缺氧条件下24-羟基胆固醇蓄积促进神经元衰老的机制研究

Mechanistic study on the promotion of neuronal senescence by 24-Hydroxycholesterol accumulation under hypoxic conditions

摘要

目的 探讨缺氧对脑内胆固醇代谢稳态及神经元衰老的影响。 方法 8~12周龄的C57BL/6野生型雄性小鼠随机分为常氧（Normoxia）组和缺氧（Hypoxia）组；以缺氧处理小鼠海马神经元HT22细胞并分为对照（Control）组和缺氧（Hypoxia）组；以10 μmol/L剂量的24-羟基胆固醇（24S-Hydroxycholesterol，24S-OHC）处理HT22细胞并分为Control组和24S-OHC组。苏木精-伊红染色（hematoxylin-ensin，HE）和尼氏（nissl）染色观察脑组织结构；酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清、脑组织和细胞24S-OHC水平；微量法检测脑组织和细胞总胆固醇（total cholesterol，TC）与甘油三酯（triglyceride，TG）水平；蛋白质免疫印迹（western blot，WB）法检测脑组织和细胞胆固醇代谢相关酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）、细胞色素P450家族46亚家族A成员1（cytochrome P450 family 46 subfamily A member 1，CYP46A1）、衰老相关蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A/p16）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A/p21）、磷酸化组蛋白（phospho-H2AX，γH2AX）和脂质合成相关分子抗硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-Coenzyme A desaturase 1，SCD1）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）、固醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP1c）的表达水平；免疫组织化学染色检测脑内CYP46A1和γH2AX的表达；检测各组小鼠大脑组织中基因表达谱，筛选目标差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），对DEGs进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析；衰老相关β半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）染色评估细胞衰老情况；BODIPY染色观察细胞脂滴蓄积情况。 结果 与常氧组比较，缺氧组脑湿重差异无统计学意义（P=0.573）；Nissl染色显示存活神经元数目减少；血清24S-OHC水平升高，脑内24S-OHC和TG含量增多，TC含量减少（均P<0.05）；胆固醇合成酶HMGCR表达降低，胆固醇分解酶CYP46A1表达升高，p16、p21和γH2AX表达增加（均P<0.05）；转录组学结果显示，在GO分析中炎症通路与脂质相关通路富集，在KEGG分析中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路和肿瘤蛋白p53（tumor protein 53，p53）信号通路等与衰老相关通路富集。缺氧处理HT22细胞实验中，与Control组相比，Hypoxia组细胞内TC含量减少，24S-OHC含量增多（均P<0.05）；HMGCR表达降低，CYP46A1表达升高，p16、p21、γH2AX表达增加（均P<0.05）；SA-β-gal阳性细胞明显增多。24S-OHC处理HT22细胞实验中，与Control组相比，24S-OHC组细胞内TC和TG含量均增多（均P<0.05）；细胞内脂滴含量明显增多（P<0.05）；HMGCR和CYP46A1表达降低，SCD1、FASN和SREBP1c表达升高，p16、p21和γH2AX表达升高（均P<0.05）。 结论 慢性缺氧通过下调HMGCR和上调CYP46A1表达，诱导24S-OHC异常蓄积并触发SREBP1c/SCD1信号通路介导的脂毒性衰老。

Abstract

Objective This study aims to investigate the impact of hypoxia on cholesterol metabolic homeostasis in the brain and its effects on neuronal senescence. Methods C57BL/6 wild-type male mice aged 8 to 12 weeks were randomly divided into normoxia （Normoxia） group and hypoxia（Hypoxia） group； HT22 cells of mouse hippocampal neurons treated with hypoxia were divided into control （Control） group and hypoxia（Hypoxia） group；HT22 cells treated with 10 μmol/L 24-hydroxycholesterol（24S-OHC） were divided into Control group and 24S-OHC group. Brain tissue structure was observed by HE and Nissl staining； serum，brain and cellular 24S-OHC levels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）； total cholesterol（TC） and triglyceride（TG） levels in brain and cells were measured by microassay； expression levels of cholesterol metabolism-related enzymes HMGCR，CYP46A1，senescence-associated proteins p16，p21，γH2AX and lipid synthesis-related molecules SCD1，FASN，SREBP1c in brain tissues and cells were detected by Western blot； expression of CYP46A1 and γH2AX in brain was examined by immunohistochemical staining； gene expression profiles in brain tissues of each group of mice were detected，target differentially expressed genes（DEGs） were screened，and GO and KEGG analyses were performed on DEGs；cellular senescence was evaluated by senescence-associated β-galactosidase（SA-β-Gal） staining； cellular lipid droplet accumulation was observed by BODIPY staining. Results Compared to the normoxia group，the hypoxia group showed no statistically significant difference in brain wet weight（P=0.573）. Nissl staining demonstrated a reduction in surviving neuron numbers in the hypoxia group. Serum 24S-OHC levels were elevated，while cerebral 24S-OHC and triglyceride（TG） content increased，and total cholesterol（TC） content decreased in the hypoxia group（all P<0.05）. The hypoxia group displayed reduced expression of cholesterol synthase HMGCR，increased expression of cholesterol catabolizing enzyme CYP46A1，and upregulated senescence markers p16，p21，and γH2AX（all P<0.05）. Transcriptomic analysis revealed enriched inflammatory pathways and lipid-related pathways via GO analysis in the hypoxia group，while KEGG analysis highlighted significant enrichment in aging-associated pathways such as the PI3K-Akt and p53 signaling pathways. Hypoxia-treated HT22 cells exhibited reduced TC，increased 24S-OHC（all P<0.05），downregulated HMGCR，upregulated CYP46A1（all P<0.05），elevated p16，p21，and γH2AX （all P<0.05），and more SA-β-Gal-positive cells. 24S-OHC-treated cells displayed increased TC and TG（all P<0.05），lipid droplet accumulation（P<0.05），reduced HMGCR and CYP46A1，upregulated SCD1，FASN，and SREBP1c，and elevated p16，p21，and γH2AX （all P<0.05）. Conclusion Chronic hypoxia induces abnormal 24S-OHC accumulation and triggers SREBP1c/SCD1-mediated lipotoxic senescence by downregulating HMGCR and upregulating CYP46A1 expression.

Graphical abstract

关键词

缺氧 / 胆固醇代谢 / 24-羟基胆固醇 / 神经元 / 衰老

Key words

hypoxia / cholesterol metabolism / 24S-Hydroxycholesterol / neurons / senescence

慢性缺氧作为脑血管疾病、高原脑病等病理状态的核心病理生理过程，可通过诱导能量代谢紊乱、氧化应激及兴奋性毒性等机制导致神经元损伤，进而引发认知功能障碍等临床症状^[1]。大脑作为全身耗氧量最高的器官，其功能维持高度依赖持续的能量供应与精细的代谢调控^[2]。近年来研究表明，缺氧不仅影响糖酵解和三羧酸循环等经典代谢通路^[3]，更通过重塑氨基酸代谢谱发挥神经保护作用^[4]。因此，了解缺氧后大脑的病理生理变化和代谢改变，对改善缺氧导致的神经功能损伤至关重要。

脑胆固醇稳态对维持大脑正常生理功能尤其重要。胆固醇主要通过3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）和固醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP1c）调控合成，但由于其不能够通过血脑屏障，需要在神经元中通过细胞色素P450家族46亚家族A成员1（cytochrome P450 family 46 subfamily A member 1，CYP46A1）酶羟化为24-羟基胆固醇（24S-Hydroxycholesterol，24S-OHC）才能排出大脑^[5]。临床研究表明，胆固醇代谢紊乱与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等神经退行性疾病密切相关^[6]。值得注意的是，作为脑内胆固醇代谢的主要终产物^[7]，24S-OHC不仅是肝脏X受体（liver X receptors，LXRs）的高效激动剂^[8]，在调节胆固醇代谢和神经元功能中起关键作用，更能通过影响辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞（T-helper 17/regulatory T lymphocyte，Th17/Treg）平衡和相关免疫反应来影响大脑损伤以及学习和记忆功能^[9]。最新研究证实AD患者脑脊液24S-OHC水平异常升高，提示其可能作为神经退行性变的生物标志物^[10-11]。缺氧能够引起神经退行性变，然而缺氧会对脑胆固醇稳态产生怎样的影响尚不清楚，有待进一步研究。

细胞衰老是一种增殖细胞停止分裂并永久性退出细胞周期的过程，通常伴有磷酸化组蛋白（phospho-H2AX，γH2AX）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A/p21）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A/p16）等蛋白的异常升高以及肿瘤蛋白p53（tumor protein 53，p53）信号通路的异常激活^[12]。此外，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路与衰老之间也存在联系，如基因组不稳定性、端粒损耗和表观遗传变化等衰老变化^[13]。近年研究发现，24S-OHC能够诱导线粒体功能障碍，这一特性在调控氧化还原稳态、炎症状态以及诱导细胞死亡等方面发挥着极为关键的作用^[14]。这提示胆固醇代谢重新编程与细胞衰老存在潜在交互网络，但缺氧如何通过调控胆固醇代谢轴驱动脑衰老的分子机制仍有待揭示。

本研究旨在探讨缺氧后脑内胆固醇代谢的变化以及其引起神经元衰老的机制，揭示缺氧后胆固醇代谢重编程与神经元之间的关联，为缺氧性脑损伤的生理病理机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物

8~12周龄的C57BL/6野生型雄性小鼠40只购自空军军医大学动物中心，饲养于SPF清洁级动物房，室内温度22~26 ℃，湿度为50%~60%。光照周期为12 h/12 h明暗交替（照明时间8:00至20:00），实验期间保证饲料和饮水充足。所有动物实验符合动物伦理委员会的实验动物伦理学标准（动物伦理批号：IACUC-20230049）。

1.1.2 细胞

HT22小鼠海马神经元细胞（Boster公司，货号：CX0146）。

1.1.3 主要试剂与仪器

β-actin、HMGCR、p21和p16抗体（ABclonal公司，货号：AC038，A19063，A19094，A0262）；CYP46A1抗体（Proteintech公司，货号：12486-1-AP）；硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-Coenzyme A desaturase 1，SCD1）和脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）抗体（美国Cell Signaling Technology公司，货号：C12H5，C20G5）；SREBP1c抗体（Novus公司，货号：NB600-582）；γH2AX抗体（Bioss公司，货号：bs-3185R）；抗兔和鼠二抗（英国Abcam公司，货号：ab6721，ab6892）；细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）染色试剂盒（北京碧云天生物技术公司，货号：C0602）；24S-羟基胆固醇酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（无锡天萃生物科技有限公司）；细胞总胆固醇（total cholesterol，TC）与甘油三酯（triglyceride，TG）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：BC1985，BC0625）；超敏增强型化学发光液（陕西普罗安蒂生物科技发展有限公司，货号：10144-2）；总RNA提取试剂（total RNA extractor，Trizol）裂解液，BODIPY 493/503染液和Hoechst染液（美国Thermo公司，货号：15596018CN，D3922，H3569）；放射免疫沉淀法缓冲液（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）（北京碧云天生物技术公司，货号：P0013B）；荧光显微镜（日本Olympus公司，型号：IX83）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及造模

动物实验分组及造模：将小鼠随机分为2组（每组n=20）：常氧（Normoxia）组、缺氧（Hypoxia）组。其中Normoxia组小鼠置于常规氧气浓度下饲养，Hypoxia组小鼠置于低氧箱[维持（8.0±0.5）%氧含量的状态]中进行缺氧暴露14 d。细胞实验分组及造模：将HT22细胞培养于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%青霉素/链霉素双抗的杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）中，置于5% CO₂，37 ℃细胞培养箱中进行常规培养。①正常对照（Control）组常规培养；②缺氧实验（Hypoxia）组置于通有混合气体（5% CO₂，94% N₂，1% O₂）的缺氧培养箱中培养24 h；③给药24S-OHC实验（24S-OHC）组：常规培养条件下，往培养液中加入终浓度为10 μmol/L的24S-OHC培养24 h。

1.2.2 脑大体湿重

取5对小鼠麻醉后，迅速取脑组织并用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，吸水纸吸水后放置于天平上称重，记录各组全脑质量，之后液氮速冻，用于后续实验。

1.2.3 组织学分析

取3对小鼠麻醉后，仰卧位固定于解剖板，75%乙醇消毒胸腹部，剪开皮肤并暴露心脏，左心室插入灌流针头，剪开右心耳，缓慢推注预冷PBS，当肝脏变白后切换至4%多聚甲醛灌注，直至动物四肢强直，迅速取全脑后放入4%多聚甲醛溶液中固定，脱水后石蜡包埋，切成5 μm切片，用于形态学观察。按照染色方案对全脑冠状面进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin，HE）和尼氏（Nissl）染色，在显微镜下观察海马区以及大脑皮层。

1.2.4 血清、脑组织和细胞24S-OHC含量检测

血清样品处理：收集小鼠全血标本于1.5 mL EP管中，室温放置1 h，然后3 000 r/min离心15 min，取上清待测。脑组织样品处理：取出6对小鼠同侧半脑组织，经预冷PBS（pH 7.4）冲洗后，按照组织质量（g）∶PBS体积（mL）为1∶10的比例进行冰浴匀浆，5 000 g，4 ℃离心10 min，取上清检测。细胞样品处理：用冷的PBS轻轻清洗细胞，然后用胰蛋白酶消化，800 r/min离心3 min后收集细胞，再次用冷的PBS 洗涤3次，按照每1×10⁶个细胞中加入200 μL PBS重悬并冰浴超声使细胞破碎，1 500 g，4 ℃离心10 min，取上清检测。按照24S-OHC酶联免疫吸附测定试剂盒说明书对得到的待测样检测24S-OHC含量，酶标仪450 nm处测定吸光度，血清24S-OHC含量以ng/mL表示，脑组织24S-OHC含量以ng/g脑组织表示，细胞24S-OHC含量以各组归一化数值表示。

1.2.5 TC含量检测

组织样品制备：取出6对小鼠同侧半脑组织，按组织质量（g）与提取液体积（mL）1∶10的比例加入异丙醇混合提取液，冰浴条件下匀浆处理，10 000 g，4 ℃离心10 min，取上清置冰上待测。细胞样品制备：常规分组处理细胞，收集细胞到离心管内，离心弃上清，加1 mL异丙醇，冰浴超声破碎细胞，10 000 g，4 ℃离心10 min，取上清置冰上待测。按照TC含量检测试剂盒说明书对得到的待测样检测胆固醇含量，酶标仪420 nm处测定吸光度，脑组织胆固醇含量以mg/g脑组织表示，细胞胆固醇含量以各组归一化数值表示。

1.2.6 TG含量检测

取出6对小鼠同侧半脑组织，按照组织质量（g），与提取液体积（mL）1∶10的比例加入正庚烷-异丙醇（1∶1，V/V）混合提取液，于冰浴条件下匀浆，8 000 g，4 ℃离心10 min，取上清待测。按照TG含量检测试剂盒说明书检测小鼠脑组织甘油三酯含量，酶标仪420 nm处测定吸光度（absorbance，A）值，脑组织甘油三酯含量以mg/g脑组织表示，细胞甘油三酯含量以各组归一化数值表示。

1.2.7 蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测脑组织和HT22的蛋白表达水平

将细胞接种到6孔板中，接种密度3×10⁵个/孔，待细胞贴壁后缺氧处理24 h或加药处理24 h，用RIPA裂解液（含PMSF及磷酸酶抑制剂）在冰上裂解细胞30 min，离心（4 ℃，12 000 r/min，15 min）后收集上清，吸取2 μL使用BCA法定量，剩余上清加入1/4体积的5×Loading缓冲液，95 ℃煮样10 min。组织样品制备：取出2对小鼠，处死后迅速取同侧半脑，去除小脑和嗅球，液氮速冻，加入RIPA裂解液,于冰上用Polytron组织匀浆机进行匀浆，匀浆完成后，使用移液器混匀，并分装到2 mL EP管中，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。收集上清于1.5 mL EP管中，并取出20~50 μL，用于蛋白定量，其余蛋白立即加入1/5体积的5×Loading缓冲液，混匀后于95 ℃煮样10 min。得到的细胞和组织样品依次进行电泳，转膜，封闭,４ ℃孵育一抗（β-actin，1∶10 000；HMGCR，1∶1 000；CYP46A1，1∶1 000；γH2AX，1∶1 000；p16，1∶2 000；p21，1∶2 000；SCD1，1∶1 000；FASN，1∶1 000；SREBP1c，1∶1 000）过夜，次日用含吐温-20的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline with Tween，PBST）洗涤3遍后加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，ECL成像系统显色拍照。采用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析。

1.2.8 免疫组织化学染色

小鼠心脏灌流固定后取全脑，放入4%多聚甲醛溶液中固定，样本脱水后石蜡包埋，65 ℃烤片，二甲苯和梯度乙醇脱蜡，PBS洗 3 次后用柠檬酸盐缓冲液（PH=6.0）进行抗原修复，PBS洗去缓冲液，0.2% Triton X-100孵育10 min透化组织，3%过氧化氢孵育10 min以清除内源性过氧化物酶，即用型山羊血清封闭40 min，甩去封闭液，加入CYP46A1抗体（1∶200）和γH2AX抗体（1∶250）于湿盒内4 ℃孵育过夜。第2天取出后复温，PBS洗3次后加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗，37 ℃孵育40 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，之后苏木素染色2 min后分化（1%盐酸乙醇），自来水清洗返蓝，梯度乙醇及二甲苯中脱水后，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。采用Image J软件计算积分光密度（integrated optical density，IOD）和有效目标分布区域的面积（area），计算平均光密度（mean density），计算公式：平均光密度=积分光密度值 / 测量区域面积。

1.2.9 RNA-seq测序及分析

取出3对小鼠，处死后迅速取全脑，去除小脑和嗅球，迅速放入液氮中速冻，随后转移至-80 ℃冰箱。总RNA提取、样品的纯化、量化、cDNA文库构建、高通量测序交由诺禾致源科技股份有限公司完成，获得各组脑组织的全基因表达谱。原始测序数据经过数据质量控制和清洗后，使用生物信息学软件HISAT2进行比对，采用Htseq-count进行表达量定量。最后，利用DESeq软件包（Padj<0.05且|log2Fold Change|>1）鉴定差异表达基因，差异表达基因的功能注释和富集分析通过使用基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）路径分析来完成。

1.2.10 SA-β-gal染色检测细胞衰老状态

在12孔板中预先加入灭菌的盖玻片，以每孔1×10⁵个接种细胞于12孔板。次日早上细胞贴壁后，分别进行常氧与缺氧处理，继续培养24 h。吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入500 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min。吸除PBS，按照试剂盒说明书配制染色工作液，每孔加入500 μL工作液，37 ℃孵育过夜，普通光学显微镜下观察。

1.2.11 BODIPY染色

在12孔板中预先加入灭菌的盖玻片，以每孔1×10⁵个细胞接种于12孔板。次日早上细胞贴壁后，实验组加入终浓度为10 μmol/L的24S-OHC，对照组不进行任何处理，继续培养24 h。吸出培养液，使用复温后的PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min。PBS再次清洗3遍后，往每孔加入BODIPY 493/503荧光染料至浓度为1 μg/mL（使用PBS稀释），室温避光染色20 min。使用PBS清洗3次，每次5 min，每孔加入终浓度为1 μg/mL的Hoechst 33258染液，室温避光孵育2 min。PBS清洗3次，每次5 min，防淬灭荧光封片剂封片后置于荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法

实验数据采用GraphPad Prism 9.5软件进行分析及绘图。计量资料以均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示，所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验，2组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 缺氧导致小鼠脑内胆固醇代谢稳态异常

脑组织病理学评估显示，常氧组和缺氧组两组小鼠之间脑湿重差异无统计学意义（P=0.573）（图1A），但Nissl染色结果显示，相比常氧组，缺氧组海马区局灶神经元数目减少、固缩和排列紊乱，大脑皮层部分神经元表现为体积减小，染色变深，数目减少且排列变紊乱（图1B、C），提示本研究建立的缺氧模型造成了明显结构性损伤，说明缺氧性脑损伤模型构建成功。通过ELISA定量检测分析发现，缺氧组血清24S-OHC含量明显升高（P<0.001）（图1D）。考虑到24S-OHC主要由脑产生，进一步检测了脑内24S-OHC的含量，发现其脑内含量也明显升高（P=0.003）（图1D）。24S-OHC是胆固醇代谢产物，为此检测了全脑胆固醇和甘油三酯含量，发现相较常氧组，缺氧组胆固醇含量降低（P=0.017），甘油三酯含量升高（P=0.011）（图1E）。Western blot结果表明，较常氧组，缺氧组胆固醇合成关键酶HMGCR表达水平明显下降（P<0.001），而胆固醇外排关键酶CYP46A1表达水平明显升高（P=0.015）（图1F~G）。以上结果提示缺氧处理小鼠14 d后，小鼠脑内胆固醇含量降低，羟化代谢增强。

2.2 缺氧引起小鼠脑组织衰老加速

为系统阐释缺氧诱导脑衰老的分子调控网络，本研究采用RNAseq技术对缺氧组与常氧组小鼠大脑组织进行全转录组测序（每组n=3）。差异表达基因通路分析结果（图2A、B）显示：缺氧导致小鼠脑组织中脂质代谢异常，神经炎症激活；并且衰老相关通路PI3K-Akt和p53信号通路富集，提示缺氧可能加速了小鼠脑组织的衰老。Western blot技术检测衰老相关蛋白的表达水平（图2C），相较常氧组，缺氧组细胞周期阻滞蛋白p16（P=0.003）和p21（P=0.004）蛋白表达升高；细胞衰老标志物γH2AX显著升高（P=0.021），免疫组化（CA1：P=0.031；CA3：P=0.099；大脑皮层：P=0.014）也证实了这一结果（图2D）。以上结果提示缺氧可以加速小鼠脑组织衰老。

2.3 缺氧引起海马神经元细胞胆固醇代谢异常、加速衰老

为了进一步验证缺氧对神经元细胞的作用，本课题组运用小鼠海马神经元细胞系HT22，构建了细胞缺氧模型：采用三气培养箱建立体外缺氧模型（1% O₂、5% CO₂、94% N₂），持续干预24 h。通过试剂盒定量检测发现小鼠海马神经元细胞总胆固醇含量明显降低（P<0.001），24S-OHC水平明显升高（P<0.001）（图3A）；Western blot结果显示，较对照组，缺氧组胆固醇代谢关键酶表达明显改变，胆固醇合成限速酶HMGCR表达水平明显下降（P=0.005），胆固醇羟化酶CYP46A1表达水平明显升高（P<0.001）（图3B）；β-gal阳性细胞比例增加（P<0.001）（图3C），细胞周期抑制蛋白p16（P=0.003）和p21（P<0.001）表达增加，DNA损伤标志物γH2AX表达水平也明显升高（P=0.035）（图3D）。以上结果提示缺氧可以引起小鼠海马神经元胆固醇合成减少、24S-OHC合成增加，加速细胞衰老。

2.4 外源性24S-OHC通过诱导神经元脂质蓄积导致衰老

为深入探索24S-OHC在缺氧诱导衰老中的核心调控机制，本研究采用外源性干预策略，以小鼠海马神经元细胞系HT22为模型，通过添加10 μmol/L 24S-OHC持续处理24 h，探究其对神经元胆固醇稳态及衰老表型的特异性影响。通过比色法定量分析检测试剂盒测量HT22细胞内的TC和TG，结果显示，相比对照组，24S-OHC组TC（P=0.029）和TG（P<0.001）含量增多（图4A）；BODIPY染色结果提示细胞内脂滴明显增多（P<0.001）（图4B）；Western blot结果显示，HMGCR（P<0.001）和CYP46A1（P=0.003）表达水平明显下降（图4C），脂质合成关键分子SCD1（P=0.008）、FASN（P=0.020）和活性SREBP1c（P=0.011）表达水平均明显升高（图4D），衰老相关分子细胞周期抑制蛋白p16（P<0.001）和p21（P=0.002）表达水平明显升高，DNA损伤标志物γH2AX（P=0.006）表达水平也明显升高（图4E）。以上结果提示缺氧通过增加24S-OHC合成，引起小鼠海马神经元脂质合成增多，促进细胞衰老。

3 讨论

大脑是机体器官中对缺氧敏感以及耗氧量较高的器官，重量仅占总质量的2%左右，但是耗氧量占总耗氧量的23%^[2]。大脑能够敏感地感知氧含量的变化，长期慢性低氧也会对大脑结构及功能产生影响^[15]。本研究中，缺氧后小鼠全脑湿重未发生明显的改变，但在组织学水平上发现了大量神经元的丢失，提示缺氧对脑产生的影响是一个慢性的过程，如不及时干预会对患者的神经功能和生活质量产生严重的影响。因此，了解缺氧后代谢的变化有助于认识到早期缺氧对脑产生的影响，为后续缺氧性脑损伤进一步进展的控制提供一定的理论支撑。

胆固醇是构成生物膜的重要组成部分，与膜结构和功能有关。大脑中的胆固醇含量极其丰富，大约25%的胆固醇位于大脑中，参与中枢神经系统的成熟，并参与信号转导、神经递质释放、突触发生和膜运输^[16]。脑胆固醇的不足会损害记忆形成，而过度积累不仅会阻碍突触可塑性，还会引发神经元凋亡。因此，维持脑胆固醇稳态对于确保适当的神经元功能和促进健康的大脑发育至关重要^[5]。本研究发现缺氧后脑内胆固醇代谢稳态发生了明显的变化，胆固醇代谢产物24S-OHC在血清和脑中均有升高，以及代谢酶CYP46A1表达的升高，提示脑内的胆固醇代谢加强；并且胆固醇和胆固醇合成酶HMGCR表达的减少，说明缺氧引起了脑内胆固醇的丢失。

细胞衰老可被多种细胞应激诱发，如DNA损伤、癌基因激活、氧化应激或外源性毒物暴露等，具有典型的细胞周期停滞、衰老相关分泌表型、大分子损伤及代谢紊乱4个特征^[12]。缺氧与衰老之间存在明显的关联，相关研究报道了脑缺氧会导致神经炎症^[17]、氧化应激^[18]和线粒体功能障碍^[19]。本研究表明，小鼠缺氧后产生了神经炎症，GO富集分析提示细胞迁移和脂质代谢变化，KEGG富集分析显示PI3K-AKT和p53通路的改变，这些结果均提示缺氧后细胞发生了衰老。为了进一步验证该观点，对衰老相关蛋白进行了检测，结果发现细胞周期调控蛋白p16和p21与DNA损伤修复相关蛋白γH2AX明显升高，与前期结果一致。胆固醇代谢与衰老之间存在关联，相关研究报道了胆固醇能够通过调节衰老相关炎症在衰老过程中发挥作用，提出衰老细胞在溶酶体中积累胆固醇以维持衰老相关分泌表型^[20]。而在本研究中发现缺氧能够引起胆固醇代谢产物24S-OHC的异常升高，是否与衰老相关尚不清楚，值得进一步的探究。

神经元是大脑中一种非常重要的神经细胞，与胆固醇代谢密切相关。神经元是胆固醇代谢酶CYP46A1的主要表达细胞，通过将胆固醇代谢为24S-OHC消除脑内蓄积的胆固醇，是维持脑内胆固醇稳态的重要神经细胞^[21]。前面研究发现小鼠缺氧处理诱导胆固醇代谢产物24S-OHC在脑内异常升高，为此对海马神经元细胞进行缺氧处理，发现细胞内的胆固醇丢失及24S-OHC的升高，并伴有胆固醇合成酶的降低和代谢酶的升高，提示缺氧引起了神经元胆固醇代谢的紊乱。进一步探究了缺氧与神经衰老之间的关系，发现细胞周期调控蛋白p16和p21与DNA损伤修复相关蛋白γH2AX升高，提示缺氧引起了神经元的衰老，β-半乳糖苷酶的细胞染色结果也证实了这一点。结合以上结果，缺氧引起了神经元中24S-OHC的异常升高与衰老，但24S-OHC与细胞衰老之间是否有联系尚不清楚。

24S-OHC主要由脑产生，部分研究认为可以将其作为脑损伤的一种标志物^[22]。胆固醇的稳态与神经系统高级功能学习记忆密切相关，更多相关研究认为24S-OHC与阿尔茨海默病有关，但存在一定的争议^[10]。另外有研究发现24S-OHC通过坏死性凋亡（一种程序性坏死）诱导神经元细胞死亡^[23]。本研究用24S-OHC处理神经元后，发现引起了胆固醇代谢的紊乱，可能与其对神经元的负反馈调节有关。羟固醇对代谢调节至关重要，具有治疗潜力，有文献报道了肝脏中白细胞介素22受体亚基α1（interleukin 22 receptor subunit alpha 1，IL22RA1）的缺失能通过调节羟固醇代谢从而促进肝脏脂肪变性^[24]，说明24S-OHC可能与脂质代谢有关联。通过检测脂质合成关键酶的表达，发现SREBP1c/SCD1介导的脂质合成通路上调，并且发现24S-OHC能够引起神经元细胞的脂滴蓄积，造成了严重的脂毒性应激，会对细胞造成严重的损害，24S-OHC组衰老相关标志蛋白p16、p21和γH2AX的升高验证了这一点。这些结果证实了24S-OHC的异常增多，会通过激活SREBP1c/SCD1通路，引起神经元脂质异常增多，从而造成神经元的衰老。

综上所述，慢性缺氧通过下调HMGCR和上调CYP46A1，造成24S-OHC异常蓄积，触发SREBP1c/SCD1介导的脂毒性以及衰老标志物p16、p21和γH2AX的升高，引起神经元的衰老，揭示了缺氧引起神经元衰老的一种新机制，靶向胆固醇代谢-衰老交互网络可为缺氧相关神经退行性疾病提供精准治疗策略。

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基金资助

陕西省科技计划资助项目(2024SF-YBXM-210)