基于代谢组学的延胡索对DSS诱导溃疡性结肠炎的治疗作用及机制解析

Therapeutic effect of Rhizoma Corydalis on ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate and its mechanism： a study based on metabolomics

摘要

目的：探讨延胡索（Corydalis Rhizoma,CR）对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate,DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）模型的干预效果，通过代谢组学及炎症相关生物标志物检测，系统解析CR治疗UC的潜在机制。方法：构建小鼠UC模型，分为5组，模型组、高剂量组（1.517 g/kg生药）、中剂量组（0.986 g/kg生药）、低剂量组（0.455 g/kg生药）和阳性药物组（718.8 mg/kg,5-氨基水杨酸）。另设未造模小鼠作为空白组（灌胃0.9%NaCl）。各组小鼠连续给药7 d，动态监测实验动物体质量变化、疾病活动指数（disease activity index,DAI）、日均摄食量及饮水量等表型参数，7 d后处死动物，获取血清和结肠组织；ELISA法定量分析血清促炎因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)、C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平；通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS）进行非靶向代谢组学分析，比对各组血清代谢物谱差异；小鼠相同方法造模并进行验证，阳性药物选择谷胱甘肽（glutathione,GSH），随后评估结肠长度和黏膜损伤，实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测结肠组织中GSH合成通路关键基因，即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS）、氧化应激调控因子（yap1p、skn7）及线粒体GSH转运蛋白（Slc25a39）的mRNA相对表达量。结果：CR可明显改善模型动物质量减轻，DAI增加和结肠长度缩短等相关评测指标，且呈剂量依赖性；血清中IL-6、CRP和TNF-α水平降低，而IL-17A无明显影响；代谢组学分析显示，有21种潜在的与氨基酸和脂质代谢相关的生物标志物，在CR作用下明显调节；验证实验证实CR和GSH治疗对结肠黏膜损伤表现出明显保护作用，但不影响结肠长度；CR上调了GSH合成相关基因的表达，特别是γ-GCS，表明其可增强肠的抗氧化防御作用。结论：CR在DSS诱导的UC小鼠模型中具有治疗潜力，可缓解症状、降低血清炎症标志物和调节代谢途径；GSH合成相关基因的上调，提示药物可增强肠抗氧化防御。

Abstract

Objective To investigate the interventional effect of Rhizoma Corydalis on mice with ulcerative colitis（UC） induced by dextran sulfate sodium（DSS），as well as the potential mechanism of Rhizoma Corydalis in the treatment of UC based on metabolomics and inflammation biomarkers. Methods A mouse model of UC was established，and then the mice were divided into model group，high-dose group（1.517 g/kg crude drug），middle-dose group（0.986 g/kg crude drug），low-dose group（0.455 g/kg crude drug），and positive drug group（5-aminosalicylic acid at a dose of 718.8 mg/kg），while the mice without modeling were selected as normal group （0.9% NaCl by gavage）. The mice in each group were administered for 7 consecutive days，and phenotypic parameters were dynamically monitored，such as body weight change，disease activity index（DAI），mean daily food intake，and daily water intake. The mice were sacrificed after 7 days to collect serum and colon tissue samples； ELISA was used to measure the serum levels of the proinflammatory factors interleukin-6（IL-6），interleukin-17A（IL-17A），C-reactive protein（CRP），and tumor necrosis factor-α（TNF-α），and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF/MS） was used to perform the non-targeted metabolomics analysis and compare the differences in serum metabolite profiles between groups. The mice were selected for modeling and validation with the same method，and glutathione（GSH） was selected as the positive drug. Colon length and mucosal damage were assessed，and quantitative real-time PCR was used to measure the relative mRNA expression levels of the key genes in the glutathione synthesis pathway（γ-glutamylcysteine synthetase［γ-GCS］ and oxidative stress regulators yap1p and skn7） and mitochondrial GSH transporter protein（Slc25a39） in colonic tissue. Results Rhizoma Corydalis significantly improved weight loss，DAI，and colon length in a dose-dependent manner in the model animals，and there were reductions in the serum levels of IL-6，CRP，and TNF-α，while it had no significant effect on IL-17A. The metabolomics analysis revealed 21 potential biomarkers associated with amino acid and lipid metabolism，which were significantly regulated by Rhizoma Corydalis. In the verification experiment，both Rhizoma Corydalis and GSH exerted a significant protective effect against colonic mucosal damage without affecting colon length. Rhizoma Corydalis upregulated the expression of genes associated with glutathione synthesis，especially γ-GCS，suggesting that Rhizoma Corydalis could enhance intestinal antioxidant defenses. Conclusion Rhizoma Corydalis has a therapeutic potential in a mouse model of DSS-induced UC and can alleviate symptoms，reduce the serum levels of inflammatory markers，and regulate metabolic pathways，and upregulation of the genes associated with glutathione synthesis suggests that the drug can enhance intestinal antioxidant defenses.

Graphical abstract

关键词

延胡索 / 溃疡性结肠炎 / 代谢组学 / 谷胱甘肽代谢 / 炎症标志物

Key words

Rhizoma Corydalis / ulcerative colitis / metabolomics / glutathione metabolism / inflammatory markers

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以直肠和结肠黏膜慢性炎症为特征的炎症性肠炎^[1]。UC的常见症状是血性腹泻，通常伴随剧烈腹痛^[2]。该疾病临床病程难以预测，主要表现为病情渐进性加重与缓解交替出现，反复发作，病理生理机制复杂且尚未完全阐明。现有研究表明，肠上皮细胞和抗原呈递细胞（如肠道固有层中的巨噬细胞和树突状细胞）中Toll样受体（toll like receptors，TLRs）的激活，会触发核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）等转录因子及其他炎症级联反应的激活，在UC的发展过程中起着重要作用^[3-5]。当前用于UC治疗的激素、抗生素和免疫抑制剂等药物，仅能使约50%~60%的患者症状得到缓解^[6-7]。外科手术干预虽可作为选择，但往往伴随高复发率和潜在不良反应^[8]。UC患者10年后发生结肠癌的风险明显增加，这使得该疾病的管理极具挑战性^[9]。针对UC患者的有效治疗方案，不仅需要实现疾病缓解，还应通过减轻肠道炎症、改善腹泻出血和腹痛症状、预防复发来维持缓解状态。鉴于常规西药治疗存在的固有局限性及传统临床方案在UC长期管理中显现疗效不足的现状，具有多成分协同作用和整体调节优势的中药，正逐渐成为优化该病治疗的重要研究对象^[10-11]。

中医理论认为UC归属于“痢疾”“肠澼”“肠风”“肠痈”“脏毒”等范畴，其病机主要可用虚实夹杂、寒热错杂、气血失调概括^[12-13]。UC患者无论出于哪个阶段均表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便，“久病必瘀，久病气虚血瘀，寒凝血瘀，气滞血瘀，阴虚血涩致瘀”，因此学者认为UC的主要特征为病位多累积于脾，气滞和血瘀为主要病机^[14-15]。延胡索（Corydalis Rhizoma，CR），始载于《雷公炮炙论》，为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang 的干燥块茎，性味辛、苦、温，归肝、脾经^[16]。《本草纲目》中记载“（延胡索）能行血中气滞，气中血滞，故专治一身上下诸痛，用之妙也”。CR具有强效镇痛作用，常被用于缓解UC引发的剧烈腹痛^[17]。CR所含生物碱成分，如原小檗碱类、阿片类生物碱以及卟啉类生物碱，是其发挥镇痛功效的关键物质基础^[18-19]。该药材常作为复方补剂用于控制UC相关腹痛，并通过促进胃蠕动、减轻胃痉挛，改善消化功能^[20]。此外，CR还具有抗癌、抗病毒、抗菌及抗炎特性^[21]。结合UC的病理特征与临床应用，使CR有望成为UC治疗中颇具潜力的替代或辅助治疗药物。

本研究采用常见的UC小鼠模型，通过小鼠自由饮用含4%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）水溶液1周后，观察给予CR水提取物对其的治疗效果。此外，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）联用技术分析CR给药前后血液代谢物的变化，旨在阐明其潜在药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 受试药物与试剂

黄连碱（CAS编号：3486-66-6）、小檗碱（CAS编号：2086-83-1）、氯化巴马汀（CAS编号：10605-02-4）以及四氢帕马丁（CAS编号：10097-84-4）。其中小檗碱与氯化巴马汀购自成都埃法生物科技有限公司，黄连碱由成都曼思特生物科技有限公司提供，四氢帕马丁则采购自成都德斯特生物技术有限公司。所有化合物均用甲醇溶解至100 μg/mL浓度。DSS（希伯奥公司，中国，CAS编号：OR1801A），用超纯水配制成4%终浓度溶液。CR购自成都中医药大学附属医院，并在实验室采用标准流程进行提取。具体操作如下：将100 g延胡索干燥全根置于500 mL水中煎煮2次，每次1 h。所得滤液经蒸发、浓缩、干燥后，最终获得1克提取物，相当于7.9 g生药。选用5-氨基水杨酸（美沙拉嗪，5-ASA，麦克林公司，中国，CAS编号：C10825168）作为治疗单纯性轻中度UC缓解期及维持治疗的阳性药物。谷胱甘肽（glutathione，GSH，麦克林公司，中国，CAS编号：70-18-8）。

1.2 实验动物

实验选用SPF级昆明种小鼠（体质量22~25 g），雄性，购自重庆医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK（渝）2018-0003]。小鼠饲养于成都中医药大学独立通风笼具（individually ventilated cages，IVC）系统动物实验室，在无菌环境下采用12 h明暗交替光照周期，恒温恒湿条件（温度20 ℃~25 ℃，湿度55%~60%）进行标准化管理。本研究开展的所有动物实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准（编号：2024080），严格遵循《实验动物管理条例》和《实验动物福利伦理审查指南》，最大限度减少实验动物的不适与痛苦。

1.3 CR提取物化学成分的鉴定与分析

采用液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）对CR提取物的化学成分进行鉴定与分析。主成分检测使用赛默科学万世系列液相色谱-Q-Exactive轨道阱质谱联用仪（Thermo，USA）。分别配制1 mg黄连碱、1 mg小檗碱、1 mg氯化巴马汀和1 mg四氢帕马丁的甲醇标准溶液，在10 mL容量瓶中稀释至100 μg/mL浓度。CR提取物用超纯水调整至132.3 mg/mL浓度。超声处理1 min后，取0.5 mL样品溶液加入3 mL甲醇，于4 ℃、17 500 r/min离心15 min，取上清液进行超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析。CR主要成分在以下色谱条件下分离：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，Waters，美国）；流动相为乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0~5 min，5%A→10%A；5~10 min，10%A→20%A；10~15 min，20%A→30%A；15~40 min，30%A→90%A；40~45 min，90%A）；总运行时间45 min；流速0.4 mL/min；检测范围50~1 100 MZ；柱温35 ℃；进样量1 μL。

1.4 CRD对DSS诱导的UC小鼠模型中的药效学研究

1.4.1 代谢组学分组、模型建立与给药方案

基于实验室前期的实验方法学研究^[22]，小鼠自由摄取4% DSS溶液持续7 d，以肉眼可见血便为造模成功指标构建UC模型。将造模成功小鼠分为5组，每组6只受试动物：模型组、CR高剂量组（灌胃1.517 g/kg生药）、CR中剂量组（灌胃0.986 g/kg生药）、CR低剂量组（灌胃0.455 g/kg生药）和阳性药物组（灌胃5-氨基水杨酸，718.8 mg/kg，5-ASA）。另设未诱导小鼠作为空白组（n=6，灌胃0.9%NaCl）。各组小鼠连续给药7 d。

1.4.2 样本采集与检测

研究过程中，每日监测小鼠的体质量、饮食及饮水量。根据文献[23]中的既定标准评估疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分，并分析小鼠存活率及记录死亡情况。实验第8天对小鼠实施安乐死，采集血清与肠道样本——肠道样本从肛门至回盲部截取。检查结肠是否存在溃疡或出血，并采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法检测肠道损伤。

从各实验动物组采集的血清样本中，检测了包括白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在内的炎症标志物浓度。使用中国上海碧云天生物技术有限公司提供的检测试剂盒，严格遵循试剂盒操作指南执行。

1.5 血液代谢物组学研究

1.5.1 超高效液相色谱-高分辨质谱分析

100 μL乙腈与50 μL血清混合，涡旋震荡60 s，4 ℃，13 500 r/min离心15 min。随后将上清液转移至自动进样瓶待测。代谢组学分析采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用系统（赛默飞世尔：Q Exactive；美国）。色谱分离使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×150.0 mm，1.8 μm，沃特世，美国），以含0.1%甲酸的水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）作为流动相。超高效液相系统在40 ℃下以0.25 mL/min流速运行，采用线性梯度洗脱程序：2%A（0~1 min）；2%~50%A（1~9 min）；50%~98%A（9~12 min）；98%A（12~13.5 min）；98%~2%A（13.5~14 min）；2%A（14~20 min）。电喷雾电离质谱（ESI-MSn）分别在正负离子模式下运行，喷雾电压分别为3.8 kV和-2.5 kV。离子源温度保持325 ℃，鞘气流量30 arb，辅助气流量10 arb。质谱数据采用中心离子采集模式，质量扫描范围m/z 81~1 000，进样量3 μL。

1.5.2 潜在生物标志物的鉴定

采用Proteowizard软件（v3.0.8789）处理原始质谱数据并转换为mzXML格式，生成包含各样本离子及其对应强度的完整矩阵。后续研究使用R环境（v3.1.3）中的XCMS软件包进行峰检测、过滤与对齐等操作，由此获得峰面积、强度、保留时间及质荷比（m/z）等特征数据。对归一化数据进一步开展主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），其结果通过得分图呈现。随后将数据导入R（v3.1.3）绘制火山图，从中筛选具有统计学差异的峰进行后续表征分析。

通过“质量误差≤30 ppm”的标准确保代谢物鉴定的准确性。查询了多个数据库以寻找潜在生物标志物，包括KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）、人类代谢组数据库（HMDB）（http：//www.hmdb.ca）、METLIN（http：//metlin.scripps.edu）、Massbank（http：//www.massbank.jp/）、LipidMaps（http：//www.lipidmaps.org）以及mzClound（https：//www.mzcloud.org）。使用Metaboanalyzer 3.0软件对发现的代谢物进行进一步分析和富集。

1.6 验证实验

1.6.1 分组与样本采集

验证实验共设置6个实验组，每组4只小鼠。空白组、模型组、高、中、低剂量组的造模及给药操作流程与代谢组学实验中对应组别保持一致。阳性药物为GSH组（腹腔注射115 mg/kg GSH，记为GSH-P）。给药结束后，采用3%戊巴比妥钠处死动物，获取结肠，测量结肠长度，进行黏膜病理评分。

1.6.2 RT-PCR检测结肠组织中GSH合成通路关键基因表达量

结合代谢组学实验结果，考察结肠上皮细胞中富集通路的包括γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）、转录因子yap1p31、skn7应答调节因子以及slc25A39蛋白的4种关键酶的基因表达水平。全RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，中国北京）从结肠上皮细胞中提取总RNA。随后使用RT EasyTM Ⅱ试剂盒（福际生物技术有限公司，中国成都）在T100型PCR仪（Bio-Rod，美国）上将提取的总RNA反转录为cDNA。定量实时PCR采用Real Time PCR EasyTM-SYBR Green Ⅰ试剂盒（福际生物技术有限公司，中国成都）在CFXConnetTM荧光定量PCR仪（Bio-Rod，美国）上完成。扩增所用引物序列见表1，以β-actin作为内参。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司定制合成，所有反应均设置复孔，2^{-（ΔΔCt）}法计算相对mRNA表达水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 28.0进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。数据采用单因素方差分析来评估统计学差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CR 提取物中黄连碱、四氢帕马丁、小檗碱、氯化巴马汀的含量分析

采用LC-MS技术分析了CR提取物中的主要成分。如图1所示，4种标准物质——黄连碱、四氢帕马丁、小檗碱和盐酸巴马汀的保留时间分别为11.76 min、11.88 min、13.43 min和40.19 min（图1B）。CR提取物中的主要成分与标准物质在保留时间一致。CR提取物中黄连碱、四氢帕马丁、小檗碱和盐酸巴马汀的含量分别为88.23 μg/mL、36.36 μg/mL、5.0 μg/mL和30.02 μg/mL。相当于高剂量组实验动物分别摄入了1.32 mg/kg黄连碱、0.54 mg/kg四氢帕马丁、0.08 mg/kg小檗碱和0.45 mg/kg盐酸巴马汀。

2.2 CR提取物可明显缓解DSS诱导的UC症状

如图2A所示，在为期7 d的给药过程中，模型组小鼠的体质量明显低于空白组，尤其是在2 d时，模型组小鼠的平均体质量明显下降了8.4%，而其他组动物的体质量没有明显变化。如图2B和2C所示，各组动物对水和食物的消耗量保持相对稳定。图2D显示，模型组动物7 d生存率为50%。经过治疗后，小鼠的生存率明显提高，在高剂量和中等剂量组没有死亡记录。与空白组（0.04±0.13）相比，模型小鼠的DAI得分（2.03±1.32）明显更高（P<0.001）。如图2F所示，治疗后，各组小鼠的DAI评分均有所下降（0.1±0.24至0.42±0.7），与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。与正常小鼠[（9.58±0.77） cm]相比，UC小鼠的结肠长度减少[（8.15±1.04） cm]（P<0.05）。与模型组相比，接受CR（高、中、低剂量组）和5-ASA治疗的小鼠结肠长度缩减症状得到明显改善，已与空白组结肠长度接近（图2E）。病理分析（图2G和2H）突出了CR对DSS诱导的UC小鼠的影响。镜下检查显示，模型组结肠组织的黏膜上皮细胞坏死，黏膜下有大量炎症细胞浸润。然而，用药之后，症状均得到明显改善。根据已建立的参考标准^[24]对结肠样本进行的显微镜评估显示，模型组（4.00±0.00）和空白组（0.00±0.00）之间的病理损伤差异有统计学意义（P<0.001）。在所有给药组中，溃疡和炎症细胞浸润呈剂量依赖性减少（1.00±1.00至2.33±0.58）。

2.3 CR可降低DSS诱导的UC小鼠血清中TNF-α、IL-6和 IL-17A的浓度

图2I~L中的数据表明，与对照组相比，服用DSS后小鼠血液中的CRP、TNF-α和IL-6水平明显升高（P<0.05）。使用CR治疗后，这些炎症细胞因子的水平降至与对照组相当。但是，与对照组相比，IL-17的血清浓度在各组中均未出现明显变化。

2.4 模式识别和潜在生物标志物的鉴定

血清代谢组学的预处理数据使用Simca14.1进行多变量统计分析。图3A~D中的PCA和PLS-DA散点图说明了数据点在正离子和负离子模式下的分布，不同颜色的点代表不同的分组。结果表明，各组内的数据点有明显的聚类。模式识别图显示，正常小鼠和UC模型小鼠之间成功地进行了区分，这表明UC诱导了血清代谢谱的改变。此外，不同剂量的CR组与模型组明显区分开来，并表现出与空白组的相似性。这些结果表明，CR在改善DSS诱导的UC小鼠代谢异常方面具有明显疗效。

此外，本研究共鉴定出21个潜在代谢因子（图4），并基于质谱和保留时间数据在数据库中确定了它们的分子结构。图4是表示小鼠血清中这些生物标志物强度的方框图。在 UC小鼠模型中，某些氨基酸和脂质明显增加，这表明在 DSS诱导的UC小鼠中，氨基酸和甘油磷脂的生物合成失调。与正常组相比，模型组的生物标志物水平明显更高（P<0.01）。使用CR后，所有21个生物标志物都明显下调，与模型组相比，差异有统计学意义（P<0.01或0.05），且呈剂量依赖性。这些研究结果表明，CR在缓解与UC相关的代谢紊乱方面具有有益的作用。

2.5 代谢通路分析

通过MetaboAnalyst5.0对潜在生物标志物网络进行了分析，以阐明它们在疾病发病机制中的作用。结果如图 5所示，经通路富集分析验证，在CR提取物治疗后受明显影响的通路包括GSH代谢、氨酰-tRNA生物合成、酪氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸生物合成，以及苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢。

2.6 CR通过GSH途径发挥UC的治疗作用

如图6A所示的分析揭示，与对照组相比所有实验组的结肠长度减少约30%，差异有统计学意义（P<0.01）。采用药物干预后，与模型组相比，特别是GSH和高剂量组，结肠黏膜损伤明显减少，差异有统计学意义（图6B，P<0.001）。

2.7 涉及GSH合成途径的关键酶的Rt-PCR分析

在图6C~F中，通过灌胃给予DSS后，观察到结肠上皮细胞中参与GSH合成的关键酶γ-GCS的表达明显下降。相反，与模型组相比，接受CR治疗的组中γ-GCS的基因表达明显上调。此外，数据表明，通过腹腔注射等摩尔剂量的GSH后，γ-GCS的表达明显增加，这一反应与模型组差异明显（图6G）。

3 讨论

实验研究表明，口服CR水提取物能有效缓解UC小鼠症状。观察发现，剂量与疗效之间存在相关性（P<0.05或0.01）。血清代谢组学分析表明，实验组之间有21种代谢物存在明显差异（P<0.05或0.01），包括L-酪氨酸、亚精胺、γ-谷氨酰丙氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、苯乙胺或其衍生物，与已有相关报道UC患者的氨基酸代谢存在紊乱的结果一致^[25-26]。

富集分析显示，这些代谢标志物主要富集在GSH代谢、氨基酰-tRNA生物合成、酪氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢等通路中。值得注意的是，DSS诱导的UC会明显影响GSH的代谢（P<0.001）。在此之前，有研究利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱对77份血清样本（31例患者，46例健康对照）进行了分析，结果就显示GSH代谢是UC患者受影响最大的途径^[27]。

GSH是一种重要的抗氧化剂，在结肠黏膜的防御系统中发挥着至关重要的作用^[28-29]。包括结肠在内的肠道拥有大量生成活性氧代谢物（reactive oxygen metabolites，ROMs）所需的酶系统。肠上皮内如黄嘌呤、胺和醛氧化酶，以及免疫细胞的NADPH氧化酶，都是胃肠道中活性氧代谢物的潜在来源^[30]。当活性氧代谢产物（如H₂O₂和O₂-1）的生成超过细胞的抗氧化能力时，ROM水平的升高会导致保护性黏蛋白层降解。黏膜屏障的破坏会使FMLP（N-Formyl-MLF）和内毒素等扩散到固有层，并在那里激活和吸引免疫细胞。肠黏膜固有层中含有大量吞噬细胞，常住中性粒细胞和炎性中性粒细胞可通过激活NADPH氧化酶和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）进一步促进ROM的积累^[31]。ROM水平过高会导致脂质过氧化、透明质酸和胶原降解，以及吞噬性白细胞释放非氧化性毒素，最终导致黏膜溃疡^[32]。因此，UC是结肠黏膜炎症和氧化损伤之间复杂相互作用的最终结果。

GSH在抗氧化防御机制和抵御活性氧（reactive oxygen species，ROS）方面发挥着至关重要的作用^[33-34]。细胞代谢活动会产生ROS，包括超氧化物（O₂-1）和过氧化氢（H₂O₂），通过细胞内还原型GSH和过氧化还原酶（peroxyreductase，Prx）组成的氧化还原缓冲系统进行中和^[35]。在此过程中，GSH转化为其氧化形式GSSG，然后通过GSSG还原酶将其还原为GSH，建立起消耗NADPH的氧化还原循环。随着ROS被中和，这一循环有助于重置细胞内的氧化还原环境^[36]。

肠道中GSH的水平主要受GSH合成的影响，GSH的合成包括γ-GCS将L-谷氨酸和半胱氨酸转化为γ-谷氨酰半胱氨酸^[37]。随后，GSH合成酶将甘氨酸加入γ-谷氨酰半胱氨酸，生成GSH。影响 GSH生成的关键因素包括半胱氨酸（含硫氨基酸的前体）的可用性和限速酶γ-GCS37的活性^[38]。对动物模型血清样本的分析表明，与正常小鼠相比，UC小鼠体内与GSH代谢有关的亚精胺、γ-谷氨酰丙氨酸、L-谷氨酸和焦谷氨酸水平升高。相反，γ-谷氨酰半胱氨酸的水平在UC模型小鼠中较低。值得注意的是，γ-谷氨酰半胱氨酸既是合成GSH的中间体，又具有抗炎特性。正如通过血清代谢组学在 UC 患者中观察到的那样，γ-谷氨酰半胱氨酸水平的降低可能直接导致 GSH 合成不足和肠道防御机制受损^[38]。使用CR治疗后，上述氨基酸水平呈剂量依赖性明显逆转，L-谷氨酸浓度降低，γ-谷氨酰半胱氨酸含量增加。特别是在高剂量CR（1.517 g/kg）时，血清生物标志物水平与空白组相当，这表明CR抵抗UC作用与GSH合成调节之间存在潜在联系。

CR对GSH代谢的影响可能受2个关键因素的影响。一个因素涉及在GSH合成过程中对γ-GCS表达的调控，而另一个因素则与CR条件下线粒体 GSH输入和丰度的调控有关。本研究重点是评估CR对4个特定基因表达的影响：γ-GCS、yap1p、skn7和SLC25A39。Yap1p和Skn7是细胞应对氧化应激的关键转录因子，在上调γ-GCS表达中发挥作用^[39]。正常情况下，Yap1p同时分布在细胞质和细胞核中，但在氧化应激过程中，它会迁移到细胞核中，激活包括γ-GCS在内的靶基因的转录^[40]。编码γ-GCS的基因启动子区域含有1个DNA元件，该元件在大多数位置与Yap1反应元件（Yap1 reaction element，YRE）密切匹配，使Yap1能直接结合以调控γ-GCS的表达^[38]。Skn7是另一种转录因子，它是真核生物中独一无二的双组分信号蛋白，对于增强细胞对抗氧化剂的抵抗力至关重要。通过直接与TRX2启动子结合，Skn7与Yap1合作刺激基因表达^[40]。此外，线粒体膜载体SLC25A39正在成为GSH向线粒体转运的关键调节因子^[41-42]。鉴于GSH合成完全发生在细胞质中，SLC25A39水平的改变会直接影响线粒体 GSH的转运和丰度^[43]。延胡索对GSH合成途径的影响见图7。

研究利用q-PCR评估了4个基因（γ-gcs、yap1p、skn7、slc25A39）的表达水平。研究结果表明，CR能明显上调γ-gcs的表达，且呈剂量依赖关系（P<0.05）。此外，还对结肠长度、黏膜损伤评分与结肠上皮细胞中参与GSH合成和抗氧化损伤的基因（γ-gcs、yap1p、skn7、slc25A39）表达之间的关系进行了相关性分析。结果显示，γ-GCS与skn7呈正相关，yap1p与结肠长度呈正相关（图4G）。

在CR压力下，SLC25A39基因的表达保持不变，但当直接给予GSH时，该基因的表达则明显增加。血液中GSH水平的升高可能会通过上调 SLC25A39通道蛋白的表达、促进GSH向线粒体的转运以及增强抗氧化能力来诱导抗UC效应。在 UC 模型动物中观察到的GSH药效学效应证实了这一假设，该效应明显减少了结肠黏膜的损伤（P<0.01）。相反，CR可通过上调γ-GCS的表达来促进GSH的合成，从而减轻UC引起的黏膜细胞损伤。

代谢组分析的结果表明，CR在调节UC动物的氨基酰-tRNA生物合成方面发挥了作用。氨基酰-tRNA生物合成失调与恶性肿瘤的发生有关^[27]。此外，UC模型动物血清代谢物中焦谷氨酸的异常升高，以及CR治疗组焦谷氨酸的明显降低，都表明 CR有可能预测其抑制与UC相关的炎性癌症转化的能力^[44-46]。要验证这一假设，还需要进一步地研究。

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基金资助

成都中医药大学青基人才专项资助项目(QJRC202)

成都中医药大学青基人才专项资助项目(0012)