姜黄素通过调节高脂饮食大鼠的自噬来改善肝脏脂肪变

Curcumin improves hepatic steatosis by regulating autophagy in rats fed with a high-fat diet

摘要

目的 研究姜黄素对高脂喂养大鼠肝脏自噬的影响，探讨其对肝脏脂肪变的保护作用。 方法 将SD大鼠随机分为正常对照组（normal control group，NC）和高脂饮食组，喂养8周后，高脂饮食组再随机分为高脂组（high-fat group，HF）、低剂量姜黄素组（low dose of curcumin group，LC）和高剂量姜黄素组（high dose of curcumin group，HC）。在16周末，测定体质量、肝指数、空腹血糖、空腹血清胰岛素及胰岛素抵抗指数；丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）及肝脏甘油三酯和总胆固醇；HE及油红O染色观察肝脏脂肪变程度；透射电镜观察肝脏自噬体；Western blot法检测肝组织腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1light chain 3，LC3）及核孔糖蛋白p62（nuclear pore glycoprotein p62，P62）蛋白的表达。 结果 HE染色显示，HF组大鼠肝细胞脂肪变明显，油红O染色观察，HF组大鼠肝细胞内有大量脂滴沉积；HF组大鼠体质量、肝指数、空腹血糖、空腹血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、ALT及肝脏甘油三酯和总胆固醇较NC组均明显升高（P0.05）；与NC组相比，HF组大鼠肝组织p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达明显升高（P0.05），p-AMPK/AMPK和LC3蛋白表达明显降低（P0.05）。姜黄素干预后，大鼠肝细胞脂肪变减轻，肝细胞内有脂滴沉积减少；LC及HC组大鼠体质量、肝指数、空腹血糖、空腹血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、ALT及肝脏甘油三酯和总胆固醇较HF组明显降低（P0.05）；与HF组相比，LC及HC组大鼠肝组织p-AMPK/AMPK和LC3蛋白表达明显升高（P0.05），p-mTOR/mTOR和P62明显降低（P0.05）。 结论 高脂饮食可抑制肝脏自噬，诱发NAFLD。姜黄素能减轻高脂喂养大鼠脂质沉积，改善肝功能和IR，减轻高脂喂养大鼠肝脏脂肪变。姜黄素通过AMPK/mTOR途径调节大鼠肝脏自噬水平，从而对非酒精性脂肪性肝病起到治疗作用。

Abstract

Objective To investigate the effect of curcumin on hepatic autophagy in rats fed with a high-fat diet，as well as its protective effect against hepatic steatosis. Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group（NC group） and high-fat diet group，and after feeding for 8 weeks，the rats in the high-fat diet group were randomly divided into high-fat group （HF group），low-dose curcumin group（LC group），and high-dose curcumin group（HC group）. At the end of week 16，body weight，liver index，fasting blood glucose，fasting serum insulin，and insulin resistance index were measured，as well as alanine aminotransferase （ALT） and the levels of triglyceride and total cholesterol in the liver；HE staining and oil red O staining were used to observe the degree of hepatic steatosis； transmission electron microscopy was used to observe liver autophagosomes； Western blot was used to measure the protein expression levels of AMP-activated protein kinase（AMPK），mammalian target of rapamycin（mTOR），phosphorylated mTOR（p-mTOR），microtubule-associated protein 1 light chain 3（LC3），and nuclear pore glycoprotein P62 in liver tissue. Results HE staining showed significant hepatocyte steatosis in the HF group，and oil red O staining showed the deposition of a large number of lipid droplets in hepatocytes in the HF group. Compared with the NC group，the HF group had significant increases in body weight，liver index，fasting blood glucose，fasting serum insulin，insulin resistance index，ALT，and the levels of triglyceride and total cholesterol in the liver（P0.05）. Compared with the NC group，the HF group had significant increases in the protein expression levels of p-mTOR/mTOR and p62（P0.05） and significant reductions in the protein expression levels of p-AMPK/AMPK and LC3 in liver tissue（P0.05）. After treatment with curcumin，there was alleviation of hepatocyte steatosis and a reduction in lipid droplet deposition in hepatocytes； compared with the HF group，the LC and HC groups had significant reductions in body weight，liver index，fasting blood glucose，fasting serum insulin，insulin resistance index，ALT，and the levels of triglyceride and total cholesterol in the liver（P0.05）； compared with the HF group，the LC and HC groups had significant increases in the protein expression levels of p-AMPK/AMPK and LC3（P0.05） and significant reductions in the levels of p-mTOR/mTOR and p62 in liver tissue（P0.05）. Conclusion High-fat diet can inhibit hepatic autophagy and induce non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）. Curcumin can reduce lipid deposition，improve liver function and insulin resistance，and alleviate hepatic steatosis in rats fed with a high-fat diet. Curcumin may exert a therapeutic effect on NAFLD by regulating hepatic autophagy through the AMPK/mTOR signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

姜黄素 / 自噬 / 腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 / 非酒精性脂肪性肝病

Key words

curcumin / autophagy / AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin / nonalcoholic fatty liver disease

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种代谢性、慢性应激性肝病，其发病与个体的遗传背景及胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）状态有着紧密的关联。NAFLD的全球患病率约为25%^[1]，这一比例使其成为当前全球最大的慢性肝脏疾病，同时也是导致普通成年人在健康体检中肝脏酶学指标异常的主要因素。近年来研究发现，自噬在NAFLD 的发生、发展中具有重要的病理生理意义。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-actived protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号传导通路在调控自噬过程中起着重要作用。现有动物实验与人体研究表明，姜黄素通过调节脂质代谢、抗炎、抗氧化、促进自噬能够减轻肝脏脂质积累，对NAFLD显示出一定的治疗效果^[2]。本研究聚焦于姜黄素对高脂饮食大鼠肝脏自噬活动的调节作用，旨在深入探索姜黄素在治疗非酒精性脂肪性肝病大鼠中的潜在效用及其相关作用机理。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

实验中使用的姜黄素、油红O染液均来源于美国的Sigma公司。为了评估脂质代谢情况，采用了以下试剂盒：甘油三酯试剂盒和总胆固醇试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。此外，胰岛素试剂盒也购自南京建成生物工程研究所。在分子水平的研究中，使用多种抗体，包括：AMPK抗体、磷酸化AMPK抗体、LC3A/B抗体，以及P62抗体均购自美国的CST公司。同时，还使用了mTOR抗体、磷酸化mTOR抗体，同样购自CST公司。IgG二抗则购自北京柏奥易杰公司。采用了β-actin抗体作为内参，该抗体购自上海Abways公司。

1.2 实验动物

本实验采用了45只SPF级雄性Sprague Dawley大鼠，6周龄，体质量为（190±20）g，大鼠均购自河北医科大学实验动物中心，并持有动物许可证号：SCXK（冀）2018-004。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的制备及分组

本实验选取雄性Sprague Dawley大鼠共计45只，依据随机原则将其划分为2个初始群组。其中，正常对照组（normal control，NC）包含10只大鼠，该组大鼠接受常规饲料进行饲养。剩余的35只大鼠则分配至高脂饲料喂养群组，高脂饲料的成分精确配比为10%猪油、2%胆固醇、0.5%胆盐以及87.5%的常规饲料。经过为期8周的饲养周期后，从高脂喂养群组中随机选取5只大鼠进行肝组织切片检查，并对大鼠造模前后体质量、血脂进行对比，旨在验证高脂模型构建的成功性。随后，剩余的30只高脂喂养大鼠被进一步细分为3个子群组：高脂组（HF组，10只）、低剂量姜黄素处理组（LC组，10只）以及高剂量姜黄素处理组（HC组，10只）。在接下来的实验阶段，HF组大鼠继续沿用高脂饲料进行喂养。而LC与HC组大鼠，在维持高脂饲料喂养的基础上，分别通过灌胃方式给予200 mg/kg与400 mg/kg剂量的姜黄素，每日实施1次，该治疗策略持续实施8周^[3]。

1.3.2 大鼠肝指数和胰岛素抵抗指数的测定

测量并记录每只大鼠的体质量及其肝脏的湿重，随后依据这些数据计算出肝指数，具体计算方法：将肝脏湿重除以大鼠的体质量，再乘以100%，以此得出肝指数；血糖仪测量空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），并通过胰岛素检测试剂盒来确定空腹血清胰岛素水平。随后，采用公式（空腹血糖乘以空腹血清胰岛素再除以22.5）来计算胰岛素抵抗指数。

1.3.3 血生化及肝脏甘油三酯和总胆固醇测定

于实验进行至第16周末期，将大鼠实施安乐死并采集其血液样本，随后采用全自动生物化学分析仪对样本中的丙氨酸转氨酶（alanineaminotransferase，ALT）水平进行检测；从大鼠相同部位的肝组织中取样并抽取脂质成分，随后依据甘油三酯与总胆固醇检测试剂盒的操作指南，对肝脏中的这2项指标进行测定。

1.3.4 肝脏病理学及油红O染色

每只大鼠取相同部位肝组织，进行石蜡切片、HE染色及油红O染色，在光镜下观察肝脏脂肪变程度。

1.3.5 透射电镜观察肝脏自噬体

取相同部位肝组织，剪取1 mm×1 mm×1 mm 肝组织，以2.5%戊二醛4 ℃固定2 h，使用1%浓度的锇酸进行2 h的固定处理，随后以缓冲液进行3次漂洗，每次持续5 min。接着，实施梯度脱水步骤：首先在70%丙酮中浸泡10 min，然后在80%丙酮中浸泡10 min，再在90%丙酮中浸泡10 min，最后在100%丙酮中浸泡5 min。完成脱水后，使用环氧树脂对样本进行包埋，并进行超薄切片。后进行醋酸铀染色，透射电镜进行观察并拍摄照片。

1.3.6 运用Western blot方法评估肝组织中AMPK、mTOR、LC3及P62蛋白的表达

①将采集的肝组织样本进行细碎处理，并加入足够量的蛋白质裂解溶液，制备成均匀的浆液。②从这个匀浆中提取出蛋白质，并对其浓度进行精确地测量。③对蛋白质样品进行加热处理以实现其变性，并取20 μg蛋白质样本加载到12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的相应孔槽内，进行电泳以实现蛋白质的分离。④电泳操作完成后，将已分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯薄膜上，并将其浸泡在含有5%脱脂牛奶的溶液中，于室温环境下封闭1 h。⑤将膜分别沉浸在经过适当稀释的各种第一抗体溶液中，这些抗体包括AMPK抗体、磷酸化AMPK抗体、mTOR抗体、磷酸化mTOR抗体、LC3A/B抗体、P62抗体以及β-actin抗体，随后在4 ℃的条件下进行过夜孵育。⑥孵育结束后，使用TBST缓冲液对PVDF膜进行3次漂洗，每次漂洗均充分进行。⑦将膜浸入以1∶10 000比例稀释的第二抗体溶液中，孵育2 h。再次使用含聚山梨酯-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（Tris-Buffered Saline with Tween 20，TBST）缓冲液对膜进行3次漂洗后，采用增强化学发光法进行显色处理。⑧使用凝胶成像仪对显色后的条带进行观察并拍照，并采用Image J软件对所得图像数据进行深入分析。在分析步骤中，选用β-actin作为LC3Ⅱ与P62的内参标准，同时，AMPK和mTOR分别作为p-AMPK和p-mTOR的内参。最终的结果通过目标条带与对应内参条带的光密度比值百分比来呈现，从而准确反映肝组织中各蛋白的表达水平。

1.4 统计学方法

本研究运用SPSS 26.0软件对所得数据进行分析。符合正态分布方差齐的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，对于多组间的差异比较，采用单因素方差分析；而在各组间的具体比较上，则选用了Tukey’s检验手段。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 大鼠体质量、肝指数、空腹血清胰岛素和胰岛素抵抗指数

与NC组相比，HF组大鼠体质量、肝指数、空腹血清胰岛素和胰岛素抵抗指数明显升高，与HF组相比，LC和HC组大鼠体质量、肝指数、空腹血清胰岛素和胰岛素抵抗指数明显降低，且与给药剂量有关，差异有统计学意义（P0.05）。见表1、2。

2.2 大鼠肝脏脂质沉积情况

于光学显微镜下观察经HE染色处理的肝组织样本，可见NC组的大鼠肝细胞内未发生脂肪沉积现象，相比之下，HF组的大鼠肝细胞则展现出明显的脂肪变性，且其中部分肝细胞还呈现出气球样膨胀的形态变化，LC和HC组肝细胞脂肪变减轻；肝组织油红O染色光镜下观察，与NC组相比，HF组大鼠肝细胞内有大量脂滴沉积，LC和HC组肝细胞内脂滴沉积明显减少，且有剂量依赖。见图1、2。

2.3 透射电镜观察肝脏自噬体

透射电镜下，肝脏自噬体为空泡状的双层膜样结构。HF组大鼠肝脏脂滴明显多于NC组，HF组与NC组自噬体数量无明显区别；给予姜黄素后大鼠肝脏脂滴明显减少，自噬体数量明显增多。见图3。

2.4 大鼠ALT及肝脏甘油三酯和总胆固醇测定

相较于NC组，HF组大鼠的血清丙氨酸转氨酶水平以及肝脏内甘油三酯与总胆固醇的含量均呈现出上升的趋势，且差异有统计学意义（P0.05）；经姜黄素干预8周后，LC和HC组大鼠丙氨酸转氨酶水平及肝脏甘油三酯和总胆固醇含量明显低于HF组，并与给药剂量有关，差异有统计学意义（P0.05）。见表1、2。

2.5 肝组织AMPK、mTOR、LC3及P62蛋白的表达

HF组大鼠肝组织p-AMPK/AMPK蛋白表达明显低于NC组，LC和HC组大鼠肝组织p-AMPK/AMPK蛋白表达明显高于HF组，并与给药剂量有关，差异均有统计学意义（P0.05）；HF组大鼠肝组织p-mTOR/mTOR蛋白表达明显高于NC组，LC和HC组大鼠肝组织p-mTOR/mTOR蛋白表达明显低于HF组，并与给药剂量有关，差异均有统计学意义（P0.05）；与NC组相比，HF组大鼠肝组织LC3表达明降低，P62表达明显升高，与HF组相比，LC和HC组大鼠肝组织LC3表达明升高，P62表达明显降低，并与给药剂量有关，差异均有统计学意义（P0.05）。见图4~6。

3 讨 论

本研究旨在探讨姜黄素对高脂饮食大鼠肝脏mTOR-自噬的影响。本研究结果表明，姜黄素能够调节肝脏自噬，降低NAFLD大鼠血脂水平和体质量，改善IR，改善肝脏脂肪变。

NAFLD不仅是慢性肝病及相关并发症的重要原因，而且还与2型糖尿病、代谢综合征、心血管及脑血管疾病，以及结直肠肿瘤之间存在着紧密的关联性。近年来，NAFLD的患病率在全球范围内持续上升^[4]。营养过剩和IR是NAFLD发生发展的重要危险因素。NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现^[5]。NAFLD的发病机制尚未完全明确，其机制复杂多样，涉及多个器官和多种机制，目前比较公认的是“多重打击”学说^[6]。目前运动、饮食及生活方式干预仍然是首选的治疗方式，尚未有针对NAFLD的有效治疗药物^[7]。因此，阐明NAFLD的发病机制并寻求有效的治疗方法是近年来的研究方向。

自噬在NAFLD的发生、发展中发挥着重要作用^[8]，自噬可能是治疗NAFLD的重要靶点。自噬是一种在进化上高度保守的、依赖于溶酶体的细胞自我降解过程，是细胞应对外界压力的调控机制之一，同时也是细胞实现自我更新与修复的关键手段，在真核细胞中普遍存在^[9]。自噬过程包含起始阶段、成核与成熟阶段以及扩展与降解阶段，这些阶段受到多种自噬相关基因（autophagy-related genes，ATGs）的精细调控^[10]。机体在能量不足和体内脂质适量增加时，自噬过程有助于消耗肝脏内的脂肪，从而改善肝脏的脂肪代谢失衡状态。然而，长期的高脂饮食习惯会导致肝脏脂质积累增多，进而抑制自噬的功能，减弱其分解脂质的能力，这不仅加剧了脂质的沉积，还促进了NAFLD的发生。自噬是肝细胞脂质移除的重要过程^[10]。自噬的抑制被认为可能是NAFLD的原因之一。高脂饮食喂养SD大鼠8周后，肝脏中自噬相关基因Beclin-1、ATG5和LC3-Ⅱ水平降低^[11]。Singh R等^[10]研究发现，在培养的肝细胞中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤或沉默ATG5都会使肝细胞TG水平升高；敲除ATG7抑制自噬，能够增加小鼠肝脏中TG水平。通过高脂肪饮食诱导小鼠NAFLD，应用咖啡因对小鼠进行干预，增强了小鼠肝细胞自噬从而降低了肝内脂质含量，还显著减少了肝纤维化^[12]。在本研究中，通过油红O染色观察，高脂饮食大鼠肝脏中脂肪成分含量明显增加，通过透射电子显微镜观察，NAFLD大鼠肝脏中无明显自噬体，这也说明了NAFLD时肝脏自噬受到抑制，与既往研究结果一致。

IR是NAFLD发病机制的一个重要组成部分^[13]。IR可使脂肪组织脂肪分解代谢增强，血脂升高，更多的游离脂肪酸向肝脏运输，肝脏对脂肪酸的氧化能力下降，是肝脏脂肪变发生、发展的关键^[14]。在肝脏中，IR的特征是糖异生增加和肝糖原合成减少，胰岛素刺激的肝糖原合成与肝脏脂肪含量呈负相关^[15]。胰岛素抵抗状态会使自噬受到抑制^[16]。雷帕霉素激活自噬可改善2型糖尿病动物模型中的胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性^[17]。本研究发现，经高脂喂养的大鼠，IR明显高于正常对照组，应用姜黄素以后大鼠自噬增强，IR得到明显改善。

AMPK/mTOR是体内重要的自噬调节通路。AMPK是机体内的能量感受器，可调节细胞代谢以维持能量稳态^[18]。mTOR 是细胞内整合生长和营养信号的中心信号调节因子^[19]。mTOR含有两个复合体，mTORC1和mTORC2^[20]。mTORC1对雷帕霉素敏感，并在自噬调控中起主要作用。AMPK被激活以后，能够抑制mTOR活化，诱导细胞自噬。AMPK通过磷酸化TSC2和RAPTOR（TORC1的核心成分），抑制TORC1活性来调节自噬^[19]。mTOR通过磷酸化人自噬启动蛋白1（unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）的Ser 757位点，抑制ULK1的活性，从而抑制自噬起始复合物的形成^[21]。mTOR还可以通过抑制转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）的核易位来调节溶酶体，从而间接抑制自噬^[22]。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1light chain 3，LC3）是自噬体的关键结构蛋白，其脂化形式（LC3-Ⅱ）定位于自噬体膜，是自噬活化的直接标志物。核孔糖蛋白p62（nuclear pore glycoprotein p62，P62）是选择性自噬的核心受体，p62蛋白水平与自噬活性呈负相关。本研究发现，高脂饮食大鼠肝脏中p-AMPK蛋白水平表达降低，p-mTOR蛋白水平表达升高，肝脏中LC3-Ⅱ蛋白表达降低，P62蛋白水平升高，说明NAFLD大鼠肝脏自噬水平通过AMPK/mTOR通路受到抑制。

姜黄素是一种天然多酚化合物，主要来源于姜黄属植物的根茎^[23]。姜黄素有改善IR、减轻炎症反应及氧化应激等作用，对NAFLD、2型糖尿病等代谢性疾病具有治疗作用，但其确切机制尚不完全明确。本研究发现，NAFLD大鼠给予姜黄素后，大鼠肝脏中p-AMPK蛋白水平表达明显升高，p-mTOR蛋白水平表达降低，肝脏中LC3-Ⅱ蛋白水平升高，P62蛋白水平降低，并且透射电镜可见明显的自噬体形成，肝脏中脂滴减少，特别是高剂量组。姜黄素可能通过AMPK/mTOR调节大鼠肝脏自噬水平，改善IR，从而对NAFLD起到治疗作用。

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基金资助

河北省政府资助省级医学优秀人才资助项目(ZF2023188)

河北省医学科学研究重点课题计划资助项目(20210710)