VWF:Ag在HBV相关性肝脏疾病中的临床作用研究

Clinical role of von Willebrand factor antigen in HBV-related liver diseases

摘要

目的 评估血浆血管性血友病因子（von willebrand factor，VWF）及其血管性血友病因子裂解酶（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif，member 13，ADAMTS13）在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相关肝病（慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭、肝癌）中的诊断价值及临床意义，分析VWF对肝癌细胞的影响。 方法 检测患者及健康人群VWF抗原（von willebrand factor antigen，VWF：Ag）、ADAMTS13及相关临床指标，通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）确定诊断阈值，并分析不同治疗策略对肝癌患者VWF：Ag水平的影响。利用细胞计数试剂盒-8（cell counting Kit-8，CCK-8）实验检测VWF蛋白对HepG2.2.15肝癌细胞增殖的影响，并分析其对甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）分泌的影响。 结果 ①除肝炎组外，各肝病组的VWF：Ag均明显高于健康组（P<0.001），而ADAMTS13在各组均升高（P<0.001）；②VWF：Ag与丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、纤维蛋白或纤维蛋白原降解产物（fibrin/fibrinogen degradation product，FDP）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）/白蛋白（albumin，ALB）呈正相关，与血小板计数（platelet count，Plt）、ALB、ALT/AST呈负相关；③VWF：Ag诊断截断值：肝炎组74.5%（AUC=0.604）、肝硬化代偿组162.5%（AUC=0.784）、失代偿组203.5%（AUC=0.999）、肝衰竭组227.1%（AUC=0.999）、肝癌组182.5%（AUC=0.945）；④肝癌患者VWF：Ag与肝功能分级相关（失代偿>代偿，P<0.05），与治疗方式无关；⑤0.04 μg/mL VWF抑制肝癌细胞增殖（P<0.05）。 结论 VWF：Ag是HBV相关肝病进展的有效生物标志物，其水平反映肝功能损伤程度，且低浓度VWF能抑制肝癌细胞增殖，但ADAMTS13水平升高与疾病严重性无明确关联。

Abstract

Objective This study aimed to evaluate the diagnostic value and clinical significance of plasma von Willebrand factor （VWF） and its cleaving protease ADAMTS13（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif，member 13） in hepatitis B virus（HBV）-associated liver diseases（chronic hepatitis，cirrhosis，hepatic failure，hepatocellular carcinoma），and to investigate the effects of VWF on hepatocellular carcinoma（HCC） cells. Methods VWF antigen（VWF：Ag），ADAMTS13 levels，and clinical parameters were measured in patients and healthy controls. Diagnostic thresholds were determined through ROC curve analysis. The impact of different therapeutic strategies on VWF：Ag levels in HCC patients was assessed. CCK-8 assays were employed to examine the effects of VWF protein on HepG2.2.15 cell proliferation and alpha-fetoprotein（AFP） secretion. Results ①VWF：Ag levels were significantly elevated in all liver disease groups compared to controls（P<0.001），except in hepatitis patients. ADAMTS13 antigen levels increased across all disease groups（P<0.001）.②VWF：Ag demonstrated positive correlations with alanine aminotransferase （ALT），aspartate aminotransferase（AST），total bilirubin（TBIL），AFP，fibrin/fibrinogen degradation products（FDP），prothrombin time（PT），and TBIL/albumin（ALB） ratio（all P<0.05），while showing negative correlations with platelet count（PLT），ALB，and ALT/AST ratio. ③Diagnostic cutoff values for VWF：Ag were established：74.5%（AUC=0.604） in hepatitis group，162.5%（AUC=0.784） in liver cirrhosis compensatory group，203.5%（AUC=0.999） in decompensated group，227.1%（AUC=0.999） in liver failure group，182.5%（AUC=0.945） in liver cancer group. ④HCC patients exhibited VWF：Ag levels correlating with hepatic functional reserve（decompensated > compensated，P<0.05），independent of treatment modalities. ⑤Low-dose VWF（0.04 μg/mL） significantly inhibited HCC cell proliferation（P<0.05）. Conclusion VWF：Ag serves as a robust biomarker for monitoring HBV-related liver disease progression，with levels reflecting hepatic functional impairment. The antiproliferative effect of low-concentration VWF on HCC cells suggests potential therapeutic implications. However，ADAMTS13 elevation showed no definitive association with disease severity.

Graphical abstract

关键词

血管性血友病因子 / 血管性血友病因子裂解酶 / 乙型肝炎病毒 / 生物标志物 / 临床研究

Key words

von Willebrand factor / a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif，member 13 / hepatitis B virus / biomarker / clinical study

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种临床常见、传染性较强的DNA病毒，属于嗜肝病毒科，HBV引起的乙型肝炎在全世界广泛流行，其感染具有潜伏性。HBV感染引起的肝炎，肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）依旧是全球性严重的公共卫生问题^[1]。据世界卫生组织报道，全球约有20亿人曾感染过HBV，其中约有3.6亿为慢性乙型病毒肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者，其中10％~20％可发展为肝硬化，而肝硬化患者若不能及时干预最终有1％~5％可发展为HCC^[2]。因此，CHB被广泛认为是导致HCC发生的主要高危因素之一。我国80%的HCC患者合并HBV感染，HBV感染者较正常人群发生HCC的概率更高^[3]。HCC发病隐匿，恶化迅速，早期缺乏典型症状，一旦发现多于中晚期，近80%的HCC患者就诊时已失去根治性手术治疗的最佳时机^[4]。因此，寻求HBV相关性肝脏疾病的早期诊断和预测标志物显得尤为重要。近年来，许多生物标志物已被开发用于评估肝硬化、肝癌的进展及预后，包括血清肿瘤标志物、中性粒细胞、淋巴细胞比值、甲胎蛋白、透明质酸等^[5-9]，但其存在许多不足，例如缺乏公认的诊断阈值，早期诊断敏感性不佳，容易受到其他因素（如炎症）影响等，因此亟需发现一种更为高效稳定，能评估HBV相关性肝脏疾病发展的生物标志物。

血管性血友病因子（von willebrand factor，VWF）是一种多聚体糖蛋白。正常情况下，VWF主要由血管内皮细胞和巨核细胞合成，血小板也可以合成少量VWF^[10]。肝损伤时，肝窦内皮细胞也可表达VWF，VWF可引起血小板在血管损伤部位黏附聚集形成微血栓^[11-13]，是反映血管内皮受损的标志物之一^[14]。血管性血友病因子裂解酶（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif，member 13，ADAMTS13）是VWF的特异性裂解酶，血浆中ADAMTS13主要来源于肝星状细胞和血管内皮细胞，ADAMTS13的异常将影响VWF的分子大小^[15]。近年来，围绕血管性血友病因子抗原（von willebrand factor antigen，VWF:Ag）作了很多的研究。Curakova Ristovska E等^[16]发现VWF:Ag可预测肝硬化患者的死亡率，Schwarzer R等^[17]研究发现VWF:Ag与血小板的比值较VWF:Ag更好地预测肝硬化患者的失代偿与死亡率，Takaya H等^[18]研究发现 VWF:Ag与VWF 的裂解酶ADAMTS13可用于观察肝细胞癌患者进行索拉非尼靶向药物治疗的疗效，该课题组利用VWF:Ag与ADAMTS13也观察了肝细胞癌患者进行肝动脉灌注化疗的疗效^[19]。Driever EG等^[20]研究了VWF/ADAMTS13的不平衡会导致患者凝血与纤溶的异常，从而影响急性肝衰竭患者的预后。

HepG2.2.15是人肝癌细胞HepG2的衍生株。该细胞株由2个头尾相连的HBV-DNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成，可在体外无性繁殖，能够长期稳定地在细胞培养上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒，而且还能产生大量的复制中间体，是目前研究HBV复制、肝细胞免疫应答的细胞株。

VWF:Ag是临床检测VWF表达水平的指标。大量证据表明^[16-19]，血浆VWF:Ag在肝硬化的转归、肝癌的疗效观察中具有重要研究价值，但VWF:Ag对HBV感染的原发性肝细胞癌的作用，目前研究甚少。本研究旨在观察VWF:Ag在CHB、HBV相关肝硬化、肝衰竭、HBV相关HCC中的表达情况，了解VWF:Ag在HBV感染相关性肝脏疾病演变中的作用。分析经各种治疗策略干预后的肝细胞癌患者血浆VWF:Ag与ADAMTS13的水平，探讨差异出现的临床意义。进一步研究VWF对HepG2.2.15肝癌细胞增殖的影响，以及对肝癌标志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）表达的影响，评估VWF在由HBV感染引起的原发性肝细胞癌中的作用，为原发性肝细胞癌的诊断、治疗以及预后探索新的研究思路。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集2020年9月至2023年4月重庆医科大学附属第二医院健康人群108例、CHB 128例、HBV相关肝硬化代偿组48例、HBV相关肝硬化失代偿组98例、HBV相关肝衰竭组130例、HBV相关肝癌组471例。纳入标准：①患者为HBV感染或HBV相关性肝脏疾病；②患者或患者家属自愿参与并签署知情同意书。排除标准：①合并其他类型肝炎；②精神系统疾病，无法正常沟通交流；③因药物或乙醇导致的肝脏疾病；④妊娠期或哺乳期患者。本研究经重庆医科大学附属第二医院伦理委员会审查批准[批件号：2024年伦审第（125）号]。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与试剂

检测纳入研究的患者及对照组的实验室指标包括，反映肝功能的标志物：白蛋白（albumin，ALB）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、TBIL/ALB、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、ALT/AST；反映凝血与纤溶功能的标志物：血小板计数（platelet count，PLT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、纤维蛋白或纤维蛋白原降解产物（fibrin/fibrinogen degradation product，FDP）；肿瘤标志物：甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）；血浆VWF:Ag。空腹静脉血置于不同真空采血管中。SYSMEX XN系列全自动血细胞分析流水线、日立7600-210全自动生化分析仪、STAGO全自动血凝仪、索灵化学发光仪、罗氏411化学发光检测仪，使用配套的定标品、质控品或者佰乐的定标品、质控品。样本检测前均确保室内质控在控。

1.2.2 血浆ADAMTS13含量测定

收集CHB、HBV相关肝硬化、肝衰竭、HCC患者以及正常对照组的枸橼酸钠抗凝的抗凝血，3 550 r/min离心15 min，收集上层血浆，置于-80 ℃冰箱保存，使用过程中避免反复冻融。在开始测定时，需提前将血浆置于37 ℃孵箱复融。采用ADAMTS13酶联免疫吸附实验试剂盒（江苏酶免实业有限公司Jiangsu Meimian industrial Co.Ltd，批号：202112），对患者和健康对照组的血浆ADAMTS13含量进行测定，酶标仪读板，检测结果以µg/mL表示。

1.2.3 评价VWF: Ag作为肝病生物标志物的诊断效能

1.2.3.1 HBV相关性肝病各亚组间VWF:Ag的差异性分析

将2020年9月至2023年4月入组的983例样本，包括健康人群组与HBV相关性肝病各组患者样本，检测血浆VWF:Ag的水平，并进行组间差异分析。

1.2.3.2 VWF:Ag与临床肝病相关生物标志物的相关性分析

分析各组VWF:Ag水平与肝功能相关指标ALT、AST、ALT/AST、TBIL、ALB、TBIL/ALB、AFP、PLT、FDP、PT在诊断CHB、HBV相关肝硬化（代偿与失代偿）、肝衰竭、HCC病理状态下的相关性，计算Spearman相关系数。

1.2.3.3 确定VWF:Ag作为肝病生物标志物的诊断效能

绘制VWF:Ag在CHB、HBV相关肝硬化（代偿与失代偿）、肝衰竭、HCC下的受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），确定最佳阈值，并计算该阈值下的准确率、灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值。

1.2.3.4 比较各生物标志物对HBV相关性肝病的诊断效能

比较VWF:Ag与ALT、AST、ALT/AST、TBIL、ALB、TBIL/ALB、AFP、PLT、FDP、PT对HBV相关性肝病的诊断效能。

1.2.3.5 HBV相关性肝病患者ADAMTS13含量的差异分析

比较分析CHB、HBV相关肝硬化（代偿与失代偿）、肝衰竭、HCC患者的ADAMTS13含量。

1.2.3.6 HBV相关性HCC患者的VWF: Ag与ADAMTS13的差异分析

步骤如下：①临床医生根据肝细胞癌患者的分期选择不同的治疗方式，本研究将肝细胞癌患者根据治疗方式分成肝切除+其他治疗组（早期肝癌）、经导管动脉化疗栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）+其他治疗组（中晚期）、综合治疗组（晚期），分析比较各组间VWF:Ag与ADAMTS13含量。②将所有肝细胞癌患者根据其肝脏功能的代偿状态进一步分为肝癌患者肝硬化失代偿组与肝癌患者肝硬化代偿组。评价2组间的VWF: Ag与ADAMTS13抗原含量。

1.2.4 VWF纯蛋白对HepG2.2.15细胞作用影响的增殖实验

将HepG2.2.15细胞计数后分别以2×10⁴个/mL，每孔加入100 μL接种于96孔细胞培养板中并放入含5% CO₂，37 ℃的培养箱中培养。培养24 h后更换培养基并将VWF纯蛋白分别以0 μg/mL和0.04 μg/mL的浓度加入培养基中，设不加VWF纯蛋白组为对照组，随后放入含5% CO₂，37 ℃的培养箱中培养。分别在加入VWF纯蛋白24、48、72 h后弃去培养基并用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤1次加入100 μL新的培养基，向待检测孔中每孔加入10 μL 细胞计数试剂盒-8（cell counting Kit-8，CCK-8）溶液，随后将96孔板放入含5% CO₂，37 ℃的培养箱孵育1.5 h后测定其吸光度。

1.2.5 细胞上清AFP指标检测

将HepG2.2.15细胞培养24 h后更换培养基并将VWF纯蛋白分别以0.00、0.04、0.20、0.40 μg/mL的终浓度加入培养基中。以不加VWF纯蛋白组为对照组,分别处理细胞24、48、72 h后检测细胞上清中AFP含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件分析数据。正态分布的计量资料以均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示，组间比较使用t检验或方差分析；非正态分布计量资料使用中位数及四分位数[M_d （P₂₅，P₇₅）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验，采用Dunn法进行多重比较组间差异；多重比较显著性以Benjamini-Hochberg方法校正。非正态数据计算Spearman’s相关系数。

VWF纯蛋白对HepG2.2.15细胞增殖和AFP含量的影响采用重复测量设计，分别考察加入VWF的浓度和作用时间对细胞增殖和上清液AFP含量的影响。采用重复测量方差分析考察干预因素，使用Mauchly检验评估球形假设，当违反时采用Greenhouse-Geisser校正。采用Dunnett法以未加入VWF样本为基准，进行多重比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 患者的临床特征

2020年9月至2023年4月共入组983例，健康人群有108例（11%），肝炎有128例（13%），肝硬化代偿有48例（4.9%），肝硬化失代偿有98例（10%），肝衰竭有130例（13.2%），肝癌有471例（47.9%）。各肝病亚组基线特征见表1。年龄、性别以及以下纳入的临床常用于反映肝脏功能的生物标志物，在5个肝病亚组间差异有统计学意义。

2.2 各组人群VWF: Ag检测值的差异分析

健康人群与肝脏疾病各组血浆VWF:Ag的水平见表2，组间差异分析见图1。Kruskal-Wallis H检验提示各组检测值差异有统计学意义（P<0.001）。进一步以Dunn法将各组分别与健康组比较，显著性采用Benjamini-Hochberg校正。结果显示肝硬化代偿组、肝硬化失代偿组、肝衰竭组、肝癌组VWF:Ag的含量均显著高于健康人群组，差异有统计学意义（P<0.001），提示VWF:Ag随着肝病严重程度增加而递增。

2.3 VWF:Ag与临床肝病相关生物标志物的相关性分析

分析各组VWF:Ag水平与ALT、AST、ALT/AST、TBIL、ALB、TBIL/ALB、AFP、PLT、FDP、PT在肝炎、HBV相关肝硬化（代偿与失代偿）、肝衰竭、肝癌多种病理状态下的相关性，计算Spearman’s相关系数，结果见表3。VWF:Ag与ALT、AST、TBIL、AFP、FDP、PT以及TBIL/ALB呈正相关，与PLT、ALB成负相关。其中，VWF:Ag与AST、TBIL、ALB、TBIL/ALB中度相关。

2.4 确定VWF:Ag作为肝病生物标志物的诊断效能

绘制VWF:Ag在肝炎组、HBV相关肝硬化（代偿与失代偿）组、肝衰竭组、HBV相关肝癌组下的ROC曲线，确定最佳阈值，并计算该阈值下的准确率、灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值，见图2。在5种HBV相关肝脏疾病状态下，血浆VWF:Ag均表现出不俗的诊断效能，肝癌组的诊断效能较高（AUC=0.945），肝硬化失代偿组、肝衰竭组表现出最高诊断效能（AUC=0.999）。

2.5 比较其余生物标志物对HBV相关性肝病的诊断效能

比较PLT、ALT、AST、TBIL、ALB、AFP、FDP、PT在HBV相关性肝病的诊断效能，发现PT能有效预测HBV相关性肝脏疾病的发展,与其他临床肝病相关生物标志物相比，PT在各组中的诊断效能均最高（AUC>0.900），肝硬化代偿组、肝衰竭组表现出最高诊断效能（AUC=0.999）。结果见表4。

2.6 HBV相关性肝病患者ADAMTS13的差异分析

共入组610例病例，其中健康人群30例（4.92%），肝炎128例（20.98%），肝硬化代偿期48例（7.87%），肝硬化失代偿期98例（16.07%），肝衰竭107例（17.54%），肝癌199例（32.62%）。各组的ADAMTS13抗原含量分别为：健康人群2.26（1.91，2.54） µg/mL，肝炎4.18（3.14，5.99） µg/mL，肝硬化代偿期3.51（2.92，6.57） µg/mL，肝硬化失代偿期6.43（4.00，8.44） µg/mL，肝衰竭7.84（4.85，9.07） µg/mL，肝癌5.92（2.77，8.12） µg/mL。结果显示肝炎组、肝硬化代偿组、肝硬化失代偿组、肝衰竭组、肝癌组ADAMTS13均显著高于健康人群组，差异具有统计学意义（P<0.001）。见图3。

2.7 HBV相关性HCC患者的VWF:Ag与ADAMTS13的差异分析

2.7.1 根据肝细胞癌患者的分期选择不同的治疗方式分组比较

将肝细胞癌患者根据治疗方式分成肝切除组（早期肝癌）、肝动脉介入治疗（TACE）（中晚期）、综合治疗组（晚期），分析各组间VWF:Ag与ADAMTS13水平，见表5。不同治疗组间的VWF:Ag水平，差异无统计学意义（P=0.055），不同治疗组间的ADAMTS13水平，差异无统计学意义（P=0.586）。

2.7.2 根据肝细胞癌患者肝硬化代偿状态分组比较

将所有肝细胞癌患者根据其肝硬化的代偿状态进一步分为肝癌患者肝硬化失代偿组与肝癌患者肝硬化代偿组，见表6。肝癌患者中失代偿组比代偿组的VWF:Ag显著增高，差异有统计学意义（P=0.021）。肝癌患者中失代偿组比代偿组的ADAMTS13含量稍增高，差异无统计学意义（P=0.305）。

2.7.3 低浓度 VWF蛋白对HepG2.2.15细胞增殖的影响

分别加入终浓度为0 μg/mL和0.04 μg/mL的VWF蛋白，作用24、48、72 h后，对HepG2.2.15细胞的增殖活性进行分析。Mauchly球形检验，差异有统计学意义（P=0.011），采用Greenhouse-Geisser校正自由度。分析结果显示，低浓度VWF对HepG2.2.15细胞增殖影响显著（F=16.512，P=0.015，广义η²=0.735），且低浓度VWF对细胞增殖的影响与培养时间无关（交互效应F=4.355，校正P=0.088，广义η²=0.263）。进一步对24、48、72 h的2组细胞增殖进行比较，发现低浓度VWF对HepG2.2.15细胞增殖有持续抑制作用，但作用24 h差异无统计学意义（P=0.091），作用48 h和72 h后抑制增殖，差异有统计学意义（P=0.005、P<0.001）（图4）。

2.7.4 VWF蛋白对HepG2.2.15细胞上清中AFP水平的影响

分别向培养基中加入0、0.04、0.2、0.4 μg/mL的VWF蛋白，随后分别作用24、48、72 h，以观察不同浓度和时间对细胞的影响。HepG2.2.15细胞上清中AFP的水平变化进行分析。Mauchly球形检验差异有统计学意义（P<0.001），采用Greenhouse-Geisser校正自由度。分析结果显示，加入VWF的浓度和作用时间均对上清液AFP水平的影响差异有统计学意义（VWF浓度：F=54.062、P<0.001、广义η²=0.887；作用时间：F=4 912.146、校正P<0.001、广义η²=0.997），且浓度和作用时间有显著交互效应（F=31.437、校正P<0.001、广义η²=0.879）。AFP浓度随VWF的作用时间而增加（图5）；而在相同作用时间下，进一步的多重比较表明，加入VWF后，细胞上清液AFP的浓度相比未加入VWF时均降低，且作用48h和72 h时，差异有统计学意义（P均<0.05）（图6）。

3 讨论

VWF是一种多聚糖蛋白，多聚体相对分子量在500~20 000 kDa间。由1个信号肽、前肽和成熟VWF蛋白组成。主要合成部位是血管内皮细胞，巨核细胞、血小板亦可合成少量VWF。VWF介导血小板黏附聚集于损伤的血管内皮，且与糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（glycoprotein Ⅱb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）结合，参与血小板聚集；VWF作为凝血因子Ⅷ（clotting factor Ⅷ，FⅧ）的载体蛋白，避免FⅧ被蛋白C灭活，延长FⅧ的活性，支持凝血系统的持续活化。在肝脏疾病中，VWF参与肝脏微循环障碍、调节血管再生、调控肿瘤细胞凋亡及转移，肝脏疾病时，受肝炎病毒、细菌衍生产物、免疫因素、内毒素等多种因素刺激VWF合成增加，VWF大量释放入血。近年来的研究表明，血浆VWF:Ag在肝硬化的转归与肝癌的疗效观察中具有重要研究价值，但VWF:Ag对HBV感染的原发性肝细胞癌的作用，还需进一步研究。

本研究结果可以看出，VWF:Ag随着HBV相关性肝脏疾病的严重程度增加，检测值越高。VWF的表达水平有以下趋势：肝衰竭组>肝硬化失代偿组>肝癌组>肝硬化代偿组>肝炎组。肝脏疾病的血浆ADAMTS13的表达水平较正常人群上调：正常人群<肝硬化代偿组<肝炎组<肝癌组<肝硬化失代偿组<肝衰竭组。VWF:Ag在CHB患者血浆中轻度增高，随着肝脏损伤的加重，VWF:Ag含量逐渐增高，肝衰竭时含量最高。肝衰竭常伴随门脉高压，导致血管内皮细胞承受异常剪切力，触发VWF的释放；全身性炎症（如内毒素血症、细胞因子风暴）刺激内皮细胞分泌VWF。肝衰竭、肝硬化失代偿组、肝癌组的VWF合成明显增加，内皮细胞或血小板可能代偿性分泌ADAMTS13，以应对VWF的过度积累；全身性炎症激活内皮细胞，促进其对ADAMTS13的释放；同时肝脏对ADAMTS13的清除能力下降，可能导致血浆中ADAMTS13抗原水平升高。

相关性分析显示，VWF:Ag与其他临床肝病生物标志物高度相关。当患者的肝脏功能越差，ALT、AST、TBIL、AFP、FDP、PT以及TBIL/ALB检测值越高，PLT、ALB以及ALT/AST比值则越低，VWF:Ag含量越高。临床上，严重肝损伤患者血浆凝血因子活性检查时常显示，除FⅧ外，其余凝血因子因为肝脏功能的降低会出现明显降低。而作为FⅧ载体蛋白的VWF:Ag含量的增高，使FⅧ出现不降反升的情况。

VWF:Ag对HBV相关性肝脏疾病的诊断效能可以看出，VWF:Ag能有效预测HBV相关性肝脏疾病的发展。肝癌组的诊断效能较高（AUC=0.945），肝硬化失代偿组、肝衰竭组表现出最高诊断效能（AUC=0.999），VWF:Ag在肝硬化失代偿组的诊断效能高于本研究涉及的所有其它临床肝病相关的生物标志物。VWF:Ag在肝衰竭组的诊断效能与TBIL、PT相同，高于其余标志物。除VWF:Ag外，PT在肝脏疾病中的诊断效能最高，这与PT作为肝衰竭的诊断标准之一相符合。本研究的结果显示，VWF:Ag有望成为肝硬化的转归、肝衰竭的诊断标准之一。

HBV相关性HCC患者的VWF:Ag水平与其患者本身的肝功能相关，而与肿瘤的分期、临床治疗处理无关。HBV相关性HCC患者的ADAMTS13抗原水平与其患者本身的肝功能无关，与肿瘤的分期、临床处理方式无关。不同治疗组间的VWF:Ag水平（P=0.055）与不同治疗组间的ADAMTS13水平（P=0.586）差异均无统计学意义。在本实验中VWF:Ag与肝癌病情严重程度无关。本研究将HBV相关性HCC患者根据其肝硬化的代偿状态分组，其中失代偿组比代偿组的VWF:Ag显著增高（P=0.021）。但HCC患者中失代偿组与代偿组的ADAMTS13相比，差异无统计学意义（P=0.305），该现象说明HCC患者血浆VWF:Ag的水平变化比ADAMTS13抗原水平的变化有统计意义，在HCC人群中检测VWF:Ag相比ADAMTS13更有临床意义。这与前面各组间VWF:Ag、ADAMTS13的差异分析的结论亦符合。

从本研究的临床患者结果显示，随着HBV相关性肝脏疾病的严重程度增加，肝癌组VWF:Ag并没有如预期升至最高。本课题进一步研究VWF与肝癌细胞的作用，结果显示，低浓度VWF蛋白对HepG2.2.15细胞增殖有明显的抑制作用，这可能是导致肝癌组VWF:Ag增高不如预期的原因：肝癌细胞增殖受到抑制，进一步减少细胞分泌VWF:Ag。HepG2.2.15细胞上清中AFP水平随着培养时间的延长而升高，但加入低浓度VWF蛋白后，AFP的表达受到抑制。AFP是肝癌的重要标志物，结果表明VWF可能抑制HepG2.2.15的AFP表达。后期，本课题将提高VWF蛋白的浓度，使其与血浆水平一致，再进一步研究VWF对肝癌细胞表达AFP、乙肝标志物的影响。

综上，VWF:Ag有助于判断慢性乙肝相关性肝病的发展，可能与原发性肝细胞癌的转归有关。且该生物标志物有望成为继凝血酶原时间后，肝硬化的转归、肝衰竭的诊断标准之一。

参考文献

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基金资助

重庆市自然科学基金面上资助项目(CSTB2022NSCQ-MSX0060)

重庆市自然科学基金面上资助项目(CSTB2023NSCQ-MSX0342)