肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作为一种高死亡率的恶性肿瘤，是导致癌症相关死亡的重要因素之一，已对国民健康构成严重威胁
[1-3]。目前，肝癌的相关危险因素大多已被明确，包括肝炎病毒感染、黄曲霉素暴露、酗酒史、吸烟史及遗传背景等
[4-6]。然而，正常细胞发生癌变并最终进展为HCC的具体致病机制仍有待深入探究
[7]。
蛋白激酶C-β（protein kinase C-β，PRKCB/PKC-β）属于磷脂依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，该家族包括经典PKC（classical PKC，cPKC）、新型PKC（novel PKC，nPKC）、非典型PKC（atypical PKC，aPKC）及PKN亚家族。作为cPKC家族的一员，PRKCB的表达受基因转录调控，其激活与代谢产物（如二酰甘油、胆固醇、磷脂）、高糖环境及氧化应激等因素密切相关
[8-9]。已知PKC家族在多种癌症进程中发挥作用，与既往普遍认为该家族以促癌基因为主的认知不同，PRKCB展现出抑制或促进肿瘤的双重功能。在多数血液系统肿瘤中，PRKCB通常具有促进肿瘤进展作用，并常伴随耐药现象的发生。例如，在慢性淋巴细胞白血病中其可通过影响相关肿瘤细胞的转化过程推动白血病进展
[10]；在慢性粒细胞白血病中其可能与酪氨酸激酶抑制剂的耐药性存在关联
[11]。前列腺癌中也有类似报道，即特异性抑制PRKCB可增强前列腺癌细胞对当前抗雄激素治疗的敏感性
[12]。而PRKCB的肿瘤抑制作用，多通过肿瘤临床样本分析得以证实，如在结直肠癌及早期膀胱癌组织中，PRKCB的表达水平下调，且与患者预后不良相关
[13-14]。尽管目前关于PRKCB在多种肿瘤中的作用已有相关研究报道，但其在肝癌发生发展中的具体功能与机制尚未见系统研究。
本研究发现，PRKCB在HCC中明显低表达，且与患者预后不良密切相关。过表达PRKCB可抑制肝癌细胞的增殖能力。初步研究表明，PRKCB发挥抑制HCC发生发展的作用，其可能机制是通过磷酸化MAPK信号通路的相关蛋白实现的。上述发现有望为HCC的研究提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
本实验使用了L02、PLC/PRF/5、Hep3B、MHCC97H、MHCCLM3、Huh7肝癌细胞株。上述细胞株均购自美国菌种保藏中心（American type culture collection，ATCC）（位于美国马里兰州罗克维尔），并储存于实验室液氮罐-196 ℃中。实验采用Dulbecco改良Eagle培养基（美国HyClone公司），结合10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Natocor公司）和1%青霉素/链霉素（美国HyClone公司）作为添加剂。将细胞在温度为37 ℃的培养箱中培养，温度为37 ℃，在加湿环境中培养。本研究得到了重庆医科大学研究伦理委员会的审查批准（批准号：2021020）；并取得患者的知情同意。
1.2 PRKCB在TCGA和GEO中差异表达的验证
在The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库（
https：//www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）下载肝癌（TCGA-LIHC）数据集，并在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（
https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库中获取HCC转录组数据，随后使用R语言分析PRKCB在泛癌及肝癌中的表达差异、在HCC样本与癌旁样本的表达差异情况。使用箱线图中蓝色（Normal，正常组织）和红色（Tumor，肿瘤组织）的箱线，对比不同类型（如ACC、BLCA等）组织中PRKCB基因的表达情况，展示PRKCB在肝癌组织和癌旁组织中的表达差异。
1.3 构建PRKCB过表达质粒
为构建PRKCB过表达质粒，将PRKCB的编码序列（CDs）插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro质粒的MCS结构域，载体自带GFP荧光仅用于转染效率预验证（转染效率>70%）。使用pCDH载体质粒、QuickCutTMEcoRI（日本Takara公司，货号：1611）、QuickCutTMBamHI（日本Takara公司，货号：1605）、QuickCut buffer 10×（日本Takara公司，货号：1611）制备线性化载体；根据诺唯赞无缝克隆试剂盒（南京诺唯赞公司）设计EcoRⅠ和BamHⅠ为酶切位点的上下游扩增引物，Primer（5’~3’）（pCDH-PRKCB forward：GATTCTAGAGCTAGCGAATTCATGGCTGACCCGGCTGC；pCDH-PRKCB-reverse：TCCTTCGCGGCCGCGGATCCTTAGCTCTTGACTTC）（北京擎科生物科技有限公司），使用PrimeStar Max Premix（2×）（日本Takara公司，货号：R045Q）扩增目的插入片段；使用糖原、乙酸铵、无水乙醇纯化扩增产物，1%核酸胶目的插入片段条带位置鉴定；使用5×CE Ⅱ Buffer、Exnase Ⅱ试剂（南京诺唯赞公司，货号：C112-01）、线性化载体、目的插入片段、RNase ddH2O进行重组反应；使用DL-Stbl3感受态（北京擎科生物科技有限公司，货号：DLC106）和含氨苄抗生素的LB固体培养基进行重组产物转化；挑取LB固体培养基上的单个菌落进行菌落PCR鉴定，检测条带为阳性后，将剩余菌落打入已加入氨苄抗生素的LB液体培养基中，37 ℃摇菌12 h，最终提取重组pCDH-PRKCB质粒。
1.4 siRNA和细胞转染
本研究中使用的siRNA（上海生工生物），包括：PRKCB#1（siRNA-F-CCGGUAUAUUGAUUGGGAGAA、siRNA-R-UUCUCCCAAUCAAUAUACCGG）；PRKCB#2（siRNA-F-GACCAACACUGUCUCCAAAUU、siRNA-R-AAUUUGGAGACAGUGUUGGUC）；PRKCB#3 siRNA-F-CCUGUCAGAUCCCUACGUAAA、siRNA-R-UUUACGUAGGGAUCUGACAGG），使用Lipo8000（上海碧云天公司，货号：C0533）试剂对HCCLM3、MHCC97H细胞系进行siRNA转染、对PLC/PRF/5、Hep3B细胞使用pCDH载体质粒和pCDH-PRKCB过表达质粒转染。
1.5 蛋白质印迹实验
使用RIPA裂解缓冲液（江苏CWBIO公司，货号：CW2334S）从细胞或组织中提取总蛋白，随后进行电泳、转膜、封闭，一抗4 ℃孵育过夜，使用兔单克隆抗体PRKCB（1∶2 000，美国Abcam公司，货号：ab32026）、p44/42 MAPK（ERK1/2）（1∶2 000，货号：4695）、Phospho-p44/42 MAPK（1∶2 000，货号：4370）、p38 MAPK（1∶2 000，货号：9212）、Phospho-p38 MAPK（1∶2 000，货号：4511）（均购自美国Cell Signaling Technology公司）、JNK1/2/3（1∶2 000，货号：YT2440）、JNK1/2/3（phpshpo Thr183）（1∶2 000，货号：YP0156）（均购自美国Immunoway公司）、鼠单克隆抗体GAPDH（1∶2 000，北京ZSGB-BIO公司，货号：TA-08）对目的条带进行孵育。将膜与辣根过氧化物酶结合的二级抗体（1∶10 000，北京ZSGB-BIO公司）在室温下孵育2 h。Western blot测定使用Bio-Rad凝胶分析系统（美国Hercules公司）进行的。使用Image J软件（美国Bethesda公司）对Western blot条带进行定量。代表性Western blot结果，实验独立重复3次；柱状图为3次重复实验的灰度值定量。
1.6 细胞生长曲线实验
将Hep3B、PLC/PRF/5、MHCCLM3及MHCC97H 4种细胞均以1×10³个/孔的密度接种于96孔板（每组接种3个复孔），待细胞贴壁6~8 h后，按照CCK8试剂与细胞培养液1∶10的比例配制混合液，每孔加入100 μL。随后使用酶标仪（美国BioTek公司）在450 nm波长下检测第1天的吸光度值，之后每隔24 h重复检测1次，连续监测6 d。最终根据各时间点测得的吸光度值计算对应细胞数量，并据此绘制细胞生长曲线。
1.7 克隆形成实验
将PLC/PRF/5、Hep3B、MHCCLM3及MHCC97H细胞以1×10³个/孔的密度接种于6孔板（每组接种3个复孔），培养15 d。操作步骤如下：弃去6孔板内的培养基，用PBS清洗；每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室温固定20 min；再次用PBS清洗后，每孔加入1 mL结晶紫染液（上海碧云天公司，货号：Y268091）染色15 min；回收染色液，经PBS清洗后晾干，最后进行拍照记录。
1.8 EDU细胞增殖实验
按照EDU检测试剂盒Alexa Flour 555（上海碧云天公司，货号：C0075S）说明配制2×Edu工作液（Edu终浓度为10 μmol/L）；向6孔板中经处理的细胞每孔加入1 mL上述工作液进行Edu标记，于37 ℃条件下培养2 h；标记结束后，对6孔板内的细胞进行固定；随后使用Click反应液进行Edu检测，并采用Hoechst 33342对细胞核进行染色；最后通过倒置荧光显微镜观察并拍摄。使用Image J软件统计Edu阳性细胞率（百分比）（Edu阳性率计算公式=经Edu掺入试剂标记阳性细胞数/总细胞数×100%）。
1.9 统计学方法
采用GraphPad Prism 8.0软件对实验数据进行统计分析和绘图处理，计量资料的数据来自3次独立重复实验的结果，并使用均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）来表示。组间两两比较采用Student's t检验；多组间的比较采用单因素方差分析；生存分析为Wilcoxon检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 PRKCB在HCC组织中表达下调
根据TCGA数据库分析PRKCB在各类癌症中的表达情况，并重点分析PRKCB在肝癌中的表达。发现相对于正常组织，PRKCB在大多数肿瘤中表达均为下调，如膀胱癌（正常组织：
n=19，2.95±0.29，肿瘤组织：
n=414，1.00±0.08，
P<0.001）、胶质母细胞瘤（正常组织：
n=5，4.57±0.09，肿瘤组织：
n=169，2.28±0.16，
P<0.001）、肺腺癌（正常组织：
n=59，2.90±0.06，肿瘤组织：
n=535，1.88±0.07，
P<0.001）、子宫内膜样腺癌（正常组织：
n=35，1.27±0.13，肿瘤组织：
n=552，0.61±0.07，
P<0.001）等。而仅在少数肿瘤中，如头颈部鳞状细胞癌（正常组织：
n=44，0.87±0.16，肿瘤组织：
n=502，1.13±0.07，
P<0.001）和肾透明细胞癌中表达上调（正常组织：
n=72，1.24±0.17，肿瘤组织：
n=539，1.65±0.07，
P<0.001）（
图1A）。随后对肝细胞肝癌进行生物信息学分析，数据共有531例临床HCC样本，其中包括371例肝癌组织样本和160例癌旁正常组织样本。结果显示，PRKCB在肝癌组织中表达明显下调（正常组织：
n=160，0.69±0.06，肿瘤组织：
n=371，0.58±0.05，
P<0.001）（
图1B）。为进一步验证PRKCB在HCC临床样本中的表达情况，课题组收集肝癌患者肿瘤及癌旁组织标本，通过Western blot实验在这些样本的蛋白水平上进行验证。发现与癌旁组织相比，大部分患者肝癌样本蛋白表达水平降低（
图1C）。同时，通过验证PRKCB在各肝癌细胞系与肝正常细胞系中的表达情况，可以发现与正常肝细胞系L02相比，PRKCB在肝癌细胞系中表达均降低（
图1D）。
2.2 PRKCB低表达与患者的预后不良相关
通过TCGA数据库肝癌临床组织样本进行Kaplan-Meier生存分析，包括总生存期（overall survival，OS）（
图2A）、无复发生存期（recurrence free survival，RFS）（
图2B）、无进展生存期（progression-free survival，PFS）（
图2C）和疾病特异性生存期（disease free survival，DSS）（
图2D），结果显示PRKCB与患者的预后不良密切相关（
图2A：
P=0.022，
图2B：
P<0.001，
图2C：
P<0.001，
图2D：
P=0.012）。PRKCB高表达组患者的总生存期明显延长，无复发生存期与无进展生存期亦明显延长，且疾病特异性生存期同样表现出延长趋势。以上结果提示PRKCB可能抑制HCC的发生和发展。
2.3 过表达PRKCB抑制肝癌细胞增殖
为进一步探究PRKCB在肝癌发生发展中起到的抑制作用。本研究通过Western blot实验在肝癌细胞系中对PRKCB的内源性表达情况进行检测，结果显示PRKCB在PLC/PRF/5和Hep3B细胞系中表达更低（
图1D），因此本课题组构建了pCDH-PRKCB过表达质粒，使用Lipo8000将过表达质粒转染至Hep3B和PLC/PRF/5细胞中通过Western blot实验验证转染情况（
图3A、B），并在后续实验中进一步探究PRKCB过表达对肝癌生物学行为的影响。Edu细胞增殖实验结果显示，在Hep3B和PLC/PRF/5细胞中过表达PRKCB后，与Vector组相比（Hep3B：42.33±1.44，PLC/PRF/5：33.00±6.57），pCDH-PRKCB组细胞的增殖速率明显减慢（Hep3B：26.33±3.80，PLC/PRF/5：20.33±5.16，
P<0.001）（
图3C、D）。细胞生长曲线结果显示，相较于Vector组（Hep3B：19.83±18.00，PLC/PRF/5：7.76±6.22），pCDH-PRKCB组细胞的生长速度明显下降（Hep3B：12.90±11.65，PLC/PRF/5：4.83±4.06，
P<0.001）（
图3E、F）。克隆形成实验也得到了类似的结果，过表达PRKCB的细胞集落面积百分比（Hep3B：14.942±4.627，PLC/PRF/5：11.754±9.128）明显低于对照组（Hep3B：25.412±5.547，PLC/PRF/5：23.713±12.186，
P<0.001）（
图3G、H）。以上结果表明，过表达PRKCB明显抑制HCC细胞的增殖。
2.4 沉默PRKCB促进肝癌细胞增殖
根据PRKCB内源性表达情况在MHCC-97H、MHCCLM3肝癌细胞系中沉默PRKCB，并通过Western blot实验验证其沉默效果（
图4A、B），选取其中沉默效果更好的2条siRNA（沉默效率>50%）进行后续实验。在MHCC-97H、MHCCLM3细胞中，与过表达PRKCB有着相反的效果。沉默PRKCB后，Edu细胞增殖实验结果显示，与siCtrl组相比（MHCC-97H：10.02±7.71，HCCLM3：9.46±7.12），siPRKCB-1组（MHCC-97H：14.21±11.55，HCCLM3：11.79±9.18，
P<0.001），siPRKCB-2组（MHCC-97H：15.35±12.93，MHCCLM3：11.81±9.81，
P<0.001）（
图4C、D）增殖速度明显增加。细胞生长曲线结果显示，与siCtrl组相比（MHCC-97H：23.511±0.623，HCCLM3：21.663±0.169），siPRKCB-1组（MHCC-97H：35.159±1.286，MHCCLM3：29.11±1.39，
P<0.001），siPRKCB-2组（MHCC-97H：39.415±0.744，MHCCLM3：30.628±2.342，
P<0.001）（
图4E、F）细胞生长速度明显增加。克隆形成实验结果显示，沉默PRKCB后，siPRKCB-1组（MHCC-97H：32.439±6.175，HCCLM3：29.063±1.000，
P<0.001），siPRKCB-2组（MHCC-97H：32.298±3.614，MHCCLM3：27.807±2.517，
P<0.001）细胞集落面积百分比明显高于对照组（MHCC-97H：11.523±8.869，HCCLM3：17.326±6.106）（
图4G、H）。以上结果表明，沉默PRKCB可有效促进细胞的增殖，PRKCB对于肿瘤细胞的抑制作用明显。
2.5 MAPK信号通路可能参与PRKCB调控细胞增殖
作为一种蛋白激酶，PRKCB可以通过磷酸化下游信号分子发挥作用。有文献报道，PKC家族及其同工酶可通过影响MAPK信号通路而发挥作用，PKC-MAPK通路可以通过氧化应激反应与激活信号通路，调控心血管系统的重构并可能引起功能障碍
[15]。在肝癌中，PKCα可以刺激双氧化酶2介导的ROS产生，同时，双氧化酶2可以阻断PKCα诱导的Akt/MAPK通路的激活，从而影响肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭
[16]。由此，本研究检测转染了PRKCB过表达质粒的Hep3B和PLC/PRF/5细胞中MAPK信号通路的关键蛋白分子。可以发现，在过表达PRKCB后，实验组细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated proteinkinases，ERK）[Hep3B：
F=15.610，
P<0.05；PLC/PRF/5：
F=374.890，
P<0.01]，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）[Hep3B：
F=66.4700，
P<0.01；PLC/PRF/5：
F=146.930，
P<0.01]，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun kinase，JNK）的磷酸化[Hep3B：
F=134.580，
P<0.01；PLC/PRF/5：
F=124.710，
P<0.01]较对照组均有不同程度的降低（
图5A、B）。在沉默PRKCB的MHCC97H和HCCLM3细胞中，siPRKCB-1组ERK[MHCC-97H：
F=28.520，
P<0.01；HCCLM3：
F=0.610，
P=0.470]、p38[MHCC-97H：
F=182.630，
P<0.01；HCCLM3：
F=287.630，
P<0.01]、JNK[MHCC-97H：
F=536.210，
P<0.01；HCCLM3：
F=348.620，
P<0.01]的磷酸化程度较siCtrl组增加；siPRKCB-2组ERK[MHCC-97H：
F=15.380，
P<0.05；HCCLM3：
F=0.520，
P=0.510]、p38[MHCC-97H：
F=158.270，
P<0.01；HCCLM3：
F=438.650，
P<0.01]、JNK[MHCC-97H：
F=1 126.740，
P<0.01；HCCLM3：
F=310.480，
P<0.01]的磷酸化程度较siCtrl组也增加（
图5C、D）。
3 讨论
肝癌已成为全球癌症相关死亡的三大主要原因之一，其发生发展与多种遗传及环境因素密切相关
[17]。尽管目前已明确肝炎病毒感染、黄曲霉素暴露、酗酒等是HCC的主要危险因素，其具体的分子机制尚未完全阐明。当前的治疗策略，包括早期肝癌的手术切除联合放化疗，以及晚期肝癌的靶向药物治疗，效果均不理想
[18-20]。因此，寻找新的HCC治疗靶点以改善患者生存质量，仍是1项迫切而艰巨的任务。
蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族作为细胞内信号转导的关键调节者，包含多达12个亚型，根据其结构特征与激活所需的第二信使，可分为传统型[如PKCα、PKCβI、PKCβⅡ和PKCγ，依赖Ca²⁺、二酰基甘油（DAG）及磷脂激活]、新型（如PKCδ、PKCε、PKCη和PKCθ，需DAG但不依赖Ca²⁺）以及非典型（如PKCζ和PKCι/λ，既不依赖Ca²⁺也不依赖DAG）3个亚家族
[21]。各亚型虽共享相似的催化结构域，但在调控结构域存在差异，这赋予它们在细胞内截然不同的功能，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、迁移等重要生理过程，也在肿瘤发生发展中扮演多样角色
[22]。在众多PKC亚型中，多数被报道具有促癌活性。例如，PRKCA编码的PKCα作为经典PKC家族成员，在乳腺癌中被证实通过激活MAPK/ERK、PI3K/AKT等细胞内促增殖、抗凋亡信号通路，有力推动癌细胞增殖、转移，提升肿瘤干细胞特性并诱导耐药
[23]。在基底样乳腺癌组织与细胞系中，PRKCA转录水平明显上调
[24]。同样，PKCη在胶质母细胞瘤U-251细胞中，经佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）刺激激活后，可激活AKT及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，进而促进细胞增殖
[25]；在前列腺癌PC-3细胞中，PKCη高表达与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）耐药紧密关联，敲低PKCη可明显增强TRAIL诱导的细胞凋亡
[26]。然而，本研究聚焦的PRKCB在肝癌中呈现出独特的抑癌作用，与多数PKC亚型促癌趋势相悖。在肝癌组织中，PRKCB表达明显下调，其低表达与肿瘤恶性程度高、预后不良密切相关，恢复PRKCB表达可有效抑制肝癌细胞的增殖能力。本研究表明，PRKCB在肝癌中的抑癌作用涉及对MAPK等关键信号通路的负向调控，这提示PRKCB可能作为一种肿瘤抑制因子。
值得注意的是，PRKCB这种抑癌现象并非肝癌所特有。在结直肠癌中，PRKCB表达缺失同样伴随肿瘤进展加速、转移风险增加
[27]；在白血病、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤类型研究中，也陆续观察到PRKCB发挥抑癌功能
[28-30]，提示其在肿瘤抑制方面具有一定普适性，但具体分子机制在不同肿瘤中可能存在差异，受肿瘤微环境、细胞遗传背景等多种因素影响。
综上所述，本研究系统剖析了PRKCB在肝癌中的表达模式与潜在抑癌机制，首次在肝癌背景下明确PRKCB作为抑癌因子的关键地位，揭示了PKC家族内部功能的多样性与复杂性，为深入理解肝癌发病机制提供全新视角，也为肝癌及其他相关肿瘤的精准治疗开辟新思路。未来，亟待进一步探究PRKCB在不同肿瘤类型中的共性与特性调控机制，开发靶向PRKCB的创新疗法，提升肿瘤治疗效果，改善患者预后。
尽管本研究初步揭示了PRKCB在HCC中的抑癌作用及MAPK通路参与的潜在机制，仍存在若干局限性。首先，结论主要基于体外实验，尚未在动物模型中进行体内验证；其次，PRKCB调控MAPK通路的具体分子机制，尤其是其上下游调控关系，尚未完全明确；此外，是否存在其他信号通路的参与以及PRKCB自身的表达调控机制（如转录及表观遗传水平）仍有待进一步研究。后续研究将在体内模型和临床样本中进一步验证PRKCB的功能，并深入探索其调控网络，以推动HCC精准治疗的发展。
重庆市技术创新与应用发展专项企业科技攻关联合行动计划资助项目(CSTB2025TIAD-qykjggX0305)
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