SLC31A1通过调控线粒体自噬抑制铜死亡减轻氧糖剥夺诱导的PC12细胞损伤

Solute carrier family 31 member 1 alleviates oxygen-glucose deprivation-induced PC12 cell injury by regulating mitophagy and inhibiting cuproptosis

摘要

目的 探究溶质载体家族31成员1（solute carrier family 31 member 1，SLC31A1）通过调控线粒体自噬对氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）诱导的PC12细胞铜死亡及细胞损伤的影响，明确其在脑卒中病理过程中的作用机制。 方法 以PC12细胞为研究对象，构建OGD诱导的脑卒中细胞模型，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8 assay，CCK-8）法、乳酸脱氢酶释放法（lactate dehydrogenase release assay，LDH）验证模型有效性；构建SLC31A1沉默（si-SLC31A1）与过表达（pcDNA3.1-SLC31A1）细胞模型，通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、蛋白质免疫印迹法（Western blot，WB）验证干预效率；分别采用RT-PCR、WB、比色法、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测线粒体自噬相关指标［自噬相关蛋白（autophagy-related protein，ATG）5、ATG12、Parkin、PTEN诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）、微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、P62］、铜死亡相关指标［细胞内铜离子浓度、氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽（oxidized glutathione/reduced glutathione，GSSG/GSH）比值、脂酰辅酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）、二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）表达］及氧化应激指标［超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量］。 结果 OGD处理降低PC12细胞活力，升高LDH释放率（P<0.05），表明模型构建成功；SLC31A1过表达上调线粒体自噬相关基因（ATG5、ATG12、Parkin、PINK1）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，下调P62表达（P<0.05），沉默SLC31A1则呈相反趋势；SLC31A1过表达降低细胞内铜离子浓度、GSSG/GSH比值（P<0.05）；ACSL4、DLD蛋白表达呈下降趋势，但差异无统计学意义，同时提升SOD活性，降低MDA含量（P<0.05），沉默SLC31A1则加剧铜死亡与氧化应激（P<0.05）。 结论 SLC31A1可通过激活线粒体自噬，减少细胞内游离铜离子积累，抑制铜死亡进程，同时改善氧化应激损伤，最终减轻OGD诱导的PC12细胞损伤，为缺血性脑卒中的机制研究及治疗靶点开发提供实验依据。

Abstract

Objective To investigate the effect of solute carrier family 31 member 1（SLC31A1） on cuproptosis and injury of PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation（OGD） by regulating mitophagy，and to clarify its mechanism of action in the pathological process of stroke. Methods PC12 cells were used to construct a cell model of OGD-induced stroke，and CCK-8 assay and lactate dehydrogenase（LDH） release assay were used to verify model effectiveness. The cell models of SLC31A1 silencing（si-SLC31A1） and overexpression （pcDNA3.1-SLC31A1） were constructed，and RT-PCR and Western blot（WB） were used to verify intervention efficiency； RT-PCR，WB，colorimetry，and ELISA were used to measure mitophagy-related indicators［autophagy-related protein 5（ATG5），autophagy-related protein 12（ATG12），Parkin，PTEN-induced putative kinase 1（PINK1），microtubule-associated protein light chain 3B（LC3B），and P62］，cuproptosis-related indicators［intracellular copper ions，oxidized glutathione（GSSG）/reduced glutathione（GSH） ratio，acyl-CoA synthetase long-chain family member 4（ACSL4），and dihydrolipoamide dehydrogenase（DLD）］，and oxidative stress indicators［superoxide dismutase（SOD） and malondialdehyde（MDA）］. Results OGD treatment significantly reduced the viability of PC12 cells and increased LDH release rate（P<0.05），suggesting that the model was constructed successfully. Overexpression of SLC31A1 upregulated the mRNA expression levels of mitophagy-related genes（ATG5，ATG12，Parkin，and PINK1） and the LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio， and downregulated P62 expression（P<0.05），while silencing of SLC31A1 showed the opposite trend. Overexpression of SLC31A1 significantly reduced the concentration of copper ions and GSSG/GSH ratio（P<0.05），whereas ACSL4 and DLD protein levels showed a decreasing trend without statistical significance. SLC31A1 overexpression also increased SOD activity and reduced MDA content（P<0.05）；silencing of SLC31A1 exacerbated cuproptosis and oxidative stress（P<0.05）. Conclusion SLC31A1 can alleviate OGD-induced PC12 cell injury by activating mitophagy，reducing the accumulation of free copper ions，inhibiting cuproptosis，and improving oxidative stress injury，which provides an experimental basis for research on the mechanism of ischemic stroke and the development of therapeutic targets.

Graphical abstract

关键词

溶质载体家族31成员 1 / 线粒体自噬 / 铜死亡 / 氧糖剥夺 / PC12细胞 / 缺血性脑卒中

Key words

solute carrier family 31 member 1 / mitophagy / cuproptosis / oxygen-glucose deprivation / PC12 cells / ischemic stroke

缺血性脑卒中占脑卒中总发病率的70%以上^[1-2]，其高致残率与高复发率给社会和家庭带来沉重负担，临床核心治疗手段重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）静脉溶栓受限于狭窄的治疗时间窗和出血风险，仅少数患者获益^[3-5]。缺血缺氧微环境可直接诱发线粒体功能紊乱，促使受损线粒体释放活性氧（reactive oxygen species，ROS）和游离铜离子，一方面引发氧化应激，另一方面导致细胞内铜离子异常积累，进而激活脂酰辅酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）介导的铜死亡，最终加剧神经细胞死亡，这一病理链条已成为脑卒中损伤的关键机制^[3-4]。铜死亡依赖细胞内铜离子异常积累、谷胱甘肽（oxidized glutathione/reduced glutathione，GSSG/GSH）抗氧化系统耗竭及ACSL4介导的脂质过氧化^[6-7]，推测其可能参与脑卒中神经细胞损伤；而线粒体自噬可通过Parkin/PTEN诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）通路清除受损线粒体^[8-9]，进而减少ROS和线粒体来源铜离子的释放，发挥神经保护作用，但二者调控关系尚未明确。溶质载体家族31成员1（solute carrier family 31 member 1，SLC31A1）[铜转运蛋白1（copper transporter 1，CTR1）]作为介导细胞铜离子跨膜摄取与转运的关键蛋白，其功能研究目前集中于铜代谢异常相关疾病^[10]，在脑卒中中的作用及机制尚未见报道。基于此，本研究推测SLC31A1可能通过调控线粒体自噬影响铜死亡，参与神经细胞损伤的调控。

PC12细胞具有神经元样表型，对缺血缺氧的应激反应与神经细胞高度相似，且培养稳定性高、实验重复性好，是脑卒中研究中常用的经典细胞系^[11-12]。因此，本研究以PC12细胞为神经细胞模型，构建氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）诱导的脑卒中细胞模型，通过SLC31A1沉默与过表达干预，结合分子生物学检测技术，检测线粒体自噬、铜死亡及氧化应激相关指标，明确SLC31A1对OGD诱导的细胞损伤的调控效应及相关作用机制，为缺血性脑卒中的机制研究及潜在治疗靶点开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

永生化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞（购自中国科学院上海细胞库，编号：SCSP-504）。

1.1.2 主要试剂

细胞培养试剂：高糖杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）（Gibco，货号11965-092）、低糖DMEM培养基（Gibco，货号11885-084）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gibco，货号10099-141）、青霉素-链霉素双抗（Gibco，货号15140-122）；OGD模型相关试剂：厌氧培养袋（Thermo Scientific，货号260101）；转染试剂：Lipofectamine 3000（Invitrogen，货号L3000015）、小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）及质粒；SLC31A1小干扰RNA（si-SLC31A1）、阴性对照siRNA（si-NC）、pcDNA3.1-SLC31A1过表达质粒及空载体pcDNA3.1（均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，si-SLC31A1靶序列：5'-GCAATGTCAGAGTACCTCA-3'）；检测试剂盒：细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8 assay，CCK-8）细胞活力检测试剂盒（碧云天，货号C0037）、乳酸脱氢酶释放法（lactate dehydrogenase release assay，LDH）细胞毒性检测试剂盒（碧云天，货号C0016）、总RNA提取试剂盒（TaKaRa，货号9767）、逆转录试剂盒（TaKaRa，货号RR047A）、SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa，货号RR820A）、放射免疫沉淀分析（radioimmunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA）蛋白裂解液（碧云天，货号P0013B）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（碧云天，货号P0010）、细胞内铜离子检测试剂盒（Solarbio，货号BC4410）、GSSG/GSH检测试剂盒（Solarbio，货号BC1170）、ACSL4酶联免疫吸附测定试剂盒（enzyme-linked immunosorbent assay kit，ELISA）（Abcam，货号ab289883）、二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）ELISA试剂盒（Abcam，货号ab273210）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒（碧云天，货号S0101）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒（碧云天，货号S0131）；抗体：兔抗大鼠SLC31A1多克隆抗体（Abcam，货号ab180777）、兔抗大鼠自噬相关蛋白（autophagy-related protein，ATG）5多克隆抗体（CST，货号12994S）、兔抗大鼠ATG12多克隆抗体（CST，货号4180S）、兔抗大鼠Parkin多克隆抗体（CST，货号2132S）、兔抗大鼠PINK1多克隆抗体（CST，货号62325S）、兔抗大鼠微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）多克隆抗体（CST，货号2775S）、兔抗大鼠P62多克隆抗体（CST，货号5114S）、鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体（碧云天，货号AF0003）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（碧云天，货号A0208）、HRP标记山羊抗鼠IgG（碧云天，货号A0216）。

1.2 实验方法

1.2.1 PC12细胞培养与传代

PC12细胞置于含10%FBS、1%青霉素-链霉素双抗的高糖DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。当细胞融合度达80%~90%时进行传代：弃去旧培养基，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化1~2 min，待细胞变圆脱壁后，加入含血清的培养基终止消化，吹打制成单细胞悬液，按1∶3比例接种至新培养瓶，继续培养。

1.2.2 OGD脑卒中细胞模型构建与验证

参考既往研究构建模型^[11-12]：取对数生长期PC12细胞，接种于96孔板（用于活力/毒性检测）或6孔板（用于后续指标检测），待细胞融合度达70%后，弃去高糖培养基，用无糖PBS洗涤3次，更换为低糖DMEM培养基（不含葡萄糖、血清），随后将培养板放入含厌氧培养袋的密封培养盒中，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养12 h（预实验验证12 h为OGD诱导PC12细胞损伤的最佳时间点），构建缺血缺氧模型，即氧糖剥夺组（OGD组）；正常对照组（Control组）始终用高糖培养基在常氧环境中培养。

模型验证：CCK-8法检测细胞活力：OGD处理结束后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度（absorbance，A）值，细胞相对活力=（OGD组A值/Control组A值）×100%；LDH释放法检测细胞损伤：收集各组细胞培养上清液，按LDH试剂盒说明书操作，在490 nm波长处检测A值，细胞LDH释放率=（实验组A值-空白对照组A值）/（最大释放组A值-空白对照组A值）×100%。

1.2.3 SLC31A1干预体系构建与效率验证

细胞转染：取对数生长期PC12细胞，接种于6孔板，待融合度达50%~60%时进行转染。分为4组：si-NC组（转染si-NC）、si-SLC31A1组（转染si-SLC31A1）、pcDNA3.1组（转染空载体）、pcDNA3.1-SLC31A1组（转染过表达质粒）。参考质粒构建公司的推荐浓度，使用pcDNA3.1-SLC31A1过表达质粒，浓度为1 μg/μL，si-SLC31A1及si-NC的工作浓度均为50 nmol/L。按Lipofectamine 3000说明书操作：将2 μg质粒或50 nmol/L siRNA与转染试剂混合，室温孵育15 min后，加入细胞培养体系，37 ℃培养48 h后进行后续实验。

干预效率验证：逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测SLC31A1信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达：采用总RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，用紫外分光光度计检测RNA纯度（A260/A280比值为1.8~2.0）与浓度。按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），以cDNA为模板进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃终延伸5 min。采用2⁻ΔΔCt法计算SLC31A1 mRNA相对表达量。SLC31A1引物信息如下：上游引物：5'-ACAGTGCTGCACATCATCCA-3'，下游引物：5'-CATCACTGACCCAGAACCCC-3'。

蛋白质免疫印迹法（Western blot，WB）检测SLC31A1蛋白表达：收集各组细胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样本进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转印至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF），用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗（SLC31A1抗体1∶1 000稀释，β-actin抗体1∶5 000稀释），4 ℃孵育过夜，含Tween 20的Tris缓冲盐水（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）洗涤3次后，加入二抗（1∶5 000稀释），室温孵育1 h，TBST洗涤3次，增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显色，用ImageJ软件分析条带灰度值，SLC31A1蛋白相对表达量=（SLC31A1条带灰度值/β-actin条带灰度值）。

1.2.4 线粒体自噬相关基因检测

采用RT-PCR法检测线粒体自噬相关基因（ATG5、ATG12、Parkin、PINK1）mRNA表达。总RNA提取、逆转录及PCR扩增步骤同1.2.3项，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，引物信息如下：ATG5上游引物：5'-AGAAGCTGTTCCGTCCTGTG-3'，下游引物：5'-GTTTCCACTCTCCAGCCGAA-3'；ATG12上游引物：5'-AAACGTGAGCCAAGGGGATT-3'，下游引物：5'-ACGCCAGGTAAGAATGCACA-3'；Parkin上游引物：5'-ACACCAGCATCTTCCAGCTC-3'，下游引物：5'-GCAGTCTGGAGATTGGCACT-3'；PINK1上游引物：5'-GCCTTGCCAACCCCTTCTAT-3'，下游引物：5'-CTGTTTGCTGAACCCAAGGC-3'。

1.2.5 铜死亡相关指标检测

①比色法检测细胞内铜离子浓度：收集各组细胞，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液。按铜离子检测试剂盒说明书操作，在620 nm波长处检测A值，根据标准曲线计算细胞内铜离子浓度。②比色法检测GSSG/GSH比值：收集各组细胞，按GSSG/GSH试剂盒说明书提取细胞内谷胱甘肽，在412 nm波长处检测A值，计算GSSG/GSH比值（该比值反映细胞氧化还原状态，比值升高提示氧化应激增强）。③ELISA检测ACSL4、DLD蛋白浓度：收集各组细胞经裂解处理后的细胞裂解液上清，按ELISA试剂盒说明书操作，分别在450 nm波长处检测ACSL4和DLD的A值，根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.2.6 氧化应激指标检测

①比色法检测SOD活性：收集各组细胞，裂解后取上清液，按SOD试剂盒说明书操作，在560 nm波长处检测A值。②比色法检测MDA含量：收集各组细胞，裂解后取上清液，按MDA试剂盒说明书操作，在532 nm波长处检测A值，根据标准曲线计算MDA含量。

1.3 统计学方法

所有实验均独立重复3次。采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析与统计图绘制，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用非配对t检验，多组间比较根据实验设计分别采用单因素或双因素方差分析，且所有方差分析后均采用Tukey’s多重比较检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PC12细胞OGD模型的建立与验证

CCK-8法检测显示，Control组细胞活力维持在较高水平，OGD组细胞相对活力明显降低（P<0.001，表1）；LDH释放法检测显示，Control组细胞LDH释放率处于低水平，而OGD组LDH释放率明显升高（P<0.001，表1）。形态学观察显示，Control组细胞贴壁良好、形态规则，呈多边形或梭形，突起完整且清晰；OGD组细胞贴壁能力下降，细胞数量减少，细胞肿胀或脱落，部分细胞破裂（图1A）；细胞活死染色结果显示，Control组以绿色荧光（活细胞）为主，仅见少量红色荧光（死细胞），而OGD组红色荧光占比明显增加，活细胞占比大幅降低（图1B）；流式细胞术检测显示，OGD组细胞凋亡率较Control组明显升高（图1C）。

2.2 SLC31A1干预体系的构建与效率验证

图2A结果显示：相差显微镜下，转染前pcDNA3.1组与si-NC组细胞形态均一、贴壁良好；转染48 h后2组细胞仍保持规则形态与良好贴壁性，未出现皱缩、脱壁等损伤特征。图2B显示：荧光显微镜下，转染后各组均呈现较强的荧光信号表明转染效率良好。分子水平检测结果（图2C、表2、表3）显示，与si-NC组或pcDNA3.1组相比，si-SLC31A1组的SLC31A1 mRNA相对表达量明显降低，而pcDNA3.1-SLC31A1组的SLC31A1 mRNA相对表达量明显升高。

2.3 SLC31A1对OGD细胞线粒体自噬的调控作用

基因层面，RT-PCR检测线粒体自噬相关基因（ATG5、ATG12、Parkin、PINK1）表达显示（表4）：与Control组相比，经OGD处理的pcDNA3.1组、si-NC组明显提高了线粒体自噬相关基因的表达水平；相应的，与经OGD处理的pcDNA3.1组相比，经OGD处理的pcDNA3.1-SLC31A1组ATG5、ATG12、Parkin、PINK1 mRNA相对表达量均明显升高。类似地，与经OGD处理的si-NC相比，经OGD处理的si-SLC31A1组上述基因mRNA相对表达量均降低。

蛋白层面，WB检测线粒体自噬标志蛋白（LC3B-Ⅰ/Ⅱ、P62）显示（图3、表5）：与Control组相比，经OGD处理的pcDNA3.1组、si-NC组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高，P62/β-actin比值明显降低；进一步，与经OGD处理的pcDNA3.1组相比，经OGD处理的pcDNA3.1-SLC31A1组LC3-Ⅱ/LC3-I比值明显升高，而P62/β-actin比值明显降低；与经OGD处理的si-NC组相比，经OGD处理的si-SLC31A1组呈现相反趋势，即LC3-Ⅱ/LC3-I比值明显降低，P62/β-actin比值明显升高。

2.4 SLC31A1对OGD细胞铜死亡的抑制作用

比色法检测细胞内铜离子浓度与GSSG/GSH比值（表6）显示：与Control组相比，经OGD干预的pcDNA3.1组及si-NC细胞内铜离子浓度明显升高，同时GSSG/GSH比值明显提高。进一步，与经OGD干预的pcDNA3.1组相比，经OGD干预的pcDNA3.1-SLC31A1组细胞内铜离子浓度进一步降低，同时，GSSG/GSH比值亦进一步降低；与经OGD干预的si-NC组相比，经OGD干预的si-SLC31A1组细胞内铜离子浓度明显升高，GSSG/GSH比值亦明显升高。

ELISA检测铜相关蛋白ACSL4和DLD表达（表 6）显示：与Control组相比，经OGD干预的pcDNA3.1组和经OGD干预的si-NC组ACSL4及DLD蛋白水平均明显升高；经OGD干预的pcDNA3.1-SLC31A1组ACSL4、DLD蛋白水平较经OGD干预的pcDNA3.1组均呈下降趋势，但差异无统计学意义，而经OGD干预的si-SLC31A1组ACSL4、DLD蛋白水平明显高于经OGD干预的si-NC组。

2.5 SLC31A1对OGD细胞氧化应激的改善作用

与Control组相比，经OGD干预的pcDNA3.1组及经OGD干预的si-NC组的SOD活性明显降低，而MDA含量明显升高，提示OGD处理可破坏细胞氧化应激平衡，加剧氧化损伤；与经OGD干预的pcDNA3.1组相比，经OGD干预的pcDNA3.1-SLC31A1组SOD活性明显升高，MDA含量明显降低；与经OGD干预的si-NC组相比，经OGD干预的si-SLC31A1组SOD活性明显降低，MDA含量明显升高。见表7。

3 讨论

缺血性脑卒中的核心病理机制在于缺血缺氧微环境诱导的神经细胞不可逆损伤^[13]，线粒体功能紊乱与氧化应激的异常激活是关键环节^[14-15]，而线粒体自噬作为重要的神经保护机制^[16]，其与铜死亡之间的调控关系尚不明确。本研究以PC12细胞为神经细胞模型，通过OGD成功模拟脑卒中缺血缺氧环境，经多指标验证模型构建成功，同时构建SLC31A1沉默与过表达细胞模型，为后续机制研究奠定基础。结果证实，SLC31A1可通过激活线粒体自噬，抑制铜死亡及氧化应激，最终减轻缺血缺氧诱导的神经细胞损伤，这一发现为缺血性脑卒中的病理机制研究提供了新视角，也为潜在治疗靶点的开发提供了实验依据。

结果表明，OGD处理后PC12细胞的线粒体自噬水平呈代偿性升高，同时伴随铜死亡通路激活与氧化应激损伤加剧，而SLC31A1的表达状态直接调控这一病理进程：SLC31A1过表达可增强线粒体自噬活性，同时减少铜离子蓄积和氧化应激产物生成，并使铜死亡相关蛋白ACSL4、DLD表达呈下降趋势；反之，SLC31A1沉默则会削弱线粒体自噬的保护作用，加重铜死亡与氧化损伤。这一结果证实SLC31A1在线粒体自噬、铜死亡、氧化应激调控网络中发挥核心枢纽作用，说明靶向调控SLC31A1表达可能成为同步干预多通路损伤的潜在策略，为后续机制研究与治疗方案设计提供了实验依据。

缺血缺氧引发的神经细胞损伤是多通路参与的复杂病理过程，其中铜稳态失衡、线粒体功能紊乱与程序性细胞死亡的相互作用是关键环节^[17-18]。SLC31A1作为介导细胞铜离子跨膜摄取的核心转运蛋白，其主要功能是维持细胞内铜稳态，而铜离子过量积累会生成大量活性氧，诱发蛋白毒性应激和线粒体呼吸功能障碍，最终启动铜死亡程序^[10]。本研究发现，SLC31A1过表达可明显降低OGD诱导的胞内铜离子蓄积，这与SLC31A1调控铜离子转运、避免细胞内过量铜离子滞留的功能一致。更重要的是，本研究揭示了SLC31A1通过线粒体自噬抑制铜死亡的关键调控机制。线粒体自噬作为选择性自噬的重要形式，可通过PINK1/Parkin通路特异性清除受损线粒体，减少线粒体来源的铜离子释放和活性氧生成^[19]，从而阻断线粒体损伤-铜过载-氧化应激-铜死亡的恶性循环。实验结果显示，SLC31A1过表达可上调ATG5、ATG12、Parkin、PINK1等线粒体自噬关键分子的表达，同时降低自噬底物P62水平，提示SLC31A1可能通过激活PINK1/Parkin通路增强线粒体自噬，进而减少受损线粒体介导的铜死亡。

当前关于缺血性脑卒中的研究多集中于经典细胞死亡方式，铜死亡作为程序性细胞死亡，其在脑卒中中的调控机制尚未完全阐明。现有研究证实铜稳态失调可通过诱发氧化应激、线粒体功能障碍促进动脉粥样硬化和血栓形成，与缺血性脑卒中的发生发展密切相关，但调控这一过程的关键分子仍不明确^[20]。本研究首次将SLC31A1与缺血性脑卒中的铜死亡调控关联起来，填补了SLC31A1在神经保护领域的研究空白。此前SLC31A1的功能研究多集中于肿瘤和铜代谢相关疾病^[21-22]，其在脑卒中病理进程中的作用及机制尚未见报道。此外，本研究构建了SLC31A1/铜稳态/线粒体自噬/铜死亡的完整调控网络，明确了SLC31A1作为铜代谢与线粒体自噬交叉节点的核心作用。此外，本研究证实SLC31A1并非直接作用于铜死亡通路，而是通过调控铜离子稳态间接激活线粒体自噬，进而发挥神经保护作用，这为理解多通路协同调控神经细胞存活提供了新的理论依据。

尽管本研究取得了明确的实验结果，但仍存在一定局限性。首先，本研究采用的PC12细胞虽具有神经元样表型且广泛用于脑卒中相关研究，但其与原代脑皮层神经元的生理特性仍存在差异，研究结论需在原代神经元模型中进一步验证。其次，本研究仅在细胞水平证实了SLC31A1的神经保护作用，缺乏动物体内实验的验证，难以完全反映其在缺血性脑卒中病理微环境中的实际作用。第三，受实验条件限制，本研究未探究铜离子螯合剂联合OGD处理或外源性铜离子OGD处理的效果，暂无法直接判断SLC31A1的神经保护作用是否完全依赖其铜离子转运功能，其调控线粒体自噬、抑制铜死亡的过程中是否存在非铜离子依赖的调控途径仍有待进一步验证。第四，本研究仅选取12 h这一时间节点进行研究，未设置时间梯度，故暂无法明确SLC31A1调控线粒体自噬、抑制铜死亡的动态变化规律。最后，SLC31A1调控线粒体自噬的具体分子靶点尚未明确，其是否采用直接结合自噬相关蛋白或间接调控下游信号通路激活PINK1/Parkin通路，仍需后续通过免疫共沉淀、基因沉默等技术深入探究。未来研究可围绕以下方向展开：采用原代大鼠脑皮层神经元和大脑中动脉栓塞动物模型，验证SLC31A1在体内的神经保护作用及对脑卒中预后的影响；增设铜离子螯合剂、外源性铜离子联合OGD的干预实验组，明确SLC31A1发挥作用的铜离子依赖性；设置不同时间梯度的OGD处理，系统检测各时间点线粒体自噬、铜死亡及氧化应激相关指标的表达变化，阐明SLC31A1调控作用的动态规律及阶段特异性；探索SLC31A1与线粒体自噬关键分子的相互作用模式，明确其调控线粒体自噬的分子机制；基于SLC31A1的铜转运功能，探索靶向SLC31A1的激动剂或铜离子螯合剂联合用药策略，为缺血性脑卒中的临床治疗提供新的思路。

参考文献

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