LPS诱导心肌细胞线粒体损伤并激活Nrf2介导的抗氧化途径

Lipopolysaccharide induces mitochondrial injury in cardiomyocytes and activates the antioxidant pathway mediated by nuclear factor erythroid 2-related factor 2

摘要

目的 探讨脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激条件下心肌细胞线粒体损伤、氧化应激及抗氧化途径的关联。 方法 体外将大鼠心肌细胞系（H9C2 cell line，H9C2）培养至状态良好时，以LPS刺激24 h。采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）检测细胞活力；蛋白质免疫印迹法（Western blot，WB）、实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，q-PCR）实验检测细胞炎症因子的表达；采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）实验检测细胞的还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；活性氧（reactive oxygen species，ROS）染色检测细胞活性氧水平；WB检测Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）和核因子E2相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）的蛋白表达；免疫荧光染色观察Nrf2的核转位，5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四乙基苯并咪唑碳菁碘化物染色（5，5'，6，6'-Tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethylbenzimidazole carbonyl chromophore iodide staining，JC-1染色）检测线粒体膜电位情况；Mitotracker染色观察线粒体形态变化。体内实验C57BL/6J小鼠在无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境中正常饮食1周后腹腔注射LPS刺激24 h。24 h后取血清检测肝肾功能及心脏肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT），取心脏进行包埋切片和苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）、Masson染色。 结果 体外实验：LPS刺激后H9C2细胞炎症水平升高、线粒体功能障碍、氧化应激水平升高，胞质中Keap1蛋白水平降低并且Nrf2发生核转位。体内实验：实验组C57小鼠肝肾功能受损，cTnT水平均升高，心肌炎症细胞浸润增加、纤维化程度加重。 结论 LPS刺激会引起心肌细胞线粒体损伤导致氧化应激和细胞功能障碍，而Nrf2介导的抗氧化途径激活不足以应对过高的氧化应激，因此进一步促进Nrf2核转位，提高细胞的抗氧化能力将为治疗脓毒症导致的心肌损伤提供新思路。

Abstract

Objective To investigate the association between mitochondrial injury，oxidative stress，and the antioxidant pathway in cardiomyocytes under lipopolysaccharide（LPS） stimulation. Methods Rat H9C2 cardiomyocytes were cultured in vitro until they were in a good state，and then H9C2 cells were stimulated with LPS for 24 hours. CCK8 assay was used to measure cell viability；Western blot and quantitative real-time polymerase chain reaction were used to measure the expression of inflammatory cytokines；ELISA was used to measure the levels of reduced glutathione（GSH），oxidized glutathione（GSSG），and malondialdehyde（MDA） and the activity of superoxide dismutase（SOD） in cells；reactive oxygen species（ROS） staining was used to measure the level of ROS； Western blot was used to measure the protein expression levels of Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1） and nuclear factor erythroid 2-related factor 2（Nrf2）； immunofluorescent staining was used to observe Nrf2 nuclear translocation，and JC-1 staining was used to measure mitochondrial membrane potential； Mitotracker staining was used to observe mitochondrial morphological changes. For in vivo experiments，C57BL/6J mice were given a normal diet in the specific pathogen-free environment for one week and were then given intraperitoneal injection of LPS for 24 hours of stimulation. After 24 hours，serum samples were collected to assess liver and renal function and measure the level of cardiac troponin T （cTnT），and the heart was collected for embedding，HE staining，and Masson staining. Results In the in vitro experiments，there was an increase in the level of inflammation in H9C2 cells after LPS stimulation，as well as mitochondrial dysfunction，an increase in oxidative stress，a reduction in the level of Keap1 protein in cytoplasm，and the presence of Nrf2 nuclear translocation. In the in vivo experiments，the C57 mice in the experimental group showed impaired liver and renal function and increases in the level of cTnT and the degrees of inflammatory cell infiltration and fibrosis in myocardium. Conclusion LPS stimulation can induce myocardial mitochondrial injury，leading to oxidative stress and cellular dysfunction，while activation of the Nrf2-mediated antioxidant pathway is insufficient to counteract excessive oxidative stress，thereby further promoting Nrf2 nuclear translocation. Enhancing cellular antioxidant capacity may provide new ideas for the treatment of sepsis-induced cardiomyopathy.

Graphical abstract

关键词

LPS / 心肌细胞 / 核因子E2相关因子2 / 线粒体 / 氧化应激

Key words

lipopolysaccharide / cardiomyocyte / nuclear factor erythroid 2-related factor 2 / mitochondria / oxidative stress

脓毒症心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，SIC）是脓毒症高死亡率的主要原因^[1]，重症监护病房（intensive care unit，ICU）住院的脓毒症患者出现心脏功能障碍的比例高达29%^[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为革兰阴性菌细胞外膜的主要成分是革兰阴性菌所致脓毒症的主要致病成分^[3]，在SIC中对心肌细胞有着不可忽视的损伤作用。线粒体是心肌能量代谢的主要场所^[4]，线粒体功能障碍可能导致心肌细胞功能受损^[5]。近年来研究表明脓毒症会导致心肌细胞的线粒体功能障碍并出现氧化应激损伤、凋亡、炎症水平升高等现象^[6]。研究表明^[7]，细胞在应对这些刺激时会自发启动保护程序，然而，关于LPS诱导线粒体损伤后会启动心肌细胞何种自我保护机制，目前尚不明确。

核因子E2相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）在抗氧化应激反应中起到至关重要的保护作用^[8]。Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1）是Nrf2的主要负调节因子，介导其泛素依赖性蛋白酶体降解^[9]。正常生理条件下，Keap1与Nrf2在细胞质中以结合形式存在，在受到氧化应激后，Keap1被降解，Nrf2得以释放而进入细胞核^[10]。Keap1与Nrf2在细胞内的表达与定位变化，是细胞响应氧化应激的重要指标，也是细胞启动抗氧化应激的关键机制，但近年来关于LPS刺激下Nrf2的表达变化仍存在争议^[11-12]。本研究采用LPS刺激大鼠心肌细胞（H9C2 cell line，H9C2）和C57小鼠，分别建立体外和体内SIC模型，探究LPS对心肌细胞功能及Nrf2表达的影响，为阐明LPS致心肌细胞损伤的机制提供更全面的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）购自Gibco（美国），LPS购自Sigma-Aldrich（货号L2880，美国），以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）溶解。Nrf2抗体购自三鹰生物（中国武汉），Keap1抗体购自Selleck（美国休斯顿），白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）抗体、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、逆转录和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自爱博泰克（中国武汉），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体来自华安生物（中国杭州）。细胞核蛋白与胞质蛋白抽提试剂盒购自碧云天（中国上海），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒购自索莱宝生物（中国北京），还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）检测试剂盒购自建成生物（中国南京）。JC-1染色和Mitotracker染色试剂盒购自碧云天生物（中国上海）。心脏肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）试剂盒购自菲恩生物（中国武汉）。

1.2 实验方法

1.2.1 H9C2细胞株

H9C2细胞株购自普诺赛（中国武汉），冻存于重庆医科大学儿科研究所，液氮保存时间1年。对H9C2细胞进行以下分组：①对照组用含10%血清的DMEM培养至70%密度后，更换无血清培养基培养24 h；②LPS组用含10%血清的DMEM培养至70%密度后，更换无血清培养基并用10 µg/mL的LPS刺激。24 h后收集细胞进行后续实验。细胞实验至少重复3次。

1.2.2 动物

本研究符合重庆医科大学附属儿童医院实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准（批准号：CHCMU-IACUC20210114036）。C57BL/6J雄性小鼠在无特定病原体（specific pathogen free，SPF）条件下单独饲养在温控室（23~25 ℃）中，光照/黑暗循环12 h。所有小鼠都可自由获得食物和饮水。将12只小鼠随机分为2组，每组6只。对小鼠进行以下处理：①对照组腹腔注射10 µL/g的生理盐水；②实验组腹腔注射10 mg/kg的LPS^[13]。24 h后，进行眼眶静脉丛采血，全血于4 ℃、3 000 r/min条件下离心15 min分离血清。安乐死后，迅速取心脏进行组织病理学检查。

1.2.3 细胞活力检测

CCK-8比色法检测细胞活力。将H9C2细胞分为对照组与实验组接种于96孔微孔板中（2×10³个/孔），待细胞生长至70%密度后，实验组加入10 µg/mL的LPS。LPS刺激24 h后，每孔加入10 µL的CCK-8试剂，随后37 ℃孵育60 min，使用BioTek Cytation 5 multimode reader多功能酶标仪（美国）检测吸光度。

1.2.4 实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）

采用Trizol提取总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到脱氧核糖核酸拷贝（deoxyribonucleic acid copy，cDNA），并以A260/A280比值为标准评估其质量和完整性。随后使用2×SYBR Green和引物与cDNA混合进行RT-qPCR检测靶基因信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达水平。qPCR热循环条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共45个循环。

1.2.5 蛋白质免疫印迹法（Western blot，WB）

用碧云天细胞核蛋白与胞质蛋白抽提试剂盒提供的试剂B提取细胞胞质蛋白后，沉淀中加入50 μL含苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的细胞核蛋白抽提试剂，获得细胞核蛋白。提取的蛋白用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）检测试剂盒检测蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。在室温（room temperature，RT）下用5%脱脂牛奶封闭2 h后，将PVDF膜与稀释的一抗4 ℃孵育过夜，并用相应的二抗室温孵育1 h。最后，使用显影液和成像仪进行可视化，结果采用imageJ软件进行分析。

1.2.6 ELISA实验

采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）实验检测血清cTnT含量。向试剂盒提供的孔板中加入100 µL待测血清，37 ℃孵育90 min后洗板2次。每孔加入100 µL生物素-抗体工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次。加入100 µL的HRP-链霉亲和素（streptavidin-biotin complex，SABC）工作液，37 ℃孵育30 min，洗板5次。加入90 µL的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB）显色底物，37 ℃避光孵育15 min。加入50 µL反应终止液。立即在450 nm处读取吸光度（absorbance，A）值。

1.2.7 血清学标志物检测

采用罗氏自动化分析仪（瑞士）监测天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、尿素（urea，UREA）、肌酐（creatinine，CREA）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）水平。取待测血清100 µL置于离心管内，放入自动化分析仪进行自动化分析。

1.2.8 苏木精-伊红染色

切片脱蜡至水，具体步骤如下：二甲苯Ⅰ 5~10 min，二甲苯Ⅱ 5~10 min，无水乙醇I 5 min，无水乙醇Ⅲ 5 min，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，超纯水（ultrapure water，UP）浸泡5 min。苏木精染色10~20 min，自来水冲洗1~3 min，盐酸乙醇分化5~10 s，自来水冲洗1~3 min。放入50 ℃的温水中或弱碱性水溶液返蓝，直到出现蓝色为止，自来水冲洗1~3 min。放入85%的乙醇3~5 min后，伊红染色3~5 min，水洗3~5 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片。

1.2.9 马松染色（Masson染色）

切片脱蜡至水，具体步骤如下：二甲苯Ⅰ 5~10 min，二甲苯Ⅱ 5~10 min，无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，UP水浸泡5 min。切片浸入Bouin液，室温作用过夜或置入37 ℃温箱内2 h进行媒染，然后流水冲洗至切片上的黄色消失。天青石蓝染色液滴染2~3 min，稍水洗。Mayer苏木素染色液滴染2~3 min，稍水洗。酸性乙醇分化液分化数秒，流水冲洗10 min。丽春红品红染色液滴染10 min，蒸馏水稍冲洗。磷钼酸溶液处理约10 min。倾去上液，切片不用水洗，直接滴加苯胺蓝染色液染5 min。弱酸溶液处理2 min，95%乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，每次5~10 s，二甲苯透明3次，每次1~2 min，中性树胶封片。

1.2.10 线粒体膜电位检测

将共聚焦皿分为对照组、实验组，每孔接种3 000个细胞，待细胞完全贴壁后，实验组加入10 µg/mL的LPS刺激24 h后，吸除两组共聚焦皿中的培养基，每一皿加入1 mL JC-1染色工作液，37 ℃孵育20 min。孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤两次。吸除缓冲液后加入2 mL细胞培养液后用激光共聚焦显微镜进行观察，并用Image J软件分析图像，结果采用t检验进行统计学分析。

1.2.11 线粒体形态检测

将共聚焦皿分为对照组、实验组，每孔接种3 000个细胞，待细胞完全贴壁后，实验组加入10 µg/mL的LPS刺激24 h后，吸除两组共聚焦皿中的培养基，37 ℃预温育的MitoTracker Green染色工作液，与细胞37 ℃共孵育30 min。孵育后，去除MitoTracker Green染色工作液，用PBS清洗3次，加入37 ℃预温育的新鲜细胞培养液，用激光共聚焦显微镜进行观察，并采用Fiji软件的Mitochondria Analyzer插件，随机选取每组≥10个视野，每个视野≥50个细胞进行分析，获取粒体结合位点数（Mitotracker阳性荧光点数量/细胞）、线粒体平均分支长度、线粒体平均面积，结果采用t检验进行统计学分析。

1.2.12 还原型谷胱甘肽测定

空白管中加入0.8 mL试剂一应用液，标准管加入0.8 mL GSH标准液，测定管加入0.8 mL待测细胞裂解液。空白管、标准管、测定管分别加入1 mL试剂二、0.2 mL试剂三、0.04 mL试剂四。混匀，静置5 min，于420 nm（405～420 nm）处，1 cm光径。双蒸水调零，测定各管吸光度值（A）。GSH含量（mg/L）=（A测定-A空白）/（A标准-A空白）×C标准×307×N[C标准：标准品浓度，20×10^-3 mmol/L；307：GSH相对分子质量，307 g/mol（mg/mmol）；N：裂解液制备时稀释倍数。]

1.2.13 氧化型谷胱甘肽测定

测定管中加入细胞裂解液20 µL，标准管加入标准品20 µL，空白管加入蒸馏水20 µL。空白管、标准管、测定管均加入1 µL试剂二后37 ℃孵育30 min。各管依次加入140 µL试剂三、20 µ L试剂四、20 µL试剂五、2 µL试剂六工作液于412 nm处测定30 s和150 s的A值分别记为A1测定、A1标准、A1空白和A2测定、A2标准、A2空白，计算ΔA测定=A2测定-A1测定，ΔA标准=A2标准-A1标准，ΔA空白=A2空白-A1空白。以标准品浓度（µg/mL）为横坐标x，以（ΔA标准-ΔA空白）为纵坐标y，绘制标准曲线。根据标准曲线，将（ΔA测定-ΔA空白）代入公式计算样本浓度（µg/mL）。

1.2.14 丙二醛测定

测定管和空白管中分别加入300 µL MDA检测工作液后，空白管加入100 µL蒸馏水，测定管加入100 µL样本，两管中分别加入100 µL试剂三。100 ℃孵育60 min后，冰浴中冷却，10 000×g常温离心10 min。吸取200 µL上清液于96孔板中，测定样本在532 nm和600 nm处的A值。分别计算ΔA532=A532测定-A532空白，ΔA600=A600测定-A600空白，ΔA=ΔA532-ΔA600。MDA含量（nmol/mg）=32.258×ΔA/Cpr×F（Cpr：样本蛋白质浓度；F：稀释倍数）。

1.2.15 超氧化物歧化酶测定

将测定管、对照管、空白管1、空白管2用离心管进行标记。测定管、对照管中分别加入20 µL细胞裂解液。4种标记的离心管分别加入45 µL试剂后，测定管和空白管1加入20 µL试剂二工作液。混匀后所有离心管内分别加入35 µL试剂三，测定管加入70 µL蒸馏水，对照管和空白管1加入90 µL蒸馏水，空白管2加入110 µL蒸馏水。所有离心管内加入10 µL试剂四工作液后，充分混匀，37 ℃水浴30 min后，450 nm处测定各管A值。分别记为A测定、A对照、A1空白、A2空白，计算AA测定=A测定-A对照，AA空白=A1空白-A2空白。抑制百分率=（ΔA空白-ΔA测定）/ΔA空白×100%，SOD活性（U/mL）=10×抑制百分率/（1-抑制百分率）/Cpr×F（Cpr：蛋白样本浓度；F稀释倍数）。

1.2.16 活性氧检测

用PBS洗涤H9C2细胞，然后加入2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）探针工作液。在37 ℃下孵育20 min后，吸除探针溶液，用PBS洗涤细胞两次并在荧光显微镜下观察。采用Fiji软件测量平均荧光强度，结果采用t检验进行统计学分析。

1.2.17 免疫荧光染色

将处理后的细胞用4%多聚甲醛固定30 min后用PBS清洗并用通透剂处理20 min。接着用PBS清洗后用5% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭1 h。封闭后用Nrf2抗体4 ℃条件下孵育过夜，结束后用PBS清洗并在避光条件下用二抗室温孵育1 h。细胞核用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色15 min。采用尼康W1 SoRa转盘共聚焦显微镜（Nikon，Tokyo，Japan）成像，并用Fiji软件进行定量分析。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 10.1.2软件对数据资料进行统计分析。数据以均数±标准差（x±s）表示，对于2组之间比较采用t检验，多组间采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 LPS刺激导致H9C2细胞活力降低与炎症水平升高

采用不同浓度的LPS刺激H9C2细胞后检测细胞活力，结果显示LPS浓度10 µg/mL时细胞活力降至最低（图1A，t=22.43，P0.001），在LPS浓度大于10 µg/mL时细胞活力无明显改变（图1A，t=0.153 1，P=0.882），因此后续采用10 µg/mL的LPS刺激细胞。RT-qPCR结果（图1B）显示LPS刺激后IL-10的mRNA水平明显下降（t=2.78，P=0.050），而TNF-α的mRNA水平明显升高（t=6.472，P=0.002）。Western blot结果（图1C）显示，LPS刺激后IL-10蛋白表达显著降低（t=3.404，P=0.027），TNF-α蛋白表达显著升高（t=2.885，P=0.044）。

2.2 LPS刺激的C57小鼠心肌发生一定程度损伤

LPS刺激后，C57小鼠血清肝肾功能指标发生变化（图2A），血清AST（t=7.635，P0.001）、ALT（t=9.23，P0.001）、AST/ALT（t=3.077，P=0.011）、LDH（t=6.947，P0.001）、UREA（t=11.64，P0.001）、CREA（t=8.867，P0.001）、CK（t=2.700，P=0.022）均显著升高。心肌组织在LPS刺激后出现明显的病理改变（图2B），cTnT的含量在LPS刺激后也显著升高（t=4.726，P0.001）。HE染色结果显示LPS刺激后心肌组织可见炎症细胞浸润，Masson染色结果显示心肌组织在LPS刺激后出现胶原纤维沉积^[14]，胶原面积百分比增加（t=28.86，P0.001）。

2.3 LPS刺激使H9C2细胞线粒体功能受损

LPS刺激24 h后，H9C2细胞的线粒体膜电位检测结果（图3A）显示，LPS刺激后JC-1染色的红色荧光强度在LPS刺激后明显下降，而绿色荧光强度明显升高，线粒体膜电位显著下降（t=6.794，P0.001）。Mitotracker染色结果（图3B）显示，LPS刺激24 h后线粒体结合位点数量显著减少（t=2.800，P=0.018），线粒体平均分支长度显著缩短（t=5.339，P0.001），线粒体平均面积减小（t=5.104，P0.001）。

2.4 LPS刺激后线粒体氧化应激水平升高

氧化应激检测结果（图4A）显示，LPS刺激24 h后的H9C2细胞裂解液中，GSH水平显著下降（t=5.130，P=0.006），GSSG水平显著升高（t=5.544，P=0.005），GSH/GSSG比值显著下降（t=8.066，P=0.001），SOD活性显著降低（t=19.32，P0.001），MDA水平显著增强（t=37.60，P0.001）。活性氧染色结果显示（图4B），代表活性氧水平的FITC荧光强度在LPS刺激后显著升高（t=8.148，P0.001）。

2.5 LPS刺激后Keap1蛋白胞质含量下降及Nrf2蛋白发生核转位

LPS刺激后Keap1蛋白在细胞质内以及Nrf2蛋白在细胞核内的含量发生变化（图5A）。Keap1蛋白在LPS刺激后在细胞质内的含量显著下降（t=9.846，P0.001），而Nrf2蛋白在细胞核内的含量显著升高（t=16.18，P0.001）。免疫荧光染色结果（图5B）显示Nrf2在LPS刺激后明显由细胞质转位至细胞核。

3 讨论

SIC发病机制复杂，本研究采用LPS刺激H9C2心肌细胞并检测其细胞活力及炎症水平，结果显示LPS刺激导致H9C2细胞活力降低与炎症水平升高，这与先前的研究结果一致^[15]。此外，体内实验结果显示，LPS可致心肌组织损伤，小鼠肝肾功能下降且cTnT升高，组织病理学检查结果也证明了LPS对心肌组织的损伤作用，根据先前的文献^[16]，本课题组成功建立C57小鼠SIC模型，进一步验证了LPS的心肌损伤效应。心肌组织持续收缩导致心脏具有较高的能量需求，线粒体作为心肌细胞能量代谢的主要场所至关重要^[17]，LPS刺激导致的线粒体损伤会导致心肌能量供应障碍而引发心肌组织损伤。因此后续通过一系列实验探索了LPS对心肌细胞线粒体的影响。结果显示在LPS刺激下心肌细胞的线粒体膜电位下降、线粒体结构受损，这与文献中“LPS刺激会导致心肌细胞线粒体损伤”的报道一致^[18]。线粒体是细胞能量代谢的重要细胞器，对组织和细胞的氧化应激调节起着至关重要的作用，线粒体损伤导致线粒体ROS过量生成会引发细胞氧化应激损伤^[19]。在本研究中，LPS刺激的H9C2心肌细胞氧化应激各项指标均发生显著变化，提示H9C2细胞在LPS刺激后氧化应激水平显著升高，与既往文献报道一致。

Nrf2作为细胞抗氧化应激的关键因子，其表达和定位变化是细胞处于氧化应激状态的标志^[20]。本研究通过WB实验检测其核内蛋白水平的变化，并通过免疫荧光实验观察其定位变化，结果显示在LPS刺激后Nrf2在细胞核内的表达升高。尽管近年来LPS刺激心肌细胞后Nrf2的表达变化的研究尚无定论，本研究显示的LPS刺激后细胞核Nrf2表达升高的结果与部分先前研究一致^[11]。

LPS对心脏的损伤机制复杂，除了线粒体损伤和氧化应激外，Ca²⁺稳态失衡和细胞凋亡也是LPS对心肌细胞造成损伤的重要途径^[21-22]，这些途径对心肌细胞造成损伤及细胞的自我保护的具体机制仍有待深入研究。本研究显示LPS对心肌细胞造成的损伤主要是因为线粒体损伤引发的氧化应激而产生，此外，Nrf2的抗氧化应激作用在对抗LPS的损伤中变化明显，细胞同时存在氧化应激和抗氧化激活的状态，表明心肌细胞的自我保护作用不足以应对过高的氧化应激，因此通过寻找促进Nrf2向细胞核转移的药物，提高心肌细胞对LPS刺激时的抗氧化能力，从而实现细胞的自我修复，这为SIC的治疗提供新思路。

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基金资助

重庆市英才计划资助项目(cstc2024ycjh-bgzxm0024)