NLRP12通过糖酵解促进前列腺癌的进展

NLRP12 promotes the progression of prostate cancer via glycolysis

摘要

目的 研究富亮氨酸重复序列蛋白12（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing protein 12，NLRP12）基因对前列腺癌的恶性进展的影响，并初步探究糖酵解代谢的调控作用，同时验证糖酵解途径在NLRP12介导前列腺癌进展中的地位。 方法 利用人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）和癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库分析NLRP12在癌与癌旁组织中的表达差异；蛋白质印迹（Western blot）检测和定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）检测NLRP12在正常前列腺细胞及不同前列腺癌细胞系中的表达。构建 NLRP12敲低及过表达前列腺癌细胞系并验证效率；采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK8）、Transwell实验检测NLRP12对癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响；通过检测葡萄糖消耗、乳酸生成及丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）、己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）表达，分析NLRP12对糖酵解的调控作用。使用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）后，检测糖酵解及细胞恶性行为指标，验证NLRP12是否通过糖酵解影响前列腺癌进展。 结果 HPA、TCGA数据库分析及Western blot、qRT-PCR检测均显示，NLRP12在前列腺癌组织及细胞中高表达；敲低NLRP12可减弱前列腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力，过表达则增强，且NLRP12可促进癌细胞糖酵解，进而影响前列腺癌进展。 结论 NLRP12在前列腺癌组织及细胞中呈高表达状态，可能通过促进前列腺癌细胞的糖酵解代谢，增强细胞的增殖、侵袭与迁移能力，进而推动前列腺癌的进展。

Abstract

Objective To investigate the effect of the nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing protein 12（NLRP12） gene on the malignant progression of prostate cancer，the regulatory role of glycolytic metabolism，and the role of the glycolytic pathway in NLRP12-mediated prostate cancer progression. Methods Human Protein Atlas（HPA） and The Cancer Genome Atlas（TCGA） databases were used to analyze the difference in the expression of NLRP12 between cancer tissue and paracancerous tissue，and Western blot and qRT-PCR were used to measure the expression of NLRP12 in normal prostate cells and different prostate cancer cell lines. Prostate cancer cell lines with NLRP12 knockdown or overexpression were established，and their efficiency was verified. CCK8 assay and Transwell assay were used to assess the influence of NLRP12 on cancer cell proliferation，invasion，and migration，and the regulatory effect of NLRP12 on glycolysis was analyzed by measuring glucose consumption，lactate production，and the expression of pyruvate kinase M2 and hexokinase 2. After treatment with the glycolytic inhibitor 2-deoxy-D-glucose，the indicators for glycolysis and malignant cell behavior were measured to verify whether NLRP12 affects the progression of prostate cancer through glycolysis. Results Analyses of HPA and TCGA databases and the results of Western blot and qRT-PCR showed a high expression level of NLRP12 in prostate cancer tissue and cells. NLRP12 knockdown reduced the proliferation，invasion，and migration of prostate cancer cells，while NLRP12 overexpression enhanced such abilities. In addition，NLRP12 promoted glycolysis in promote cancer cells，thereby affecting the progression of prostate cancer. Conclusion There is a high expression level of NLRP12 in prostate cancer tissue and cells，and NLRP12 can promote the progression of prostate cancer by promoting glycolytic metabolism in prostate cancer cells and strengthening the proliferation，invasion，and migration abilities of prostate cancer cells.

Graphical abstract

关键词

富亮氨酸重复序列蛋白12 / 糖酵解 / 前列腺癌

Key words

nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing protein 12 / glycolysis / prostate cancer

前列腺癌是男性特有的泌尿系统高发恶性肿瘤，其在全球的发病率逐年增高^[1]。作为全球癌症疾病谱中的重要病种，该病已成为威胁男性健康与生命质量的重要公共卫生问题^[2]。尽管近年来前列腺癌的诊断与治疗技术取得一定进展，但部分患者确诊时已处于晚期，且易出现复发与转移，治疗效果仍不理想^[3]。

核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列蛋白12（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing protein 12，NLRP12）作为核苷酸结合亮氨酸重复序列受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR）家族中兼具炎症调控与疾病干预潜力的重要成员，自从在人白血病细胞系HL60中首次被鉴定以来，其生物学功能与临床意义便持续受到学界关注。肿瘤细胞代谢重编程是肿瘤的核心生物学特征之一，其中糖酵解代谢增强（即Warburg效应）更是肿瘤细胞快速获取能量、满足自身增殖需求的关键途径^[4-5]。这一代谢过程不仅能为肿瘤细胞高效供能以生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），更能通过产生磷酸戊糖、丙酮酸等关键中间产物，为核酸、蛋白质等生物大分子的合成提供核心原料，从而直接为肿瘤细胞的恶性生物学行为提供物质支撑，成为推动肿瘤进展的重要代谢基础^[6-8]。

已有研究表明，NLRP12在肝癌^[9]、结直肠癌^[10]及胶质母细胞瘤^[11]等多种恶性肿瘤中发挥重要的功能调控作用，且其表达水平与患者预后密切相关。NLRP12在前列腺癌中的表达特征及具体作用机制仍不明确，探究NLRP12在前列腺癌中的作用，并明确其是否通过调控糖酵解代谢重编程参与前列腺癌的恶性进程，是当前该领域有待填补的研究空白。本研究拟通过体外细胞实验，进一步验证NLRP12在前列腺癌细胞与正常前列腺细胞中的表达差异，明确其对前列腺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响，并深入探究其是否通过调控糖酵解代谢参与前列腺癌的恶性进展，为前列腺癌的诊断优化与靶向治疗发展提供新的理论基础及潜在候选靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞系

实验所用前列腺上皮细胞RWPE-1、前列腺癌细胞DU145、PC3、LNCaP及22RV1细胞系，均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

实验所用RPMI-1640培养基及Ham’s F-12K（Kaighn 改良型）营养培养基，均由上海源培生物科技股份有限公司提供；K-SFM培养基、SYBR Green Real-time PCR MasterMix购自赛默飞世尔科技公司；Prime Script RT reagent Kit为宝日医生物技术（北京）有限公司产品；青链霉素混合液、ECL Plus超敏发光液、嘌呤霉素、蛋白酶抑制剂混合物、放射免疫沉淀分析（radioimmunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA）裂解液购自中国索莱宝生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒、葡萄糖摄取比色测定试剂盒、乳酸比色测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、结晶紫染色液购自武汉塞维尔生物科技有限公司；NLRP12抗体、己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）抗体、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗购自武汉三鹰技术有限公司；Transwell小室购自无锡耐思生命科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

DU145、LNCaP、22RV1细胞用含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基培养，PC3细胞采用同配方的Ham’s F-12K培养基，RWPE-1细胞在Defined K-SFM培养基中培养。各细胞系均在37 ℃、5% CO₂环境中常规培养。每2 d更换1次培养基。

1.2.2 构建细胞模型

合成靶基因和短发夹RNA（short hairpin ribonucleic acid，shRNA）编码慢病毒载体、及空载体均由上海吉凯基因化学有限公司合成；嘌呤霉素用于稳定细胞系的筛选。

1.2.3 定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）

采用TRIzol试剂提取各细胞系RNA，经Prime Script RT试剂盒逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。使用两步法对cDNA产物进行扩增，条件为95 ℃、30 s预变性；变性95 ℃、20 s，退火/延伸60 ℃、30 s，40个循环；循环结束后进行熔解曲线分析：65 ℃至95 ℃，每0.5 ℃保持5 s并采集荧光信号。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物序列如下，NLRP12（F：ACCAGACCTTGACCGACCATT；R：GAGGACTCGGAGTTTGCAGC），β-actin（F：CATGTACGTTGCTATCCAGGC，R：CTCCTTAATGTCACGCACGAT）。使用2^-ΔΔCt方法计算信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达水平，并使用β-actin作为校准品。

1.2.4 蛋白质印迹（Western blot）检测

Western blot检测蛋白表达。用细胞裂解液（RIPA缓冲液：蛋白酶抑制剂为100∶1）裂解样品，BCA法测浓度（将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的标准品孔中）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白后转印至0.22 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF）膜上，封闭采用无蛋白快速封闭液（30 min），一抗4 ℃孵育过夜后，Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）洗涤3次，常温二抗孵育2 h、TBST洗3次；ECL Plus发光液结合化学发光系统显影。

1.2.5 CCK8实验

将各组细胞以7×10³个/孔的密度接种至96孔板，每组设置3个复孔。各组细胞分别培养24、48、72及96 h后，每孔加入含10%CCK-8试剂的新鲜培养基，随后在450 nm波长下检测吸光度（absorbance，A值）。

1.2.6 Transwell实验

向Transwell小室上腔加入100 μL含1×10⁴ 个各组细胞的无血清培养基，下腔添加500 μL含血清培养基。37 ℃、5%CO₂环境孵育24 h后，擦除上腔未迁移细胞，迁移至下室的细胞用4%多聚甲醛固定30 min、结晶紫染色15 min。倒置显微镜下随机取3个视野统计细胞数。对于侵袭的检测，将Matrigel基质胶用基础培养基按1:8稀释，取60 μL到上室37℃孵育2 h，在上腔室铺覆基质胶。

1.2.7 葡萄糖消耗和乳酸生成的检测

采用葡萄糖、乳酸检测试剂盒，按照细胞数量1×10⁴个/孔分别测定前列腺癌细胞系的葡萄糖消耗量和乳酸产生量，操作均按试剂盒说明书标准流程进行。

1.3 统计学方法

实验均进行3次生物学重复，利用GraphPad Prism 9.5软件分析数据。以均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示结果，P<0.05界定为有统计学差异。仅涉及“单个变量”的多组比较采用单因素方差分析。“两个独立变量”的多组比较采用双因素方差分析；仅2组间的比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 NLRP12在前列腺癌中的表达

基于癌症基因组图谱-前列腺腺癌（The Cancer Genome Atlas-Prostate Adenocarcinoma，TCGA-PRAD）数据集的分析显示，NLRP12在前列腺癌组织中的表达水平高于癌旁正常前列腺组织（图1A）。人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库检测进一步证实，随着前列腺癌疾病进展，NLRP12的表达水平呈逐步升高趋势（图1B）。经Western blot检测发现，正常前列腺上皮细胞RWPE-1中NLRP12表达量较低，前列腺癌细胞系DU145、PC3、LNCaP及22RV1中NLRP12均呈现高表达特征，其中以DU145细胞中表达水平相对最高，PC3细胞中的表达量则低于其他检测的癌细胞系（图1C）。qRT-PCR实验进一步验证了Western blot的结果，两者结论一致，并且差异有统计学意义（P<0.05）（图1D）。以上结果表明NLRP12在前列腺癌组织及癌细胞系中均呈高表达，且其表达水平与疾病进展相关，表明NLRP12可能在前列腺癌发生发展中发挥重要的作用。

2.2 NLRP12调控前列腺癌的恶性生物学行为

采用shRNA靶向构建NLRP12干扰载体（shorthairpin RNA targeting NLRP12，sh-NLRP12）并转染DU145细胞，以敲低其NLRP12表达；利用编码NLRP12的慢病毒载体（overexpression NLRP12，oe-NLRP12）转染前列腺癌细胞系PC3，实现NLRP12的过表达。转染后，通过Western blot检测细胞中NLRP12蛋白的表达水平（图2A），并采用qRT-PCR验证其mRNA水平，以确认干扰与过表达模型构建成功，检测结果差异有统计学意义（P<0.05）（图2B）。CCK-8和Transwell实验结果表明，下调NLRP12的表达水平后前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力均出现下降，而过表达NLRP12则增强该细胞的上述能力，并且差异有统计学意义（P<0.05）（图2C、D）。综上，NLRP12能够促进前列腺癌细胞的恶性生物学行为。

2.3 NLRP12促进前列腺癌的糖酵解

既往研究表明，NLRP12通过降低三重基序蛋白25（tripartite motif-containing protein 25，TRIM25）介导的HK2降解促进胃癌糖酵解^[12]。而糖酵解也可以通过如SMC4/GLUT1/Rheb/mTOR通路促进前列腺癌的进展^[13]。为了验证NLRP12是否对前列腺癌细胞糖酵解能力产生影响，通过检测葡萄糖消耗水平（图3A）和乳酸生成量（图3B），检测结果发现敲低NLRP12后会减少DU145细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成，而过表达NLRP12则会增加PC3细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成，并且差异有统计学意义（P<0.05）。这说明了NLRP12可能会促进前列腺癌细胞的糖酵解能力。为了验证这一结论，进一步检测了糖酵解相关酶的表达（HK2和PKM2）（图3C），检测结果发现敲低NLRP12后会下调HK2与PKM2的表达，而NLRP12过表达则会促进这2种糖酵解相关酶的表达。综上，NLRP12增强前列腺癌细胞的糖酵解水平。

2.4 NLRP12通过糖酵解调控前列腺癌的恶性行为

为了明确NLRP12是否通过增强糖酵解调控前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，在NLRP12过表达的基础上加入糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG），通过分组干预开展验证实验。结果显示，2-DG处理后前列腺癌细胞的葡萄糖消耗水平（图4A）和乳酸生成量降低（图4B），糖酵解相关酶的表达水平下降（图4C），这有效地说明2-DG能够抑制糖酵解水平，并且差异有统计学意义（P<0.05）。进一步发现，利用2-DG抑制糖酵解后，NLRP12过表达导致的前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力降低，并且差异有统计学意义（P<0.05）（图4D、E）。这些检测结果表明了NLRP12可以通过增强前列腺癌细胞的糖酵解水平，进而正向调控其增殖、迁移及侵袭能力。

3 讨论

作为男性泌尿系统高发的恶性肿瘤之一^[14]，前列腺癌的全球发病率正处于逐年上升的状态^[15]。尽管临床诊疗技术不断发展，但部分患者仍面临疾病进展快、预后差的问题，深入探究其发病分子机制并寻找新的治疗靶点，对改善患者预后具有重要意义。

NLRP家族作为炎症小体的核心组成部分^[16]，其中NLRP12在多种肿瘤中的功能已有报道。NLRP12在不同肿瘤中呈现出明显的功能异质性，其作用模式因肿瘤类型的不同而存在明显差异。NLRP12通过负向调控JNK通路（降低其激活及下游c-Jun、c-Myc表达），抑制肝细胞癌增殖与肿瘤形成^[9]。NLRP12在结直肠癌中低表达，经STK38-GSK3β轴抑制Wnt/β-catenin通路，抑制肿瘤进展^[10]。胶质母细胞瘤中NLRP12高表达，与肿瘤高恶性度及患者不良预后相关^[11]。NLRP12除了在肿瘤领域发挥调控作用外，还广泛参与炎症相关疾病的病理过程，NLRP12通过维持肠道菌群多样性、抑制核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）介导的炎症级联反应，减轻炎症性肠病、酒精性肝损伤与类风湿关节炎的病理损伤^[17-18]。

NLRP12在不同肿瘤中的功能异质性提示其作用机制可能与肿瘤的代谢特征相关，而糖酵解作为肿瘤代谢重编程的核心特征，调控癌细胞增殖，与癌症进展密切相关^[19]。HIF-1/PDK3/PDK1轴驱动糖酵解，增强宫颈癌细胞缺氧适应与化疗耐药^[20]；三阴性乳腺癌存在代谢重编程特征，部分亚型对糖酵解存在依赖^[21]。结直肠癌PKM2异常表达介导糖酵解重编程，与奥沙利铂耐药相关，沉默PKM2可增强化疗敏感性^[22]。这些研究表明，糖酵解代谢重编程及其关键调控分子在多种癌症的发生发展中具有核心作用。

为了验证NLRP12在前列腺癌疾病进展中的作用，通过TCGA-PRAD数据集和HPA数据库分析及细胞实验证实：NLRP12在前列腺癌组织及前列腺癌细胞系中均高表达，与胶质母细胞瘤中NLRP12的促癌表达规律一致，提示其在前列腺癌中可能扮演促癌角色。NLRP12通过上调HK2、PKM2增强糖酵解以促进癌细胞恶性表型，糖酵解抑制剂2-DG可逆转其促癌效应，本研究揭示“NLRP12-糖酵解-前列腺癌恶性表型”调控轴，为前列腺癌机制研究与靶向治疗提供新视角和潜在靶点。

本研究虽明确了NLRP12在前列腺癌中的表达特征、功能及部分机制，但仍存在一定局限性：实验主要基于体外细胞模型与公共数据集，缺乏体内动物实验对NLRP12功能的进一步验证；未深入探究NLRP12调控糖酵解的下游具体分子通路，仍需后续实验进一步验证。未来研究可围绕上述局限性展开，通过构建动物模型验证NLRP12的体内促癌效应，并深入挖掘NLRP12调控糖酵解的分子机制，为开发靶向NLRP12或其介导的糖酵解途径的前列腺癌治疗策略提供更充分的理论依据。

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基金资助

重庆自然科学基金资助项目(cstc2021jcyj-msxmX)

重庆自然科学基金资助项目(0432)

重庆市沙坪坝区科卫联合项目重点资助项目(2024SQKWLHZD006)