富氢水通过调节TGF-β1/Smad3信号通路促进大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合

The mechanism of hydrogen-rich water promoting deep second-degree burn wound healing in rats by regulating TGF-β1/Smad3 signaling pathway

摘要

目的 探讨富氢水促进深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合的作用及其分子机制。 方法 将30只SD大鼠随机分为对照组、假烧伤组、模型组、富氢水组、转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）抑制剂组5组，每组6只大鼠。采用圆形高温烫伤仪建立大鼠深Ⅱ度烧伤模型，TGF-β1抑制剂组大鼠在造模前腹腔注射15 mg/kg的SB-431542，造模成功后给药，药物组用玻璃瓶每天给大鼠输送两次200 mL的富氢水，其余各组大鼠常规饮水，连续治疗2周。观察各组大鼠皮肤烧伤组织的愈合情况；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色观察创面组织的病理形态学变化；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）试剂盒检测血清中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的含量；生化试剂盒检测创面组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物阴离子的含量；TUNEL染色检测创面组织的细胞凋亡；免疫组化染色创面组织增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达；JC1流式检测创面组织中的线粒体膜电位；蛋白免疫印迹（Western blot，WB）检测创面组织中TGF-β1、SMAD家族成员3（SMAD family member 3，Smad3）、磷酸化SMAD家族成员3（phosphorylated SMAD family member 3，p-Smad3）的表达。 结果 与对照组相比，模型组大鼠创面组织见表皮结构缺失，真皮层内细胞见大量坏死，并伴随大量炎性细胞浸润，皮肤组织有出血且红细胞溢出等病理变化，这提示模型建立成功。与模型组比较，富氢水组大鼠血清中TNF-α（42.18±1.09，P<0.001）、IL-1β（4.82±0.24，P<0.001）含量降低，IL-10（7.33±0.46，P<0.001）含量升高，创面组织中SOD活性（28.57±1.58，P<0.001）、线粒体膜电位（3.05±0.48，P=0.002）升高，MDA活性（1.59±0.05，P<0.001）、细胞凋亡率（1.30±0.47，P=0.005）、超氧化物阴离子含量（0.42±0.01，P<0.001）降低，TGF-β1（0.62±0.16，P=0.002）及p-Smad3（0.66±0.23，P=0.018）蛋白的表达升高。 结论 富氢水可能通过激活TGF-β1/Smad3信号通路抑制烧伤皮肤组织的炎症反应及细胞凋亡，并缓解氧化应激及线粒体功能障碍从而促进深Ⅱ度烧伤大鼠的创面组织修复。

Abstract

Objective To explore the effects of hydrogen-rich water in promoting wound healing in rats with deep second-degree burns and the underlying molecular mechanism. Methods Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，sham burn group，model group，hydrogen-rich water group，and transforming growth factor-beta 1（TGF-β1） inhibitor group，with six rats in each group. A rat model of deep second-degree burns was established using a circular high-temperature burn device. The rats in the TGF-β1 inhibitor group were intraperitoneally given SB-431542 at a dose of 15 mg/kg before modeling. After modelling，the TGF-β1 inhibitor group and hydrogen-rich water group were given 200 mL of hydrogen-rich water twice a day，while the other groups were given normal drinking water for two consecutive weeks. For all the groups，we observed the healing of skin burns； examined the pathological changes of the wounds with hematoxylin and eosin staining； measured serum levels of tumor necrosis factor alpha（TNF-α），interleukin-1 beta（IL-1β），and interleukin-10（IL-10） by enzyme-linked immunosorbent assay；determined the content of superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），and superoxide anion in wound tissue using biochemical kits；examined cell apoptosis in wound tissue with TUNEL staining； measured the expression of proliferating cell nuclear antigen in wound tissue with immunohistochemical staining； measured the mitochondrial membrane potential in wound tissue by flow cytometry with JC-1 staining； and measured the expression of TGF-β1，SMAD family member 3（Smad3），and phosphorylated Smad3 （p-Smad3） in wound tissue by Western blot. Results Compared with the control group，the model group showed the loss of the epidermal structure of the wound tissue，extensive cell necrosis in the dermis accompanied by massive inflammatory cell infiltration，and bleeding and erythrocyte extravasation in the skin tissue，which indicated that the model was successfully established. Compared with the model group，the hydrogen-rich water group showed significant decreases in serum levels of TNF-α（42.18±1.09，P<0.001） and IL-1β（4.82±0.24，P<0.001），a significant increase in the serum IL-10 level （7.33±0.46，P<0.001），significant increases in SOD activity（28.57±1.58，P<0.001） and the mitochondrial membrane potential（3.05±0.48，P=0.002） in wound tissue，significant reductions in MDA activity（1.59±0.05，P<0.001），superoxide anion content（0.42±0.01，P<0.001），and the cell apoptosis rate（1.30±0.47，P=0.005） in wound tissue，and significant increases in the protein expression of TGF-β1（0.62±0.16，P=0.002） and p-Smad3（0.66±0.23，P=0.018） in wound tissue. Conclusion Hydrogen-rich water may activate the TGF-β1/Smad3 signaling pathway to inhibit the inflammation and cell apoptosis of burned skin and relieve oxidative stress and mitochondrial dysfunction，thereby promoting wound tissue repair in rats with deep second-degree burns.

Graphical abstract

关键词

深Ⅱ度烧伤 / 富氢水 / TGF-β1/Smad3信号通路 / 创面修复 / 伤口愈合

Key words

deep second-degree burn / hydrogen-rich water / TGF-β1/Smad3 signaling pathway / wound repair / wound healing

烧伤是由于火、电、高温水烫伤等因素引起的一类软组织损伤，是临床上较常见的外伤性疾病，可损害与烧伤区域皮肤接触的组织或器官，甚至导致全身多组织器官并发症^[1-2]。按烧伤深度可将皮肤烧伤分为Ⅰ度、浅Ⅱ度、深Ⅱ度、Ⅲ度四种类型，其中最常见的类型是深Ⅱ度烧伤，其损伤可达真皮层，如果不立即处理就可能会延长修复周期并留下瘢痕^[3]。深度烧伤创面修复是治疗烧伤的过程中的一个难题。目前临床上常采用敷料覆盖、清创术、皮肤移植等手段治疗深Ⅱ度烧伤，但这些方法都有一定的局限性，治疗效果不佳，因此探究能有效治疗烧伤且无副作用的药物具有重大的研究意义^[4]。

近年来，氢分子被证明是一种安全有效的生理调节药物，在许多炎症相关疾病中具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用^[5]。预防性滴注富氢水可有效抑制碱烧伤诱导的炎症，并抑制烧伤后的角膜疤痕的形成，促进组织修复^[6]。动物实验和临床实验的研究也证实了氢分子对伤口愈合的促进作用^[7]。然而截至目前氢分子对深Ⅱ度烧伤大鼠的保护作用及其机制还尚不明确。转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）是促进成纤维细胞的转化因子，可根据细胞活化或分化程度的不同，双向调节目的细胞功能，从而促进伤口的愈合^[8]。SMAD家族成员3（SMAD family member 3，Smad3）蛋白作为TGF-β1最重要的胞内信号转导蛋白，当TGF-β1/Smad3信号通路被激活时可促进上皮新生组织生成从而修复创面^[9]。因此，本研究基于TGF-β1/Smad3信号通路出发，探究富氢水促进深Ⅱ度烧伤大鼠的创面愈合的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物

30只7周龄雄性SD大鼠，体质量（200±10） g，由四川维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号为：SYXK（川）2023-0263；动物使用许可证号为：SCXK（川）2023-0040。随机分笼饲养于屏障环境，每笼4只，让大鼠自由饮食和饮水，将室内温度保持在20 ℃~26 ℃，相对湿度保持在40%~70%，昼夜光照，所有实验已获得实验动物福利伦理委员会批准，并尽最大努力减少动物痛苦。

1.2 药物与试剂

参照文献[10]的方法利用高压将富氢水溶于生理盐水，制备氢含量为0.5 ppm的富氢水。富氢水（氢活力官方企业店）；SB-431542（MedChemExpress，货号：HY-10431，10 mg）；0.9%生理盐水（四川科伦药业股份有限公）；DMSO（Sigma，D4540）；75%乙醇（北京西浓科技有限公司）；乳酸钠林格溶液（北京百奥莱博科技有限公司 货号：GL2160）；Elisa检测试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司，货号：ZC-37624，ZC-36379，ZC-36391）；SOD及MDA含量检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A001-3-1，A003-1-1）；超氧阴离子含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：BC1290）；苏木素染液（武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：G1004）；伊红染液（合肥博美生物科技有限责任公司，货号：YE2080）；免疫组化SP法试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号SPN-9002）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司，货号：ZLI-9018）；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及HRP标记山羊抗兔抗体（Servicebio，货号：GB11010-1，GB23303）；β-actin肌动蛋白、Smad3、磷酸化SMAD家族成员3（phosphorylated SMAD family member 3，p-Smad3）、TGF-β1抗体（abclonal公司，货号：AC026，AP0727，A19115，A18692），JC-1检测试剂盒（碧云天，C2006）。

1.3 主要仪器

小动物控温烫伤仪（北京冀诺泰科技发展有限公司，型号：YLS-5Q）；台式高速冷冻离心机（湘仪集团，型号：H2050R）；垂直电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY-SCZ4⁺）；电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY200C）；脱色摇床（上海程捷仪器设备有限公司，型号：HY-5）；化学发光凝胶成像系统（上海金鹏分析仪器有限公司，JP-K900）；高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ-Ⅲ-F）；超低温冰箱（海尔集团，型号：DW-86L386）；酶标仪（美谷分子仪器有限公司，型号：SpectraMAX Plus384）；分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司，型号：UV752N型）；流式分析仪（Beckman，型号：cytoflex）等。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制备

随机将大鼠分为对照组、假烧伤组、模型组、富氢水组、TGF-β1抑制剂组5组，每组6只大鼠。对照组大鼠不做任何处理，其余各组大鼠以20%乌拉坦5 mL/kg麻醉后剃除背部毛发，用8%硫化钠溶液脱毛，假烧伤组大鼠脱毛后立即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液，其余3组大鼠用直径为2.5 cm的圆形烫伤仪探头烫伤脱毛区皮肤，形成紧邻筋膜的全层皮肤缺损圆形创面，然后立即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液以抗休克，通过HE染色观察创伤组织的病理变化观察到部分真皮层内细胞坏死、部分毛囊、汗腺等附件结构完整，即可判定造模成功。

1.4.2 给药及取材

造模成功后开始给药，TGF-β1抑制剂组大鼠在造模前腹腔注射用DMSO稀释过的15 mg/kg的TGF-β1抑制剂SB-431542，然后在造模成功后与富氢水组一样在20 ℃~22 ℃下用带有紧密的橡胶盖的玻璃瓶每天灌胃2次200 mL的富氢水，其余大鼠常规饮水，连续治疗2周。给药结束后大鼠禁食不禁水24 h，用5%水合氯醛麻醉，腹主动脉采集血液完成后处死大鼠，采集创面组织后置于-80 ℃冰箱进行保存和备用。

1.4.3 观察指标及检测方法

1.4.3.1 HE染色观察创面组织病理学变化

创伤后第5~14天，这是肉芽组织形成和再生的关键阶段，因此本试验创伤后第14天采集大鼠的创面组织，在取材之前，使用如氟烷麻醉确保大鼠在整个过程中尽量无痛。为了避免感染，取材时需使用无菌器械和无菌技术，保持操作环境的清洁。取材时，选择创面中央及周围正常皮肤组织，便于对比。取材范围包括创面及其边缘的1~2 mm正常组织。使用手术刀、剪刀和镊子等无菌工具，轻柔地切除所需的组织样本。取材后，立即将组织样本放入适当的固定液（如10%福尔马林）中，或用于冷冻保存（如液氮中）。4%中性甲醛溶液固定，不同浓度的乙醇溶液脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，脱蜡至水，苏木精与伊红染色，脱水，中性树胶封片，用显微镜在200倍和400倍下观察创面组织的病理形态学变化，拍照并保存。

1.4.3.2 Elisa法检测创面组织中IL-6、TNF-α及IL-10的水平

大鼠脱颈处死后采集腹主动脉血液2 mL，抗凝摇匀后于2 000 r/min的条件下离心15 min，分离出血清后用试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-10的含量。

1.4.3.3 生化试剂盒检测创面组织中SOD、MDA及超氧化物阴离子的活性

大鼠脱颈处死后采集创面组织，按照SOD、MDA及超氧化物阴离子检测试剂盒说明书操作，用分光光度法检测在530 nm处的吸光度值。

1.4.3.4 TUNEL染色检测创面组织中的细胞凋亡

大鼠脱颈处死后采集创面组织，4%多聚甲醛固定24 h。石蜡包埋后切片，脱蜡至水，柠檬酸微波修复，荧光TUENL试剂孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI染细胞核，PBS冲洗，甘油明胶封片，采用3DHISTECH（Hungary）生产的Pannoramic 250数字切片扫描仪进行扫描，然后进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再根据组织大小采集3个区域9张400倍图像，进行凋亡细胞分析。

1.4.3.5 免疫组化染色检测创面组织中PCNA的表达情况

大鼠脱颈处死后采集创面组织，固定脱水后用石蜡包埋切片，脱蜡至水，浸入柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，滴加一抗PCNA抗体，PBS洗后DAB显色，苏木素复染后脱水封片。用显微摄像系统采集图像，每张切片先于低倍下观察全部组织，再分别采集200倍及400倍显微图像，苏木素染细胞核为蓝色，PCNA显出的阳性表达棕黄色。

1.4.3.6 Western blot法检测创面组织中TGF-β、Smad3、p-Smad3的表达

大鼠脱颈处死后采集创面组织，提取蛋白后用BCA法检测蛋白浓度，将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜后，在5%封闭液中（TBST配制）封闭2 h，加入TGF-β、Smad3、p-Smad3和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜。加入用5%BSA配制的相应二抗，室温摇床孵育1.5 h。TBST洗膜3次后进行化学发光法显色，结果采用Image J软件对图像进行定量分析。

1.4.3.7 JC1流式检测创面组织中线粒体膜电位的水平

大鼠脱颈处死后采集创面组织，然后按照线粒体提取试剂盒说明书提取线粒体后纯化，将纯化的线粒体与JC-1缓冲液混合后使用荧光酶标仪进行检测，激发波长为485 nm，发射波长为590 nm。红色荧光和绿色荧光分别代表正常线粒体和去极化线粒体。以红色荧光/绿色荧光的比值表示线粒体膜电位。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计分析软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示。组间比较采用单因素方差分析，方差齐用最小差数（LSD）法进行多重检验，方差不齐用Tamhane's进行多重检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 富氢水对深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合程度的影响

对照组与假烧伤组无伤口。由图1可知，给药第1~5天，模型组大鼠烧伤创面干燥、厚实，呈黑褐色；富氢水组大鼠的创面均比较湿润、柔软，呈棕褐色，且出现结痂。给药第14天，富氢水组大鼠创面面积明显缩小，已有极大幅度的愈合；TGF-β1抑制剂组大鼠创面处出现结痂，但其创面面积大于富氢水组。

与模型组比较，给药第14、21、28天富氢水组大鼠创面的愈合率（t=7.932，P<0.001；t=3.641，P=0.000；t=4.184，P<0.001）显著升高；与富氢水组比较，给药第14天TGF-β1抑制剂组大鼠创面的愈合率降低（t=3.419，P=0.001），提示富氢水组大鼠创面具有最佳的愈合情况（表1）。

2.2 富氢水对深Ⅱ度烧伤大鼠创面组织病理变化的影响

HE染色观察创面组织的病理形态学变化，结果发现对照组未见明显病变；假烧伤组大鼠的未见明显病理变化；模型组大鼠的创面皮肤组织表皮层缺失较为严重，真皮层处胶原纤维发生不同程度的坏死，见血管及大量纤维组织增生，并伴有炎性细胞浸润，皮肤组织出血，红细胞溢出，毛囊和皮脂腺等附属器结构完整。富氢水组大鼠的创面组织表皮层增厚，炎性细胞浸润及皮肤出血程度明显减轻。TGF-β1抑制剂组大鼠的创面组织的病变程度有所加重（图2）。

2.3 富氢水对深Ⅱ度烧伤大鼠细胞增殖及凋亡的影响

通过对反映细胞增殖能力的PCNA蛋白含量进行检测，对照组、假烧伤组、模型组、富氢水组、TGF-β1抑制剂组PCNA蛋白含量分别为（2.35±1.09）%、（3.22±0.63）%、（7.57±1.00）%、（19.56±1.60）%、（15.98±1.79）%，差异有统计学意义（P<0.01，F=104.193）。与对照组相比，假烧伤组大鼠创面组织中PCNA的表达无明显变化。模型组大鼠创面组织PCNA的表达高于对照组（t=6.142，P=0.01）。富氢水组大鼠创面组织PCNA的表达高于模型组（t=10.770，P=0.001）。TGF-β1抑制剂组大鼠创面组织PCNA的表达低于富氢水组（t=2.362，P=0.011）（图3）。

用TUNEL染色对创面组织的细胞凋亡率进行检测（图4），对照组、假烧伤组、模型组、富氢水组、TGF-β1抑制剂组细胞凋亡率分别为（0.38±0.17）%、（0.29±0.26）%、（7.50±4.63）%、（1.30±0.47）%、（2.80±0.98）%，差异有统计学意义（P<0.01，F=5.917）。结果如图5所示，假烧伤组大鼠创面组织的细胞凋亡率与对照组无明显差异。模型组大鼠创面组织的细胞凋亡率高于对照组（t=2.661，P=0.002）。富氢水组大鼠创面组织的细胞凋亡率低于模型组（t=2.305，P=0.005）。TGF-β1抑制剂组大鼠创面组织的细胞凋亡率高于富氢水组，但差异无统计学意义。

2.4 富氢水对深Ⅱ度烧伤大鼠氧化应激及炎症的影响

由表2可知，假烧伤组大鼠创面组织中SOD活性及MDA活性及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、超氧化物阴离子水平与对照组比较均无明显差异。模型组大鼠SOD活性及IL-10的水平低于对照组（t=5.718，P<0.001；t=17.100，P<0.001），MDA活性及TNF-α、IL-1β、超氧化物阴离子水平高于对照组（t=9.630，P<0.001；t=110.900，P<0.001；t=29.080，P<0.001；t=8.402，P<0.001）。富氢水组大鼠SOD活性及IL-10水平高于模型组（t=5.635，P<0.001；t=10.650，P<0.001），MDA活性及TNF-α、IL-1β、超氧化物阴离子的水平低于模型组（t=8.965，P<0.001；t=28.960，P<0.001；t=17.550，P<0.001；t=10.700，P<0.001）。TGF-β1抑制剂组大鼠SOD活性及IL-10水平低于对照组（t=5.540，P=0.004；t=4.495，P<0.001），MDA活性及TNF-α、IL-1β、超氧化物阴离子水平高于富氢水组（t=4.721，P<0.001；t=10.170，P<0.001；t=8.245，P<0.001；t=5.779，P=0.001）。

2.5 富氢水对深Ⅱ度烧伤大鼠线粒体功能的影响

对照组、假烧伤组、模型组、富氢水组、TGF-β1抑制剂组大鼠创面组织线粒体膜电位分别为5.79±1.33、4.47±0.51、0.72±0.30、3.05±0.48、1.76±0.37，差异有统计学意义（P<0.01，F=25.037）。模型组大鼠线粒体膜电位低于对照组（t=6.455，P<0.001）。富氢水组线粒体膜电位高于模型组（t=7.146，P=0.002）。TGF-β1抑制剂组线粒体膜电位低于富氢水组（t=3.708，P=0.048）（图5）。

2.6 富氢水对深Ⅱ度烧伤大鼠TGF-β1/Smad3信号通路活化的影响

由图6，表3可知，与对照组比较，假烧伤组大鼠创面组织中TGF-β1、Smad3及p-Smad3蛋白的表达差异无统计学意义；模型组大鼠创面组织中TGF-β1、p-Smad3蛋白的表达明显降低（t=14.210，P<0.001；t=5.873，P=0.001），Smad3的表达无明显变化。与模型组比较，富氢水组大鼠创面组织中TGF-β1、p-Smad3蛋白的表达明显升高（t=4.957，P=0.002； t=3.393，P=0.018）。与富氢水组比较，TGF-β1抑制剂组创面组织中TGF-β1、p-Smad3蛋白的表达均有所降低，TGF-β1的表达在2组间差异有统计学意义（t=1.823，P=0.031）。

3 讨论

烧伤是皮肤损伤的常见原因，严重时会导致皮肤功能的丧失，进而引起代谢紊乱和炎症损伤，甚至会引发全身炎症反应综合征^[11]。探究能够有效促进创面愈合的药物及其作用机制是治疗烧伤面临的一个关键问题。深Ⅱ度烧伤是一种难治愈的创面组织修复类型，其病理机制复杂，致残率及死亡率较高，对烧伤患者的生活质量及生命健康带来了严重的影响^[12]。烧伤组织创面的修复涉及炎症反应、组织水肿及创面细胞的增殖和凋亡等多个生物学过程^[13]，从调节炎症、细胞增殖及凋亡等角度出发分析烧伤的病理机制，可为探索治疗烧伤的有效药物提供科学依据。

氢作为一种新型抗氧化剂，可以选择性清除过氧亚硝酸盐自由基和羟基自由基，具有高效低成本、低毒等优点。氢气分子具有水溶性和脂溶性，可通过自由扩散的方式穿透细胞膜到达线粒体等靶向细胞器。最新的生物学基础和临床研究表明氢气是细胞和器官重要的生理性调节因子。氢分子在氧化还原反应中直接与自由基反应，特别是与羟基自由基反应，从而发挥各种治疗效果^[14]。研究发现氢气可通过调控炎症因子的水平抑制肝脏的炎症反应，并缓解脑缺血再灌注导致的氧化应激损伤^[15]。富氢生理盐水广泛应用于各种疾病的动物模型中，孙强^[16]研究发现腹腔注射氢盐水能有效改善大鼠缺血缺氧性脑损伤，Ikeda M等^[17]研究发现氢气水能够保护肠道组织，避免炎症反应及渗漏。另外，研究已证实氢气水可通过抑制新生血管的生成有效改善大鼠角膜的碱烧伤，并促进伤口的愈合^[10，15]。本研究采用温度106 ℃、压力0.03 MPa持续5 s的方法制备深Ⅱ度烧伤大鼠模型，经富氢水灌胃14 d后大鼠皮肤烧伤组织的创面面积减少，结痂率增加，组织中的炎性细胞浸润减少，且皮肤出血程度有所减轻，提示富氢水能够有效促进创面组织修复。

炎症因子是导致阻碍创面组织修复并使其坏死加重的重要原因。因此，抑制促炎因子释放是促进创面愈合的有效途径。烧伤会导致ROS水平异常升高及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的大量合成与释放，诱导机体发生炎症反应，并使氧化应激相关因子MDA、SOD含量异常从而造成创面的氧化应激损伤^[18]。TNF-α、IL-1β作为趋化因子可进一步促进自身及IL-6表达上调，从而形成炎症级联反应而加重炎症损伤，IL-6能够刺激ROS合成与释放，从而加重氧化应激损伤^[19]。本研究结果发现富氢水能有效降低大鼠血清中促炎因子TNF-α及IL-1β的水平，同时提升抑炎因子IL-10的水平，另外，富氢水组大鼠创面组织中抗氧化应激因子SOD的活性明显升高，这表明富氢水可通过减轻炎症反应，缓解动物的氧化应激，从而促进大鼠烧伤皮肤组织愈合。

伤口愈合是一个复杂而动态的过程，由止血、炎症、增殖和重塑4个连续和重叠的阶段组成。烧伤会破坏线粒体稳态，导致形态改变、ATP合成受损和ROS生成过多^[20]。线粒体功能调控有可能成为烧伤和伤口治疗的治疗靶点。线粒体是真核生物的主要能量来源，在维持皮肤稳态方面起着关键作用。线粒体功能的破坏会减少能量供应，同时释放线粒体内容物，如细胞色素c、乙酰辅酶A、ATP等从而引发炎症反应和细胞死亡^[21]。线粒体是维持皮肤健康的重要参与者，皮肤表皮的持续再生取决于线粒体产生的ATP^[22]。此外，线粒体呼吸和ROS生成在角质形成细胞的分化中也起着至关重要的作用，线粒体ROS激活Notch和β-连环蛋白信号通路以增强表皮分化^[23]。超氧化物阴离子主要包含活性氧类,活性氧能够与细胞内脂质、蛋白质相互作用,导致细胞膜流动性的降低和膜结构的破坏^[24]。线粒体作为细胞中存在数量最多的细胞器,其数量改变可直接反映线粒体损伤情况^[25]，当线粒体功能受损时,细胞超氧化物阴离子水平增加、线粒体数量减少、ATP和线粒体膜电位降低及动力学失衡^[26]。细胞凋亡是指可通过死亡受体途径或线粒体途径发生的程序性细胞死亡，在调节烧伤的进展中起着至关重要的作用^[27]。在角质形成细胞中，烧伤会破坏线粒体膜完整性，导致诱导细胞凋亡^[28]。本研究结果发现富氢水能明显降低深Ⅱ度烧伤大鼠创面组织中的超氧化物阴离子水平，并提高线粒体膜电位，同时降低创面组织的细胞凋亡率，促进创面组织中促增殖标志蛋白PCNA的表达，这表明富氢水可通过抑制创面组织的线粒体功能障碍和细胞凋亡从而促进创面愈合。TGF-β1/Smad3信号通路是创面愈合的重要调控途径。研究表明TGF-β1能够有效促进伤口愈合；Smad3蛋白可参与维持细胞内环境稳定，促进创面组织纤维化过程从而加速平滑肌生长^[29]，使创面组织短时间内进入细胞增生与迁移期，多环节治疗烧伤创面^[30]。为了探究富氢水促进创面修复的分子机制，本研究通过用TGF-β1抑制剂干预深Ⅱ度烧伤大鼠模型，结果发现富氢水可激活TGF-β1/Smad3信号通路，而TGF-β1抑制剂可完全减轻富氢水抑制炎症、氧化应激、细胞凋亡及线粒体功能障碍的作用。

综上所述，富氢水可有效修复深Ⅱ度烧伤大鼠的烧伤皮肤，其机制与激活TGF-β1/Smad3信号通路从而抑制创面组织的炎症反应及细胞凋亡，并缓解氧化应激及线粒体功能障碍有关。

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基金资助

青海省科技厅资助项目(2023-ZJ-795)