lncRNA SNHG14靶向抑制miR-27b-3p促进乳腺癌细胞迁移和侵袭

lncRNA SNHG14 targets and inhibits miR-27b-3p to promote the migration and invasion of breast cancer cells

摘要

目的 探讨长链非编码核糖核酸核仁宿主基因14（long non-coding ribonucleic acid nucleolar ribonucleic acid host gene 14，lncRNA SNHG14）靶向微小RNA-27b-3p（microRNA-27b-3p，miR-27b-3p）对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。 方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）法检测乳腺癌组织及细胞中lncRNA SNHG14、miR-27b-3p水平；采用双荧光素酶报告实验验证lncRNA SNHG14与miR-27b-3p的靶向关系；将MDA-MB-231细胞转染相应质粒后分为Control组、si-NC组、si-SNHG14组、si-SNHG14+anti-NC组、si-SNHG14+anti-miR-27b-3p组；采用qRT-PCR法检测细胞中lncRNA SNHG14、miR-27b-3p、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2） mRNA、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9） mRNA水平；采用划痕实验检测细胞迁移；Transwell检测细胞侵袭；蛋白质免疫印迹（Western blot）检测细胞迁移、侵袭相关蛋白表达；裸鼠移植瘤检测移植瘤生长情况及瘤组织中lncRNA SNHG14、miR-27b-3p水平，免疫组化检测移植瘤组织MMP-2、MMP-9表达。 结果 乳腺癌组织及MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞中lncRNA SNHG14水平升高，miR-27b-3p水平降低（P<0.05）；Starbase网站预测及双荧光素酶实验结果均显示lncRNA SNHG14与miR-27b-3p之间存在靶向结合位点；si-SNHG14组较si-NC组lncRNA SNHG14、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平及划痕愈合率、侵袭细胞数量、MMP-2、MMP-9表达均降低，miR-27b-3p水平升高（P<0.05）；si-SNHG14+miR-27b-3p mimics组较SNHG14-WT+miR-NC组MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平及划痕愈合率、侵袭细胞数量、MMP-2、MMP-9表达升高，miR-27b-3p水平降低（P<0.05）；裸鼠移植瘤实验结果显示，si-SNHG14组较si-NC组瘤体积、瘤重、lncRNA SNHG14水平及MMP-2、MMP-9阳性细胞率均降低，miR-27b-3p水平升高（P<0.05）。 结论 lncRNA SNHG14可通过靶向抑制miR-27b-3p促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

Abstract

Objective To investigate the effects of the long non-coding ribonucleic acid small nucleolar ribonucleic acid host gene 14 （lncRNA SNHG14） targeting microRNA-27b-3p（miR-27b-3p） on the migration and invasion of breast cancer cells. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to measure lncRNA SNHG14 and miR-27b-3p levels in breast cancer tissues and cells. Dual luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between lncRNA SNHG14 and miR-27b-3p. According to plasmids transfected，MDA-MB-231 cells were divided into control group，si-NC group，si-SNHG14 group，si-SNHG14+anti-NC group，and si-SNHG14+anti-miR-27b-3p group. The cells were measured for lncRNA SNHG14，miR-27b-3p，matrix metalloproteinase-2（MMP-2） mRNA，and matrix metalloproteinase-9（MMP-9） mRNA levels using qRT-PCR. Cell migration and invasion were assessed by scratch assay and Transwell assay，respectively. The expression of proteins related to cell migration and invasion was measured by Western blot. For nude mouse tumor xenografts，tumor growth was measured，lncRNA SNHG14 and miR-27b-3p levels in tumor tissue were quantified，and the expression of MMP-2 and MMP-9 in tumor tissue was determined using the immunohistochemistry method. Results In breast cancer tissues and breast cancer cells（MCF-7 and MDA-MB-231），lncRNA SNHG14 levels were significantly increased，and miR-27b-3p levels were significantly decreased（P<0.05）. Both Starbase website prediction and dual luciferase assay results indicated the presence of a targeted binding site between lncRNA SNHG14 and miR-27b-3p. Compared with the si-NC group，the si-SNHG14 group showed significant decreases in lncRNA SNHG14，MMP-2 mRNA，MMP-9 mRNA，MMP-2，and MMP-9 levels，a significant reduction in the scratch healing rate and the number of invasive cells，and a significant increase in the miR-27b-3p level（P<0.05）. Compared with the SNHG14-WT+miR-NC group，the SNHG14-WT+miR-27b-3p mimics group exhibited significantly higher MMP-2 mRNA，MMP-9 mRNA，MMP-2，and MMP-9 levels，a significantly higher scratch healing rate and the number of invasive cells，and a significantly lower miR-27b-3p level（P<0.05）. In the nude mouse tumor xenograft experiments，the si-SNHG14 group had significantly lower tumor volume，tumor weight，lncRNA SNHG14 level，and percentages of MMP-2- and MMP-9-positive cells and a significantly higher miR-27b-3p level，compared with the si-NC group（P<0.05）. Conclusion lncRNA SNHG14 can promote the migration and invasion of breast cancer cells by targeting and down-regulating miR-27b-3p.

Graphical abstract

关键词

长链非编码核糖核酸核仁宿主基因14 / 微小RNA-27b-3p / 乳腺癌 / 迁移 / 侵袭

Key words

long non-coding ribonucleic acid small nucleolar ribonucleic acid host gene 14 / microRNA-27b-3p / breast cancer / migration / invasion

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤之一，也是导致女性癌症死亡的主要原因，随着经济社会快速发展及生活饮食习惯改变，乳腺癌的发病率仍在持续增加且呈年轻化趋势^[1]。目前主要采用手术、放化疗及激素治疗。尽管医疗技术不断进步，早期乳腺癌患者生存率有所提高，但疾病仍易转移复发；晚期患者仅能延缓生存期，5年生存率极低^[2]。了解乳腺癌的发病机制，针对性早期治疗，抑制其转移复发至关重要。近年来分子靶向治疗日益受到关注，研究发现长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）在包括乳腺癌在内的多种癌症中参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭^[3]。而lncRNA核仁核糖核酸宿主基因14（nucleolar ribonucleic acid host gene 14，SNHG14）作为lncRNA之一，研究发现，其在三阴性乳腺癌组织和细胞系中表达上调，敲除lncRNA SNHG14可减弱三阴性乳腺癌细胞在体内和体外的增殖、迁移和侵袭能力，抑制三阴性乳腺癌进展^[4]。另外微小RNA-27b-3p（microRNA-27b-3p，miR-27b-3p）作为miRNAs之一，在乳腺癌细胞中低表达，增强miR-27b-3p表达可抑制乳腺癌的进展^[5]。然而，lncRNA SNHG14是否通过调控miR-27b-3p影响乳腺癌恶性进展尚不明确。本研究旨在探讨二者的靶向关系及其对乳腺癌细胞迁移与侵袭的影响，以期为乳腺癌分子靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样本来源

由专业病理医师收集四川省医学科学院·四川省人民医院2022年6月至2024年1月收治的30例乳腺癌患者的癌组织病理标本，置于液氮保存。所有患者均为首次确诊，无精神疾病及传染病史，术前未接受任何可能影响癌组织病变的治疗。本研究经本院伦理委员会审批通过（批号：2022-050092），患者及家属均签署知情同意书。

1.1.2 主要材料

人正常乳腺上皮细胞MCF10A及人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231购自上海酶研生物科技有限公司；4周龄BALB/c裸鼠购自陆军军医大学基础医学院实验动物学教研室[实验动物生产许可证号：SCXK（渝）2022-0002]，饲养于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级环境中，温度（25±2） ℃，相对湿度50%~65%，12 h光照/12 h黑暗周期，自由摄食饮水。本研究方案经本院动物伦理委员会批准。lncRNA SNHG14、miR-27b-3p引物及si-NC、si-SNHG14、si-SNHG14+anti-NC、si-SNHG14+anti-miR-27b-3p、miR-NC、miR-27b-3p mimics质粒均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并提供；兔源多克隆基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2，货号FNab05238）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9，货号FNab05247）抗体购自武汉菲恩生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（货号LF102）购自上海雅酶生物医药科技有限公司。Transwell小室（货号3422、3470、3401）购自本生（天津）健康科技有限公司。光学显微镜（型号RX50）购自思科诺思生物科技（北京）有限公司；荧光显微镜（型号DM IL LED）购自德国Leica公司；凝胶成像系统（型号ChemiDocXRS+）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MCF10A、MCF-7及MDA-MB-231细胞均使用洛斯维·帕克纪念研究所1640培养基（Roswell Park Memorial Institute 1640 medium，RPMI 1640）（含10%胎牛血清与1%青-链霉素），置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞融合度达80%以上时，用胰酶消化传代，每2 d更换培养基，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 qRT-PCR检测lncRNA SNHG14与miR-27b-3p表达

取乳腺癌组织、癌旁组织及细胞样本，加入TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）后进行PCR扩增。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。以U6、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，采用2^⁻ΔΔCt法计算lncRNA SNHG14、miR-27b-3p、MMP-2 mRNA及MMP-9 mRNA的相对表达量。

引物序列如下：lncRNA SNHG14上游：5′-GCAACATTCCCTGAACATACT-3′，下游：5′-GCGAGGAATCTGATTCCAAGC-3′；miR-27b-3p上游：5′-CGCCTTGAATCGGTG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游：5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′；MMP-2上游：5′-AGCGAGTGGATGCCGCCTTTAA-3′，下游：5′-CATTCCAGGCATCTGCGATGAG-3′；MMP-9上游：5′-GCCACTACTGTGCCTTTGAGTC-3′，下游：5′-CCCTCAGAGAATCGCCAGTACT-3′；GAPDH上游：5′-CTAGGCGCTCACTGTTCTCTC-3′，下游：5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′。

1.2.3 分组与处理

将MDA-MB-231细胞分为Control组、si-NC组、si-SNHG14组、si-SNHG14+anti-NC组及si-SNHG14+anti-miR-27b-3p组。Control组不进行转染，其余各组分别转染相应质粒，24 h后继续于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

1.2.4 双荧光素酶实验

构建SNHG14-WT与SNHG14-MUT载体，采用脂质体转染法将其分别与miR-NC、miR-27b-3p mimics共转染MDA-MB-231细胞，常规培养48 h，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞中lncRNA SNHG14荧光素酶相对活性。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移

MDA-MB-231细胞转染相应质粒48 h后，收集细胞制备单细胞悬液，接种于6孔板中培养至细胞融合。用灭菌的200 μL移液枪头垂直划痕，PBS洗涤去除脱落细胞然后继续培养24 h。分别于0 h与24 h观察划痕并拍照，计算划痕愈合率。

1.2.6 Transwell检测细胞侵袭

MDA-MB-231细胞转染相应质粒培养48 h，收集细胞制备单细胞悬液，将其加入铺有Matrigel凝胶的Transwell上室，下室加入含胎牛血清的培养基，于37 ℃条件下培养24 h后，取出上室，清洗、固定、结晶紫染色后置于荧光显微镜下观察。

1.2.7 Western blot检测细胞迁移、侵袭相关蛋白表达

MDA-MB-231细胞转染相应质粒48 h后，收集细胞，加入蛋白裂解液提取总蛋白，二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）测定蛋白浓度。蛋白样品经沸水浴变性后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF），封闭后与一抗4 ℃孵育过夜，再与二抗室温孵育2 h。增强型化学发光液（enhanced chemiluminescence solution，ECL）显色，采集图像并分析灰度值。

1.2.8 裸鼠移植瘤

将分别转染si-NC、si-SNHG14的MDA-MB-231细胞注射到裸鼠右侧腋下，每组6只。常规饲养，每天观察裸鼠生长状态，并从第5天开始每隔5 d测量移植瘤体积，30 d后处死各组裸鼠取瘤组织称重，然后取部分肿瘤组织检测lncRNA SNHG14、miR-27b-3p水平，剩余瘤组织制成石蜡切片备用。

1.2.9 免疫组化检测瘤组织MMP-2、MMP-9表达

石蜡切片常规脱蜡复水后，经3% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，枸橼酸盐缓冲液热修复抗原，血清封闭后依次加入MMP-2、MMP-9一抗及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗孵育，链霉亲和素-生物素复合物（streptavidin-biotin complex，SABC）孵育后二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，显微镜下观察并分析阳性细胞比例。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验证实符合正态分布后，采用均数±标准差（x±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用Levene检验确认。若总体比较差异有统计学意义，进一步采用SNK-q检验（Student-Newman-Keuls法）进行组间两两比较。所有统计检验均为双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及细胞中lncRNA SNHG14、miR-27b-3p水平

与癌旁组织相比，乳腺癌组织中 lncRNA SNHG14 水平升高[（1.42±0.15） vs. （1.00±0.00），t=15.336，P<0.001]，miR-27b-3p 水平降低[（0.52±0.06） vs.（1.00±0.00），t=43.817，P<0.001]（图1）。与MCF10A细胞（1.00±0.00；1.00±0.00）相比，MCF-7细胞（1.37±0.15；0.51±0.06）、MDA-MB-231细胞（1.31±0.14；0.57±0.07）中lncRNA SNHG14水平升高，miR-27b-3p水平降低（F=16.860，P<0.001；F=151.271，P<0.001；图2）。

2.2 lncRNA SNHG14与miR-27b-3p的靶向关系验证

Starbase网站预测显示lncRNA SNHG14与miR-27b-3p之间存在靶向结合位点（图3）。SNHG14-WT+miR-27b-3p mimics组（0.52±0.06）相对荧光素酶活性较SNHG14-WT+miR-NC组（0.96±0.11）降低（t=27.804，P<0.001；见图4）。

2.3 各组细胞中lncRNA SNHG14、miR-27b-3p水平

与Control组（1.00±0.00；1.00±0.00）、si-NC组（0.99±0.10；1.01±0.10）相比，si-SNHG14组（0.48±0.05；1.39±0.15）lncRNA SNHG14水平降低，miR-27b-3p水平升高；与si-SNHG14组、si-SNHG14+anti-NC组（0.49±0.06；1.38±0.15）比较，si-SNHG14+anti-miR-27b-3p组（0.50±0.06；1.05±0.11）中miR-27b-3p水平降低（F=116.604，P<0.001；F=18.031，P<0.001；图5）。

2.4 各组细胞迁移与侵袭情况

与Control组（72.39±7.83；125.49±13.68；1.00±0.00；1.00±0.00；0.98±0.11；0.86±0.10）、si-NC组（70.14±7.62；119.62±12.94；1.00±0.00；0.98±0.10；0.94±0.10；0.83±0.09）相比，si-SNHG14组（31.68±3.59；45.68±5.06；0.62±0.07；0.50±0.06；0.55±0.06；0.42±0.05）中划痕愈合率、侵袭细胞数量、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平及MMP-2、MMP-9蛋白表达降低；与si-SNHG14组、si-SNHG14+anti-NC组（32.50±3.63；47.59±5.17；0.64±0.07；0.51±0.06；0.59±0.07；0.45±0.06）相比，si-SNHG14+anti-miR-27b-3p组（63.92±6.96；106.71±11.38；0.95±0.10；0.87±0.10；0.88±0.10；0.79±0.09）中划痕愈合率、侵袭细胞数量、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平及MMP-2、MMP-9蛋白表达升高（F=64.116，P<0.001；F=86.324，P<0.001；F=37.399，P<0.001；F=68.239，P<0.001；F=30.347，P<0.001；F=43.421，P<0.001；图6～8）。

2.5 裸鼠移植瘤

si-SNHG14组较si-NC组移植瘤体积减小（图9），与si-NC组相比，si-SNHG14组移植瘤重量降低[（1.51±0.20） g vs. （2.44±0.29） g，t=6.467，P<0.001]，瘤组织lncRNA SNHG14相对表达量降低[（0.58±0.07） vs. （1.00±0.00），t=14.697，P<0.001]，miR-27b-3p相对表达量升高[（1.33±0.14） vs. （1.00±0.00），t=5.744，P<0.001]，见图10。

2.6 瘤组织中MMP-2、MMP-9的表达

si-SNHG14组（21.34±2.83；18.57±2.14）中MMP-2、MMP-9阳性细胞率均低于si-NC组（49.68±5.87；44.29±5.22）（t=10.653，P<0.001；t=11.167，P<0.001；图11、12）。

3 讨论

乳腺癌是一种雌激素依赖性恶性肿瘤，具有高度异质性，是全球女性最常见的癌症，并已成为世界第五大癌症死亡原因^[6]。阐明乳腺癌的发病机制，寻求新型生物标志物及理想的靶点对于早期诊断与治疗至关重要。肿瘤复发转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，迁移与侵袭是影响转移的关键环节，MMP-2与MMP-9在其中发挥重要调控作用^[7]。本研究中，下调MMP-2与MMP-9表达可抑制乳腺癌细胞迁移与侵袭。另有研究显示，下调MMP-2与MMP-9表达可抑制乳腺癌进展^[8-9]。提示抑制迁移与侵袭可能延缓乳腺癌进展。

lncRNA是一类长度>200 nt的非编码RNA，其表达异常在多种癌症的病理生理过程中发挥重要作用，常作为癌症潜在的生物标志物。本研究发现，lncRNA SNHG14在乳腺癌组织及MCF-7、MDA-MB-231细胞中高表达，沉默lncRNA SNHG14可下调MMP-2、MMP-9表达，抑制乳腺癌进展。此外，lncRNA常通过调控miRNA或蛋白质参与基因表达调控，参与细胞增殖、转移等生物学行为^[10]。而lncRNA SNHG14表达与肿瘤分化、TNM分期、淋巴结转移、预后等多种临床病理特征密切相关，其可通过吸附不同的miRNAs来调节其靶基因表达，进而促进癌细胞存活、侵袭和迁移，可作为癌症预后生物标志物和治疗靶点^[11]。SNHG14在乳腺癌组织与细胞中高表达，可通过竞争性结合miR-543上调KLF7表达，促进乳腺癌发展；敲低SNHG14则可抑制细胞增殖、迁移与侵袭，并诱导凋亡^[12]。lncRNA SNHG14作为促癌基因与子宫内膜癌患者的肿瘤大小、病理分期和不良预后密切相关，其过表达可通过调控miR-655-3p促进子宫内膜癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，加速子宫内膜癌的恶性进展^[13]。推测lncRNA SNHG14可通过靶向调控miRNA影响乳腺癌的发展进程。

miRNA是一类短链非编码RNA，其可通过调控靶基因表达参与多种生理病理过程，尤其在癌症的发展进程中发挥重要作用^[14]。本研究发现，miR-27b-3p在乳腺癌组织中及MCF-7、MDA-MB-231细胞中低表达。miR-27b-3p的异常表达与癌症病理进展及不良预后密切相关。其中在乳腺癌组织miR-27b-3p表达下调，上调miR-27b-3p水平可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭^[15]。另有研究发现，敲低lncRNA AFAP1-AS1可上调miR-27b-3p抑制宫颈癌细胞的自我更新及转移^[16]。敲低lncRNA PVT1可上调miR-27b-3p水平抑制前列腺癌细胞的迁移、增殖和侵袭能力^[17]。本研究发现沉默SNHG14可上调miR-27b-3p表达，提示SNHG14可能通过靶向调控miR-27b-3p参与乳腺癌进展。另外Starbase网站预测及双荧光素酶实验均证实lncRNA SNHG14与miR-27b-3p之间存在靶向结合位点。裸鼠移植瘤实验显示，抑制SNHG14可上调miR-27b-3p表达，下调MMP-2与MMP-9表达，从而抑制肿瘤生长。表明lncRNA SNHG14通过下调miR-27b-3p，上调MMP-2、MMP-9表达，促进乳腺癌的迁移与侵袭。

综上所述，lncRNA SNHG14通过靶向下调miR-27b-3p促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。乳腺癌发病机制复杂，本研究存在一定局限性，后续仍需深入探讨。

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基金资助

四川省科技计划资助项目(2022YFS0314)