miR-181a-5p调控 ATM/CHK2对人皮肤成纤维细胞衰老的影响及机制研究

Effect of ATM/CHK2 regulation by miR-181a-5p on the senescence of human skin fibroblasts and its mechanism

摘要

目的 探讨微小RNA-181a-5p（microRNA-181a-5p）通过调控共济失调毛细血管扩张突变激酶（ataxia-telangiectasia mutated kinase，ATM）/DNA损伤检查点激酶2（checkpoint kinase 2，CHK2）对人皮肤成纤维（human skin fibroblasts，HSF）衰老的影响及机制。 方法 生物信息学数据库预测miR-181a-5p的靶向基因，确定ATM作为研究对象；构建人皮肤成纤维细胞衰老模型，分别转染miR-181a-5p mimics、mimics negative control、miR-181a-5p inhibitor、inhibitor negative control后将细胞分为4组：实验（miR-181a-5p mimics）组、对照（mimics-NC）组、抑制剂（miR-181a-5p inhibitor）组、抑制剂对照（inhibitor-NC）组；聚合酶链式反应检测各组细胞miR-181a-5p、ATM、CHK2 mRNA的表达。蛋白质印迹法检测各组细胞GSDMD、Caspase-1、NLRP3、DDB1、p53蛋白的表达；酶联免疫吸附测定法检测各组细胞IL-18和IL-1β浓度。 结果 聚合酶链式反应检测结果显示，与对照组相比，转染miR-181a-5p mimics可以显著降低细胞内DNA损伤相关基因ATM和CHK2的mRNA水平（P<0.01）；蛋白质印迹法结果显示，与对照组相比，实验组细胞衰老通路相关基因DDB1、p53，细胞焦亡相关基因NLRP3、GSDMD、Caspase 1蛋白水平明显上升（P<0.05）。酶联免疫吸附测定法检测结果显示，与对照组相比，实验组焦亡相关指标IL-1β、IL-18水平显著上升（P<0.01）。 结论 抑制miR-181a-5p可促进 ATM/CHK2信号通路，进而抑制细胞衰老与焦亡。

Abstract

Objective To investigate the effect of ataxia-telangiectasia mutated kinase（ATM）/checkpoint kinase 2 （CHK2） regulation by miR-181a-5p on the senescence of human skin fibroblasts and its mechanism. Methods The target genes of miR-181a-5p were predicted using bioinformatic databases，and ATM was selected for further study. A human skin fibroblast senescence model was constructed. The cells were transfected with miR-181a-5p mimics，mimics negative control，miR-181a-5p inhibitor，or inhibitor negative control，yielding the experimental group（miR-181a-5p mimics），control group（mimics-NC），inhibitor group（miR-181a-5p inhibitor），and inhibitor control group（inhibitor-NC）. Quantitative polymerase chain reaction was performed to assess mRNA expression levels of miR-181a-5p，ATM，and CHK2. Western blotting was performed to measure the protein levels of GSDMD，Caspase-1，NLRP3，DDB1，and p53. Enzyme-linked immunosorbent assay was employed to determine IL-18 and IL-1β concentrations in each group of cells. Results Quantitative polymerase chain reaction showed that transfection with miR-181a-5p mimics significantly decreased the mRNA levels of intracellular DNA damage-related genes encoding ATM and CHK2 compared with the control group（P<0.01）. Western blotting showed that compared with the control group，proteins associated with cellular senescence（DDB1，p53） and pyroptosis（NLRP3，GSDMD，Caspase-1） were significantly increased in the experimental group（P<0.05）. Enzyme-linked immunosorbent assay showed that compared with the control group，the levels of pyroptosis-associated cytokines IL-1β and IL-18 were significantly increased in the experimental group（P<0.01）. Conclusion Inhibition of miR-181a-5p can promote the ATM/CHK2 signaling pathway，thereby suppressing cellular senescence and pyroptosis.

Graphical abstract

关键词

成纤维细胞 / miR-181a-5p / DNA 损伤反应 / 细胞衰老 / 细胞焦亡

Key words

fibroblast / miR-181a-5p / DNA damage response / cellular senescence / pyroptosis

衰老是一个内在的、多层面的过程，是与复杂细胞过程相关的生物退化，包括干细胞衰竭、线粒体功能障碍、细胞衰老、端粒缩短和代谢失调等^[1]。细胞衰老是一种细胞对生长因子的刺激没有反应而处于终末生长停滞的状态。当细胞遇到异常短的端粒、DNA损伤、致癌基因激活、缺氧和氧化应激时，就会触发衰老程序^[2]。近年来人们对衰老的机制提出了许多学说，如端粒学说、自由基学说、线粒体学说、神经内分泌免疫网络学说及细胞凋亡学说、衰老基因学说、DNA损伤学说等理论^[3]。

DNA损伤反应（DNA damage reaction，DDR）是细胞受到DNA损伤而启动的分子通路，对基因组稳定性和生物存活至关重要^[4]。DNA损伤会导致各种突变并破坏翻译和转录。内源性和外源性因素均可诱导DNA损伤，例如核苷酸改变（替换、缺失和插入）、单链断裂和DNA双链断裂（double-strand breaks，DSB）。共济失调毛细血管扩张突变激酶（ataxia-telangiectasia mutated kinase，ATM）是一种与衰老相关的 DNA 损伤传感器蛋白激酶，也是 DDR信号的核心组成部分。ATM 在Ser1981处的自磷酸化增强了其激酶活性，导致受损部位周围核小体中的γH2AX磷酸化，并募集了更多的 ATM 和其他修复因子^[5-6]。其他的DDR蛋白，包括KRAB 相关蛋白1（KAP1），p53和DNA损伤检查点激酶2（checkpoint kinase 2，CHK2），会被ATM激酶磷酸化，从而促进 DNA修复，细胞周期停滞、凋亡、衰老。CHK2激酶广泛存在于哺乳动物中，可在 DSB后参与DNA修复应答并作为重要的信号转导蛋白使细胞周期进程发生阻滞从而促进DNA修复或诱导细胞凋亡^[7]。

ATM/CHK2通路是细胞响应DSB的核心信号级联，在皮肤衰老进程中起关键调控作用。作为皮肤衰老主要环境诱因的紫外线辐射可诱导DSB生成，进而激活ATM激酶^[8]。ATM/CHK2的磷酸化可诱导G1/S细胞周期阻滞，还可促进自噬以维持氧化应激下的ROS稳态，从而影响细胞衰老^[9]。该通路同时募集修复因子至损伤位点，启动相关修复途径。研究表明，衰老皮肤中ATM/CHK2通路活性降低与DSB修复效率下降显著相关。当DNA损伤累积时，CHK2磷酸化稳定p53蛋白，上调p21表达，引发不可逆的细胞周期阻滞，最终诱导细胞衰老。衰老细胞通过分泌衰老相关分泌表型（包含促炎因子及基质金属蛋白酶等）破坏组织微环境，直接导致皮肤变薄、皱纹形成及弹性纤维降解等表型^[10]。在应对内源性压力方面，ROS积累可非DSB依赖性地激活ATM/CHK2通路，而端粒功能障碍亦可被识别为DSB激活该通路，共同促进复制性衰老^[11-12]。自然衰老及光老化皮肤中普遍存在ATM/CHK2通路功能衰减，导致：①DSB修复能力减弱；②细胞周期检查点失活；③衰老细胞清除障碍。这些改变造成基因组不稳定性增加及衰老细胞负荷升高，形成加速皮肤老化的正反馈循环^[10]。因此，靶向增强ATM/CHK2介导的DNA损伤应答（如修复功能激活）成为潜在抗衰老策略。

MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约为22个核苷酸的 ncRNA分子。miRNA 参与影响多种基因的表达，可以调控胚胎发育、细胞增殖、分化和凋亡、细胞骨架的再生等多种生理过程^[13]。与其他miRNA类似，miRNA-181a（miR-181a-5p）在许多细胞过程中起着关键作用：如决定细胞寿命和细胞侵袭^[14]。目前已发现 miR-181a-5p 能够抑制平滑肌细胞的衰老、与海马记忆形成有关并参与阿尔茨海默病的发展、改善衰老骨骼肌细胞中的线粒体质量、促进宫颈癌细胞的凋亡和衰老等^[15-18]。Gerasymchuk M等^[19]发现miR-181a-5p在复制性衰老的角质形成细胞和内皮细胞中表达上调。Mancini M等^[20]证实miR-181a-5p参与了人皮肤成纤维（human skin fibroblasts，HSF）细胞衰老，且miR-181a-5p过表达可以诱导HSF细胞的衰老。但 miR-181a-5p在衰老细胞中的调控作用尚不清楚。Zhang XY等^[21]证明ATM是miR-181a-5p的直接靶点，模拟转染的miR-181a-5p会下调ATM在 mRNA和蛋白质水平上的表达。此外，与阴性对照组和空白组相比，转染miR-181a-5p抑制剂能够抑制增殖、侵袭和迁移，同时促进胃癌腺细胞（SGC7901细胞）凋亡。这些数据共同表明 miR-181a-5p的过度表达促进了胃癌细胞的增殖，同时通过直接靶向ATM基因抑制胃癌细胞的凋亡。本实验拟用D-半乳糖（D-galactose，D-gal）诱导的正常HSF细胞为衰老模型，探讨miR-181a-5p是否能够通过调控 ATM/CHK2影响HSF细胞的衰老。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞

HSF细胞购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。

1.1.2 主要试剂与仪器

D-半乳糖（D-galactose，D-gal）购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基由美国康宁CellGro 公司提供；FBS Premium优等胎牛血清采购于德国PAN公司；转染所用miRNA mimics序列由上海吉玛制药公司设计并合成。RNAiso Plus试剂盒、反转录试剂及荧光实时定量 PCR反应体系相关试剂均购自日本TaKaRa公司；PCR引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成；GSDMD、Caspase-1、NLRP3、DDB1、P53等抗体以及IL-18、IL-1β的ELISA检测试剂盒均购自Proteintech公司；β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）细胞化学染色试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测试盒（增强型）、RIPA裂解液、PMSF均为江苏碧云天生物公司产品；Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；PCR扩增仪和荧光定量PCR仪均为美国BioRad公司仪器。

1.2 方法

1.2.1 预测靶向基因

TargetScan数据库（targetscan.org/vert_80/）、miRDB数据库（mirdb.org/）、mirDIP数据库（ophid.utoronto.ca/mirDIP/）进行生物信息学分析后预测miR-181a-5p的靶向基因，并取交集。查阅文献确定细胞衰老相关基因ATM作为研究对象。

1.2.2 在线验证结合位点

TargetScan（targetscan.org/vert_80/）在线进行生物信息学分析验证miR-181a-5p与ATM的靶向结合位点。

1.2.3 细胞培养与衰老模型建立及验证

HSF细胞培养在37 ℃、5%CO₂的恒温培养箱中，使用含10%胎牛血清的高糖 DMEM培养基进行孵育，每2~3 d更换一次培养液。待细胞融合度达到70%~80%时进行传代操作。当传代细胞融合度达到50%时，采用10 g/L的D-gal对HSF细胞处理72 h，以构建细胞衰老模型。

1.2.3.1 细胞分组

将细胞分为对照组、衰老模型组。对照组为使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养的HSF细胞，衰老模型组为采用10g/L的D-gal对HSF细胞处理72 h后的细胞。

1.2.3.2 CCK-8法检测细胞存活率

取对数生长期的细胞200 μL，按1 000个/孔的密度接种至96孔培养板。使用10 g/L的D-半乳糖溶液诱导细胞72 h，以构建细胞衰老模型。对照组各孔加入200 μL培养基，每组设5个复孔。诱导结束后更换培养基，每孔加入200 μL培养基与20 μL CCK-8试剂的混合液，于37 ℃孵育1 h。随后利用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度（absorbance，A值），通过计算细胞存活率验证衰老模型的构建效果。实验独立重复3次。

1.2.3.3 衰老特异性β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色

选取细胞融合度达80%的对数生长期细胞，采用移液器以2×10⁴个/孔的精确密度接种至6孔细胞培养板中，每组设置1个独立孔位。参照前期建立的细胞分组方案完成处理后，开展 SA-β-Gal细胞化学染色实验。具体操作严格遵循试剂盒说明书流程：将样本置于37 ℃无CO₂的恒温培养箱中孵育12 h（过夜）。次日使用普通光学显微镜观察细胞染色状态，每孔随机选取5个具有代表性的视野，通过计数软件对蓝染细胞进行自动计数，计算阳性细胞占比并求取各组平均值。该实验独立重复3次。

1.2.4 miR-181a-5p和ATM/CHK2在人皮肤成纤维细胞衰老模型中表达情况及其对细胞衰老与焦亡的影响

1.2.4.1 细胞分组与转染

实验将细胞分为模拟物组（miR-181a-5p mimic）、抑制剂组（miR-181a-5p inhibitor）、模拟物对照组（miR-181a-5p mimic-NC）及抑制剂对照组（miR-181a-5p inhibitor-NC）共4组。当模拟物组在细胞融合度达 50%时，先以10 g/L D-gal诱导72 h，随后转染miR-181a-5p 模拟物（miR-181a-5p mimic）；抑制剂组在细胞融合度达到 50%时，经10 g/L D-gal诱导72 h后，转染miR-181a-5p抑制剂（miR-181a-5p inhibitor）；模拟物对照组在细胞融合度达50%时，先用10 g/L D-gal诱导72 h，再转染模拟物对照序列（miR-181a-5p mimic-NC）；抑制剂对照组则在细胞融合度达到50%后，经10 g/L D-gal诱导72 h，继而转染抑制剂对照序列（miR-181a-5p inhibitor-NC）。

1.2.4.2 聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测miR-181a-5p、ATM、CHK2、mRNA的表达

将各实验组细胞接种至6孔细胞培养板中，接种操作及处理流程参照1.2.3.3节所述。采用Trizol试剂进行总RNA的提取，依照TaKaRa反转录试剂盒说明书的标准流程合成cDNA，并开展后续的扩增反应。实验以GAPDH作为内参基因，对miR-181a-5p、ATM、CHK2 mRNA的表达水平及端粒长度进行检测分析。具体反应体系设定为10 μL，其组成如下：TB Green荧光染料5 μL、DEPC处理水3.2 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA模板1 μL。每个样本均设置3个技术重复孔。PCR扩增程序如下：首先在95 ℃条件下进行30 s的预变性处理；随后进入40个循环的扩增阶段，每个循环包括95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s的操作步骤。采用2^-ΔΔCt相对定量法对 miR-181a-5p、ATM 和 CHK2基因的mRNA相对表达量进行计算分析。实验所用的特异性引物序列详见表1。

1.2.4.3 蛋白质印迹（Western blot，WB）检测DDB1、p53、NLRP3、GSDMD、Caspase 1蛋白的表达

各实验组细胞经冰浴处理后，采用含PMSF（1 mmol/L）和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液进行总蛋白提取。具体操作如下：每孔加入100 μL裂解液，冰上裂解30 min并辅以超声破碎，离心后收集上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定裂解液蛋白浓度，将样本与BCA工作液按1∶10比例混合，37 ℃孵育30 min后，在酶标仪562 nm波长处读取A值，随后进行凝胶电泳、将蛋白转移至PVDF膜。经封闭液室温封闭1.5 h后，将膜置于含一抗的封闭液中，于4 ℃恒温摇床（转速80 r/min）孵育过夜。一抗包含：GAPDH（1∶3 000）、p53（1∶1 000）、Caspase-1（1∶500）、NLRP3（1∶500）、DDB1（1∶500）及GSDMD（1∶500）。次日用TBST缓冲液洗涤3次后，加入二抗（1∶8 000），室温摇床孵育1 h。经TBST洗涤5次后，使用ECL化学发光试剂盒显影，通过成像系统获取条带图像，采用Image J软件对灰度值进行定量分析，以GAPDH为内参计算目标蛋白的相对表达量。

1.2.4.4 酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测IL-18和IL-1β浓度

收集各组培养上清液，300×g离心10 min，取上清作为待检测样本。按照IL-18、IL-1β ELISA检测试剂盒说明进行操作，最后测量A450值，评估上清中IL-18、IL-1β的浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，使用GraphPad Prism 9.5.0软件绘制统计学图表。每项检测独立重复3次，结果取均值进行分析。计量资料以均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示，对符合正态分布且方差齐性（Levene检验P>0.05）的多组间数据，采用单因素方差分析进行整体比较；组间两两比较采用LSD法（Least Significant Difference test）。统计分析采用双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ATM是miR-181a-5p的靶向基因

结果显示，在3个数据库的交集基因中查阅文献确定细胞衰老相关基因ATM作为研究对象（图1）。

2.2 miR-181a-5p与ATM之间存在靶向结合位点

TargetScan网站进行在线生物信息学分析，显示ATM与miR-181a-5p之间存在靶向结合位点（图2）。

2.3 CCK-8法测定细胞活力

结果显示，各组间细胞活力（F=42.42、P<0.001）的比较差异均具有统计学意义。与对照组相比，实验组在不同时间（24、48、72 h）细胞活力（0.79±0.02、0.63±0.02、0.42±0.04）均显著降低（LSD-t=19.020、P<0.001，LSD-t=33.450、P<0.001，LSD-t=26.120、P<0.001）（图3）。

2.4 SA-β-Gal染色验证人皮肤成纤维衰老细胞模型的建立

染色结果显示，与对照组（0.29±0.02）相比，诱导72 h 模型组（0.77±0.03）SA-β-Gal染色阳性比例明显升高（LSD-t=23.880，P<0.001），由此可验证人皮肤成纤维衰老模型建立成功。后续使用10 g/L D-gal诱导HSF 72 h以建立人皮肤成纤维衰老细胞模型（图4、图5）。

2.5 转染miR-181a-5p mimics和inhibitor的效率检测

用miR-181a-5p mimics和inhibitor分别转染衰老HSF模型，48 h后qPCR测各组细胞转染效率。结果显示，4组间miR-181a-5p 的表达量（F=49.52，P<0.001）的比较差异均具有统计学意义。进一步两两比较结果显示：与模拟物对照组相比，转染miR-181a-5p mimics可以显著提高细胞内miR-181a-5p的表达量（LSD-t=12.210，P<0.001）；与模拟物组、抑制剂对照组相比，转染miR-181a-5p inhibitor可以显著降低细胞内miR-181a-5p的表达量（LSD-t=15.000、P<0.001，LSD-t=7.188、P=0.002）（表2，图6）。

2.6 miR-181a-5p抑制ATM、CHK2的表达

结果显示，4组间ATM的 mRNA相对表达量（F=148.76，P<0.001）、CHK2的mRNA相对表达量（F=321.45，P<0.001）的比较差异均具有统计学意义。进一步两两比较显示：与模拟物对照组，转染miR-181a-5p mimics可以显著降低细胞内DNA损伤相关基因ATM和CHK2的mRNA水平（LSD-t=8.74、P<0.001，LSD-t=16.880、P<0.001）（表3，图7）；与模拟物组、抑制剂对照组相比，转染miR-181a-5p inhibitor可以显著提高ATM和CHK2的mRNA水平（LSD-t=15.500、P<0.001，LSD-t=11.960、P<0.001，LSD-t=14.090、P<0.001，LSD-t=9.277、P<0.001（表3，图7）。

2.7 miR-181a-5p对HSF细胞衰老及细胞焦亡的影响

Western blot结果显示，4组间DDB1的蛋白相对表达量（F=10.20，P=0.003）、p53的蛋白相对表达量（F=8.90，P=0.005）、NLRP3的蛋白相对表达量（F=33.6，P<0.001）、GSDMD的蛋白相对表达量（F=12.80，P=0.001）、Caspase 1的蛋白相对表达量（F=9.50，P=0.004）的比较差异均具有统计学意义。进一步两两比较显示：与模拟物对照组相比，模拟物组细胞衰老通路相关基因DDB1、p53，细胞焦亡相关基因NLRP3、GSDMD、Caspase 1蛋白水平明显上升（LSD-t=2.977、P=0.041，LSD-t=3.558、P=0.024，LSD-t=5.764、P=0.005，LSD-t=3.650、P=0.022，LSD-t=3.194、P=0.033）；与模拟物组、抑制剂对照组相比，抑制剂组细胞衰老通路相关基因DDB1、p53，细胞焦亡相关基因NLRP3、GSDMD、Caspase 1蛋白水平明显下降（LSD-t=4.385、P=0.012，LSD-t=3.538、P=0.024，LSD-t=4.986、P=0.008，LSD-t=3.056、P=0.038，LSD-t=6.978、P=0.002，LSD-t=4.272、P=0.013，LSD-t=4.737、LSD-t=4.272、P=0.009，LSD-t=2.957、P=0.042，LSD-t=2.957、LSD-t=4.587、P=0.010，LSD-t=4.256、P=0.013）（表4，图8A~F）。ELISA法检测结果显示，与模拟物对照组相比，模拟物组焦亡相关指标IL-1β、IL-18水平显著上升（LSD-t=10.520、P=0.001，LSD-t=6.461、P=0.003）；与模拟物组、抑制剂对照组相比，抑制剂组焦亡相关指标IL-1β、IL-18水平显著下降（LSD-t=16.020、P<0.001，LSD-t=4.827、P=0.008，LSD-t=25.100、P<0.001，LSD-t=8.368、P=0.001）（表5，图8G~H）。

3 讨论

皮肤作为人体与外界自然环境直接接触的器官，是人体与外界环境的第一道屏障，它肩负着多项重要生理功能，包括排泄代谢废物、分泌皮脂等物质、形成保护屏障抵御外界侵害、感知外界的各种刺激以及调节机体体温平衡^[22]等。皮肤老化是一个复杂的现象，涉及2个同时发生的过程：内在老化和外在老化。内在老化由基因决定，又称为自然老化；外在老化受环境因素影响，包括紫外线照射、化学物质、营养和生活方式，又称为光老化^[23]。光老化的特征有活性氧过量产生、DNA损伤、端粒缩短、激素变化^[24]、基因组缺乏稳定、自噬途径受损、表观遗传学的改变、线粒体突变、增殖减少、细胞衰老、高炎症状态和干细胞耗尽^[25]。DNA损伤反应是细胞响应DNA损伤而启动的分子通路，对基因组稳定性和生物存活至关重要^[26]。DNA损伤会导致各种突变并破坏翻译和转录。内源性和外源性因素均可诱导DNA损伤，例如核苷酸改变（替换、缺失和插入）、核苷酸单链断裂和双链断裂。ATM激酶因在共济失调毛细血管扩张症中发挥的致病性作用而广为人知，这是一种罕见的常染色体隐性遗传病，主要表现为进行性神经退化、免疫功能缺陷、癌症易感性增加、对辐射敏感以及皮肤提前老化等特征^[27-29]。研究表明，ATM/CHK2的磷酸化可诱导G1/S细胞周期阻滞，还可促进自噬以维持氧化应激下的活性氧稳态，从而影响细胞衰老^[30-31]。

细胞焦亡又可以称为细胞炎性坏死，是一种细胞程序性坏死（由GSDMD介导）。这种情况体现为细胞持续增大，最终造成细胞膜破裂、细胞内物质外泄，由此引发剧烈的炎症反应^[32]。细胞焦亡是机体内一种关键的天然免疫反应，能积极地对抗感染。在细胞焦亡的发生机制中，NLRP3/caspase-1通路借助炎症小体识别危险信号，进而招募并激活caspase-1。被激活的caspase-1会对IL-18、IL-1β等炎症因子进行切割以使其活化，同时还能切割GSDMD的N端序列，促使其与细胞膜结合并形成膜孔，最终引发细胞焦亡^[33]。

诸多研究表明，miRNAs可以调控皮肤成纤维细胞的增殖和衰老。例如，miR-4535能够靶向调节Smad4，从而影响TGF-β/Smad介导的信号通路。而高良姜素可以通过此机制缓解H2O2/UVB诱导的HDF胶原蛋白降解，从而延缓皮肤细胞衰老，这也给皮肤的抗衰老提供了新思路^[34]。目前已发现 miR-181a能够抑制平滑肌细胞的衰老、与海马记忆形成有关并参与阿尔茨海默病的发展、改善衰老骨骼肌细胞中的线粒体质量、促进宫颈癌细胞的凋亡和衰老等^[35-38]。

本研究结果表明，衰老人皮肤成纤维细胞中miR-181a-5p的表达受到干预以后，DNA损伤相关的ATM/CHK2通路中关键基因的表达也随其浓度的变化而发生变化。过表达miR-181a-5p时可抑制ATM和其下游底物CHK2的表达，从而通过阻断ATM/CHK2轴来增加通路相关衰老分子DDB1、p53，细胞焦亡相关分子GSDMD、NLRP3、Caspase 1的表达，从而促进细胞衰老与焦亡。miR-181a-5p通过直接靶向结合ATM基因的3'-UTR抑制其翻译，进而降低下游CHK2激酶的磷酸化水平，导致DNA损伤修复能力显著削弱。ATM/CHK2信号通路受阻引发基因组不稳定性累积，使细胞丧失周期阻滞修复能力，进而激活NLRP3炎症小体及caspase-1。该过程同时解除CHK2对焦亡执行蛋白GSDMD的间接调控，并通过促进p53等下游因子促进促炎因子IL-1β/IL-18释放，最终协同放大细胞焦亡信号。其通过靶向抑制ATM/CHK2通路，解除对p53的负调控（如MDM2介导的降解）并加剧代偿性应激，导致p53蛋白显著积累。p53进一步通过转录激活、泛素化保护及DNA损伤信号放大，驱动DDB1表达上调并促进p53-DDB1复合体形成。

综上所述，由此推测miR-181a-5p可以促进人皮肤成纤维细胞的衰老，其模拟物或抑制剂将有可能用于调节皮肤细胞衰老信号通路、干预细胞衰老过程，为皮肤老化及相关疾病的发生和治疗提供新的视角。

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