：551396）、CD206抗体（货号：550889），购自美国BD公司；CCK-8试剂盒（货号：C0038），购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模

30只小鼠随机分为对照组、PTX组、PTX+姜黄素组，每组10只。PTX+姜黄素组腹腔注射2 mg/kg PTX，给予200 mg/kg姜黄素灌胃，PTX组腹腔注射2 mg/kg PTX，给予等体积生理盐水灌胃，对照组腹腔注射等体积聚氧乙烯蓖麻油EL与95%无水乙醇（1∶1混合）制成的溶剂，给予等体积生理盐水灌胃。以首次注射为第1天，每2 d 注射1次，共4次。灌胃给药每日1次，共14 d。

1.2.2 机械性缩足阈值测试

在正式接受测试前，将小鼠每日置于透明有机玻璃箱内底部悬空的金属网上30 min，连续3 d以习惯测试环境。于0、2、4、6、8、10、12、14 d进行测试，使用von Frey纤毛垂直刺激小鼠右后爪足底中部，使纤毛轻微弯曲并保持3~5 s，观察是否出现缩足反射。若无反应，则换用更粗一级的纤毛进行刺激，按升序进行测量，每根纤毛重复测试5次，每次测试之间间隔2 min，出现3次缩足反射记为阳性，通过Dixon法计算小鼠50%缩足阈值。

1.2.3 冷异常痛敏测试

于0、2、4、6、8、10、12、14 d进行测试，测试前，将小鼠放置在测试环境中适应30 min。向每只小鼠的左后爪足底表面喷洒50 µL丙酮，用录像机记录小鼠60 s内的行为，观察小鼠对冷刺激的反应，包括舔舐、收缩、抬起或拍打受刺激的后爪等，统计痛觉反应时间。

1.2.4 炎性因子水平检测

冷异常痛敏测试结束后处死所有小鼠，面静脉采血收集血清。打开胸腹腔，除去内脏器官，沿脊柱背侧中线两侧剪开椎管，暴露脊髓，提取L5背根神经节。取部分血清、背根神经节组织，按照ELISA检测试剂盒说明书完成样本的前处理，并严格按照其操作步骤进行实验，检测TNF-α、IL-6、IL-10的水平。

1.2.5 免疫荧光检测

组织：采集后爪皮肤，取部分皮肤、背根神经节组织，置于4%多聚甲醛中固定过夜。加入浓度为20%的蔗糖溶液，观察组织下沉至底部，更换为浓度为30%的蔗糖溶液浸泡过夜。将样本包埋在最佳切割温度复合物中，于-80 ℃条件下制成20 µm的冰冻切片，在0.3%过氧化氢中孵育10 min，加入含5%驴血清、0.3% Triton-110的PBS中封闭1 h。皮肤切片加入1∶100稀释的PGP 9.5抗体与1∶400稀释的Collagen Ⅳ抗体，背根神经节切片分别加入1∶200稀释的Iba-1抗体与1∶500稀释的iNOS抗体、1∶200稀释的Iba-1抗体与1∶200稀释的CD206抗体，4 ℃孵育过夜。加入1∶300稀释的荧光二抗，室温孵育1 h后封片，于荧光显微镜下拍摄荧光图像。

细胞：各组背根神经节神经元接种于6孔板内无菌盖玻片上，每片滴加500 μL细胞悬液，观察细胞贴壁后每孔加入2 mL培养基，继续培养24 h。弃上清，加入4%多聚甲醛固定20 min，加入0.4% Triton X-100通透15 min，加入含5%牛血清白蛋白的封闭液室温封闭1 h。加入1∶500稀释的βⅢ-tubulin抗体，4 ℃孵育过夜。加入1∶200稀释的荧光二抗，室温孵育1 h后封片，于荧光显微镜下拍摄荧光图像。

1.2.6 细胞培养与分组

巨噬细胞：另取4只未纳入动物分组的6周龄小鼠处死，腹腔内注入10 mL含1 mmol/L EDTA的37 ℃ PBS进行灌洗，收集腹膜巨噬细胞。使用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5% CO₂的培养箱中孵育2 h，用PBS洗涤去除未贴壁细胞，贴壁细胞培养3 d后分为对照组、PTX组、PTX+姜黄素组。对照组正常培养，PTX组培养基加入2 mg/mL PTX，PTX+姜黄素组培养基加入2 mg/mL PTX和50 μmol/L姜黄素，培养24 h待用。

背根神经节神经元：取4只新生7日龄小鼠断头处死，分离背根神经节，移至L15培养基中离心，弃去上清液。加入Ⅰ型胶原酶消化50 min。用L15培养基洗涤沉淀，将背根神经节神经元悬浮于含有10%胎牛血清和10 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子的神经元基础培养基中，培养24 h后与各组巨噬细胞共培养，分组同巨噬细胞。将巨噬细胞接种于孔径为0.4 µm的Transwell小室上室中，下室接种背根神经节神经元，培养4 d后收集下室细胞用于后续检测。

1.2.7 流式细胞检测

取各组巨噬细胞制成悬液，分别加入CD68与CD86、CD68与CD206抗体，4 ℃避光孵育40 min，PBS洗涤后重悬于流式检测缓冲液中，上机检测。

1.2.8 细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）检测

各组共培养后的背根神经节神经元接种于6孔板上，正常培养24 h后进行CCK-8检测，每孔加入10 μL CCK-8试剂，避光培养2 h，于450 nm波长下检测吸光度，计算各组神经元存活率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示，组间比较采用独立样本t检验（2组）或单因素方差分析（多组）。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 姜黄素对CIPN小鼠机械性和冷异常痛敏反应的影响

与对照组相比，PTX组2、4、6、8、10、12、14 d 的50%缩足阈值显著降低（F=414.880、477.173、356.450、1 510.670、419.462、674.105、242.001，均P<0.001），痛觉反应时间延长（F=94.445、175.975、110.518、131.167、257.897、129.401、146.021，均P<0.001）；与PTX组相比，PTX+姜黄素组在2、4、6、8、10、12、14 d 的50%缩足阈值显著升高（t=3.272、5.769、3.223、9.007、11.898、17.203、13.143，均P<0.05），且在2、4、6、10、12、14 d痛觉反应时间显著缩短（t=3.338、4.897、4.782、5.038、8.000、7.556，均P<0.05）（图1）。

2.2 姜黄素对CIPN小鼠炎症反应的影响

与对照组相比，PTX组血清和背根神经节中促炎因子TNF-α、IL-6水平显著升高（血清：F=261.578、501.432；背根神经节F=479.276、103.456，均P<0.001），而抗炎因子IL-10水平显著降低（血清：F=684.531；背根神经节：F=701.078，均P<0.001）；与PTX组相比，PTX+姜黄素组血清和背根神经节中TNF-α、IL-6水平显著下降（血清：t=8.374、9.224；背根神经节：t=12.388、8.425，均P<0.001），IL-10水平显著上升（血清：t=14.186；背根神经节：t=14.795，均P<0.001）。见图2。

2.3 姜黄素对CIPN小鼠表皮内神经纤维的影响

与对照组相比，PTX组表皮神经纤维密度下降（F=17.831，P<0.001）；与PTX组相比，PTX+姜黄素组表皮神经纤维密度上升（t=3.370，P=0.003）。见图3。

2.4 姜黄素对CIPN小鼠背根神经节巨噬细胞极化的影响

与对照组相比，PTX组M1型巨噬细胞比例（F=157.230，P<0.001，η²=0.96）和M1/M2比值（F=74.959，P<0.001）显著升高，而M2型巨噬细胞比例显著降低（F=52.570，P<0.001）；与PTX组相比，PTX+姜黄素组M1型巨噬细胞比例（t=13.315，P<0.001）和M1/M2比值（t=15.079，P<0.001）显著下降，M2型巨噬细胞比例显著上升（t=21.175，P<0.001），见图4。

2.5 姜黄素对PTX培养巨噬细胞极化的影响

与对照组相比，PTX组M1型巨噬细胞比例（F=22.623，P<0.001）和M1/M2比值（F=98.091，P<0.001）显著升高，同时M2型巨噬细胞比例显著降低（F=51.832，P<0.001）。与PTX组相比，PTX+姜黄素干预后M1型巨噬细胞比例（t=6.847，P<0.001）和M1/M2比值（t=17.182，P<0.001）均显著下降，而M2型巨噬细胞比例则显著升高（t=35.130，P<0.001）（图5）。

2.6 姜黄素对PTX培养巨噬细胞共培养背根神经节神经元的影响

与对照组相比，PTX组背根神经节神经元存活率降低（F=86.981，P<0.001），轴突长度缩短（F=36.025，P<0.001）；与PTX组相比，PTX+姜黄素组背根神经节神经元存活率提升（t=11.203，P<0.001），轴突长度增加（t=10.574，P<0.001）。见图6。

2.7 姜黄素通过诱导巨噬细胞极化促进CIPN后神经功能修复的可能机制

综合本次研究结果发现，姜黄素能够改善PTX诱导CIPN小鼠的痛觉过敏症状，减轻神经炎症并促进表皮神经纤维再生，推测姜黄素可能通过诱导巨噬细胞M2型极化促进背根神经节神经元存活和轴突再生，进而修复CIPN小鼠神经功能，其可能的作用机制，见图7。

3 讨 论

随着癌症治疗技术的进步，患者生存率逐步提高，癌症治疗的长期副作用也成为了研究的热点。CIPN的常见症状包括在无外界有害刺激的情况下出现持续的刺痛、灼痛和感觉丧失，该病症通常呈现特征性的“袜套-手套”样分布模式（即四肢远端对称性感觉异常），可在治疗结束后持续数月甚至数年，不仅严重影响患者的生活质量，甚至会导致癌症治疗延迟或中止^[12-13]。尽管CIPN被视为一种神经病理性疼痛，但当前针对该病症的药物治疗疗效不甚理想，且存在头晕、恶心、嗜睡和呕吐等不良反应^[14]。因此，探索CIPN的病理机制、开发预防或治疗CIPN的方法是有效控制癌症、提高癌症幸存者生活质量的关键。已有多项研究表明，姜黄素在多种外周神经疾病模型中表现出一定的预防和逆转神经损伤的作用^[15-17]，本次研究通过腹腔注射PTX建立小鼠CIPN模型，PTX组小鼠机械性和冷异常痛敏反应明显增强，提示CIPN模型造模成功。联合使用PTX与姜黄素时，小鼠50%缩足阈值升高且痛觉反应时间缩短，痛敏反应得到了显著缓解，提示姜黄素具有潜在的镇痛作用，能够减轻PTX诱导的CIPN症状。炎症在CIPN中发挥重要作用，促炎细胞因子可对外周神经的兴奋性造成损伤^[18]，而PTX诱导CIPN的小鼠脊髓中促炎细胞因子水平明显上调^[19]。本次研究同样观察到，PTX组小鼠血清和背根神经节中TNF-α、IL-6水平均较对照组明显升高，抗炎因子IL-10水平则明显下降，经姜黄素干预后，小鼠血清和背根神经节炎症水平下降，提示姜黄素能够减轻PTX诱导的炎症反应。通过测定表皮内神经纤维密度评估无髓神经末梢的变性情况，PTX明显降低了小鼠后爪表皮内神经纤维密度，而服用姜黄素一定程度改善了表皮内神经纤维丢失的情况，提示姜黄素具有促进神经纤维修复和再生的作用，有助于改善CIPN患者的神经功能。

越来越多的证据表明，巨噬细胞可通过神经-免疫相互作用在引发和维持神经性疼痛方面发挥重要作用^[20-21]。在神经或神经元损伤发生后，受损神经元和常驻巨噬细胞释放促炎介质，诱导巨噬细胞浸润至外周感觉系统^[22]。活化的巨噬细胞可分为2大类，M1型巨噬细胞主要参与促炎过程，其释放的TNF-α、IL-6等促炎介质可以激活或敏化感觉神经元，促成慢性疼痛，而M2型巨噬细胞主要发挥抗炎作用^[23]。本次研究观察到CIPN模型小鼠背根神经节M1型巨噬细胞标志物iNOS表达明显上调，M2型巨噬细胞标志物CD206表达下降，M1/M2比例下降，而PTX+姜黄素组iNOS表达水平与M1/M2比例均下降，CD206表达水平提高，提示姜黄素可能通过调节巨噬细胞的极化状态促进炎症消退和神经修复。为探究姜黄素是否直接影响PTX诱导巨噬细胞极化，本次研究模拟了PTX暴露的环境，对巨噬细胞进行体外培养。与体内实验结果一致，PTX+姜黄素组M1型巨噬细胞比例和M1/M2比值较PTX组显著降低，而M2型巨噬细胞比例显著升高，进一步证实了姜黄素在调节巨噬细胞极化方面的作用。此外，考虑到巨噬细胞与神经元的相互作用在神经炎症和疼痛调节中的重要性，本次研究设计了巨噬细胞与背根神经节神经元共培养的实验，通过Transwell小室系统模拟体内微环境，探究姜黄素对PTX诱导CIPN环境中巨噬细胞对神经元功能的影响。PTX组背根神经节神经元存活率降低且轴突长度缩短，提示PTX处理的巨噬细胞对神经元具有损伤作用，而经PTX与姜黄素共同处理后，巨噬细胞对神经元的损伤减轻，推测姜黄素可能通过调节巨噬细胞极化减轻神经元损害，促进神经元生长发育。

综上所述，姜黄素可能通过调节巨噬细胞极化减轻炎症反应、促进神经纤维修复和再生、减轻背根神经节神经元损伤，从而缓解PTX诱导CIPN小鼠的临床症状。已知巨噬细胞的极化受到多种信号通路的调控，如核因子-κB、信号传导与转录激活因子等^[24-25]。这些信号通路在响应外界刺激时的活性变化可影响巨噬细胞的极化方向与功能，由此可以推测姜黄素可能通过这些信号通路来调节巨噬细胞的极化状态。然而关于姜黄素通过何种机制影响巨噬细胞极化并实现对CIPN的缓解效果，这一过程中涉及的关键信号通路和调控因子仍待进一步深入探索。

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