一氧化碳改善内皮炎症与血管生成障碍：基于SAA3-TLR4轴的机制研究

Carbon monoxide attenuates endothelial inflammation and angiogenic dysfunction：a mechanistic study based on the serum amyloid A3-Toll-like receptor 4 axis

摘要

目的 探讨一氧化碳（carbon monoxide，CO）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肺微血管内皮炎症及新生小鼠急性肺损伤的保护作用，并阐明其是否通过血清淀粉样蛋白A3（serum amyloid A3，SAA3）–Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）信号轴发挥效应。 方法 在小鼠肺微血管内皮细胞中建立LPS炎症模型，CO释放分子3（CO-releasing molecule 3，CORM-3）治疗模型，通过CCK-8实验检测细胞活力，实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）检测炎症因子白细胞介素-1β（interleukin 1 beta，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）表达，并通过成管实验与5-乙炔基-2-脱氧尿苷（5-ethynyl-2-deoxyuridine，EdU）细胞增殖检测实验评估内皮功能。构建新生小鼠LPS诱导急性肺损伤和CO治疗模型，通过苏木精-伊红染色观测肺组织病理改变，通过qPCR、酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测肺组织炎症因子水平。结合高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）转录组数据分析差异基因及通路富集，通过分子对接预测蛋白质相互作用位点，通过qPCR和蛋白免疫印迹检测SAA3和TLR4表达，并在构建Saa3敲低模型后检测炎症因子mRNA水平。 结果 在不降低细胞活力的前提下，与LPS组比较，CO显著抑制Il-1β、Il-6、Tnf-α的mRNA（4.677±0.259）、（3.405±0.307）、（4.601±0.263）表达（P0.001），并逆转LPS导致的管腔形成障碍［分支点数量：6 h，（192.333±9.609），P=0.005；12 h，（351.333±16.258），P=0.001；24 h，（451.000±25.000）；P=0.012；毛细血管长度：6 h，（3 606.333±133.770），P=0.002；12 h，（4 814.333±73.228）；P=0.014；24 h，（5 480.000±196.726）；P=0.015］与增殖能力抑制［（0.640±0.039），P=0.005）］。体内实验显示，与LPS组比较，CO治疗可明显减轻LPS诱导的组织学损伤并降低肺组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA［（18.090±0.406）、（6.532±0.356）、（9.654±0.213）］和蛋白［（353.335±29.279） pg/mL、（1 759.241±200.466） pg/mL、（449.698±25.686） pg/mL］水平（P0.001）。转录组分析提示Saa3为LPS刺激下最显著上调基因，TLR信号通路显著富集；分子对接显示SAA3与TLR4存在潜在高亲和相互作用。进一步实验表明，CO可下调LPS诱导的SAA3与TLR4 mRNA［（3.083±0.265）、（3.838±0.317），P0.001］和蛋白［（1.164±0.110）、（1.178±0.123），P0.01］表达，而Saa3敲低显著削弱促炎因子Il-1β、Il-6和Tnf-α的mRNA转录［（17.020±2.683）、（14.012±1.954）、（8.229±1.936）］并抑制其激活（P0.001）。 结论 CO可减轻LPS诱导的内皮炎症与功能损伤并改善新生小鼠急性肺损伤，其保护作用可能通过抑制SAA3-TLR4信号轴实现，为新生儿急性呼吸窘迫综合征的内皮靶向抗炎干预提供了机制依据。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of carbon monoxide（CO） against lipopolysaccharide（LPS）-induced pulmonary microvascular endothelial inflammation and acute lung injury in neonatal mice，and to clarify whether CO exerts this effect through the serum amyloid A3（SAA3）-Toll-like receptor 4（TLR4） signaling axis. Methods Mouse pulmonary microvascular endothelial cells were used to establish an LPS-induced inflammation model and a CO-releasing molecule 3 treatment model. CCK-8 assay was used to measure cell viability；quantitative real-time PCR（qPCR） was used to measure the expression levels of the inflammatory cytokines interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6），and tumor necrosis factor-α（TNF-α）； tube formation assay and 5-ethynyl-2-deoxyuridine（EdU） proliferation assay were used to assess endothelial function. Neonatal mice were used to establish a model of LPS-induced acute lung injury and a CO treatment model. HE staining was used to observe lung histopathological changes，and qPCR and ELISA were used to measure the levels of inflammatory cytokines in lung tissue. Transcriptome data from the Gene Expression Omnibus database were used to analyze differentially expressed genes and pathway enrichment； molecular docking was used to predict protein-protein interaction sites；qPCR and Western blotting were used to measure the expression levels of SAA3 and TLR4，as well as the mRNA expression levels of inflammatory cytokines after Saa3 knockdown. Results Compared with the LPS group，CO treatment significantly inhibited the mRNA expression of Il-1β（4.677±0.259），Il-6（3.405±0.307），and Tnf-α（4.601±0.263） without reducing cell viability（P0.001） and reversed LPS-induced impairment in tube formation（branch points：6 hours：192.333±9.609，P=0.005；12 hours：351.333±16.258，P=0.001；24 hours：451.000±25.000，P=0.012；capillary length：6 hours：3 606.333±133.770，P=0.002；12 hours：4 814.333±73.228，P=0.014；24 hours：5 480.000±196.726，P=0.015） and proliferation inhibition（0.640±0.039，P=0.005）. In vivo experiments showed that compared with the LPS group，CO treatment significantly alleviated LPS-induced histological damage and reduced the mRNA and protein expression levels of the inflammatory cytokines IL-1β，IL-6，and TNF-α in lung tissue（mRNA expression：Il-1β：18.090±0.406；Il-6：6.532±0.356；Tnf-α：9.654±0.213；protein expression：IL-1β：353.335±29.279 pg/mL；IL-6：1 759.241±200.466 pg/mL；TNF-α：449.698±25.686 pg/mL）（P0.001）. Transcriptome analysis showed that Saa3 was the most significantly upregulated gene upon LPS stimulation，with significant enrichment of the TLR signaling pathway. Molecular docking showed a potential high-affinity interaction between SAA3 and TLR4. Further experiments showed that CO could downregulate the mRNA and protein expression levels of SAA3 and TLR4 induced by LPS（mRNA expression：Saa3：3.083±0.265；Tlr4：3.838±0.317，P0.001；protein expression：SAA3：1.164±0.110；TLR4：1.178±0.123，P0.01），while Saa3 knockdown significantly attenuated the transcriptional activation of the proinflammatory cytokines Il-1β，Il-6，and Tnf-α（17.020±2.683，14.012±1.954，and 8.229±1.936，respectively，P0.001）. Conclusion CO can alleviate LPS-induced endothelial inflammation and functional impairment and attenuate acute lung injury in neonatal mice，and CO may exert this protective effect by suppressing the SAA3-TLR4 signaling axis，which provides mechanistic evidence for endothelial-targeted anti-inflammatory intervention in neonatal acute respiratory distress syndrome.

Graphical abstract

关键词

一氧化碳 / 新生儿急性呼吸窘迫综合征 / 血清淀粉样蛋白A / Toll样受体4

Key words

carbon monoxide / neonatal acute respiratory distress syndrome / serum amyloid A / Toll-like receptor 4

新生儿急性呼吸窘迫综合征（neonatal acute respiratory distress syndrome，NARDS）是引起新生儿重症呼吸衰竭的临床类型之一，其临床特征表现为急性起病的严重低氧血症与弥漫性肺损伤，导致较高的机械通气需求与不良结局风险^[1-2]。本课题组进行了1项覆盖中国58家三级新生儿重症监护病房的全国多中心研究，发现围产期NARDS在住院新生儿中的发生率约为1.44%，主要病因为肺炎、窒息与早发败血症^[3]。与此一致，国际前瞻性多中心队列研究亦显示NARDS约占新生儿重症监护病房入院患儿的1.5%，近期住院生存率虽总体可观，但不同亚型呈现差异化的临床轨迹与结局^[4]。从机制层面看，急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的核心病理基础是肺泡-毛细血管屏障破坏与通透性增高^[5-6]，其中肺微血管内皮细胞并非被动的受害者，而是通过屏障功能失衡、炎症放大、凝血-炎症耦联与白细胞黏附迁移等过程，驱动肺水肿与气体交换障碍^[7-8]。在儿童ARDS中，血浆内皮活化相关生物标志物可区分不同损伤类型并与不良预后相关，进一步提示内皮靶向策略在以感染/炎症为主导的ARDS（包括新生儿类型）中具有潜在转化价值^[9-10]。

近年来，一氧化碳（carbon monoxide，CO）已从传统毒性气体被重新认识为血红素加氧酶-1介导的内源性细胞保护效应分子^[11]，可通过调控线粒体功能与细胞信号转导，产生抗炎^[12]、抗氧化^[13]、抗凋亡^[14]及组织保护^[15]作用。在课题组前期的临床研究中，对患有肺炎的足月新生儿进行了低浓度CO吸入治疗。结果显示，浓度≤60 mg/L的吸入给药方案在发挥抗炎及减轻氧化应激效应的同时，表现出良好的安全性^[16]。同时，CO释放分子（CO-releasing molecules，CORMs）作为一种可实现缓慢稳定释放CO的药理学工具，逐渐成为研究重点^[17]。以CO释放分子3（CO-releasing molecule 3，CORM-3）为代表的水溶性钌羰基复合物，在多种急性损伤模型中显示出降低肺水肿与组织学损伤的效应^[18]。在ARDS所致的内皮炎症与屏障损伤病理背景下，系统解析CO的关键分子靶点及其调控通路，是评估其潜在临床转化价值的必要前提。

基于上述背景，本研究提出并验证了CO在NARDS炎症损伤中的一种潜在保护机制：CO通过抑制血清淀粉样蛋白A3（serum amyloid A3，SAA3）-Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）信号轴，降低炎症介质的产生与释放，从而减轻脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的内皮炎症反应与肺损伤。该发现为CO相关肺保护效应提供了可验证的分子机制线索，并为进一步探索靶向CO递送策略提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

LPS购自美国Sigma-Aldrich公司（货号：L2630），CORM-3购自美国Sigma-Aldrich公司（货号：SML0496）。细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自美国APExBIO公司（货号：K1018）。SteadyPure快速RNA提取试剂盒（货号：AG21023）、Evo M-MLV逆转录预混试剂盒（货号：AG11734）、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（货号：AG11733）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。EdU-488细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司（货号：C0072S）。Mouse IL-1β ELISA Kit（货号：CME0015）、Mouse IL-6 ELISA Kit（货号：CME0006）、Mouse TNF-α ELISA Kit（货号：CME0004）购自北京四正柏生物科技有限公司。SAA3抗体购自英国Abcam公司（货号：ab231680），TLR4抗体（货号：19811-1-AP）、β-Actin抗体（货号：20536-1-AP）、HRP标记山羊抗兔二抗（货号：RGAR001）购自武汉三鹰技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理

小鼠肺微血管内皮细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司（货号：CP-M001），使用专用培养基，并于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中常规培养。CORM-3先溶于二甲基亚砜，再用DMEM高糖培养基稀释至工作浓度。细胞实验常规分组：CON组（空白对照组，未做任何处理）、LPS组（1 μg/mL LPS）、CO组（1 μg/mL LPS+60 μmol/L CORM-3）。

1.2.2 动物实验

本研究中所有动物实验操作均遵照国际实验动物护理评估和认证协会相关指南及ARRIVE 2.0指南执行，并已通过重庆医科大学动物伦理委员会审查批准（批准号：IACUC-CQMU-2025-04037）。

LPS诱导的新生儿小鼠急性肺损伤模型构建 从重庆医科大学动物中心购入SPF级C57BL/6成年小鼠（6~8周龄），饲养于该校袁家岗校区实验动物中心。按雌雄比例2∶1合笼饲养，以获得6日龄新生鼠。所有小鼠均饲养于无特定病原体条件下，维持12 h光/暗循环，自由摄食饮水。母鼠在分笼后继续饲养，新生仔鼠由母鼠哺乳至6日龄。LPS组小鼠经腹腔注射LPS溶液。CON组小鼠给予等体积生理盐水腹腔注射。CO组于LPS注射1 h后经腹腔注射溶于无菌PBS中的CORM-3；CON组与LPS组注射等体积PBS。LPS干预24 h后，异氟醚吸入麻醉仔鼠，进行后续实验。

1.2.3 肺组织苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色

取各组新鲜肺组织，于4%多聚甲醛中4 ℃固定过夜，依次经脱水、石蜡包埋、切片后进行HE染色，封片并使用SLIDEVIEW™ VS200 Research Slide Scanner扫描观察肺组织病理形态变化。

1.2.4 细胞活力检测（CCK-8法）

将小鼠内皮细胞以每孔1×10⁴个的密度接种于96孔板中，于标准条件下培养12 h使其充分贴壁。随后，按实验设计进行分组处理。处理结束后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h。使用Infinite^® 200 PRO酶标仪在450 nm波长下检测各孔的吸光度。细胞活力以相对于未处理对照组的百分比表示，吸光度值与活细胞数量成正比。

1.2.5 RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）

使用SteadyPure快速RNA提取试剂盒提取样本总RNA，使用Evo M-MLV逆转录预混试剂盒合成cDNA。随后使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒在CFX Connect实时荧光定量PCR系统上进行扩增检测。通过2^-ΔΔCT法计算目标基因mRNA的相对表达量，并以β-actin为内参基因进行标准化。引物均由深圳华大基因股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.6 成管实验

将小鼠肺微血管内皮细胞接种于预先凝固的Matrigel基质胶（250 μL/孔，24孔板）上，每孔加入1×10⁵细胞，37 °C培养箱中培养6、12、24 h，观察细胞形成管状结构的情况，使用荧光显微镜拍摄图像。管状结构的数量和分支长度通过ImageJ软件进行定量分析。

1.2.7 5-乙炔基-2-脱氧尿苷（5-ethynyl-2-deoxyuridine，EdU）细胞增殖检测

细胞接种于6孔板中，处理结束后按EdU-488细胞增殖检测试剂盒说明加入EdU工作液（终浓度10 μmol/L），37 °C孵育2 h。随后用PBS洗涤并用4%多聚甲醛室温固定15 min，0.3% Triton X-100通透10 min。配制Click反应液，室温避光反应30 min。细胞经DAPI核染后封片并在荧光显微镜下成像。EdU阳性细胞比例（EdU⁺/DAPI⁺）用于评估细胞增殖水平。

1.2.8 公共数据库RNA-seq数据处理

本研究基于高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取小鼠内皮细胞RNA-seq原始表达矩阵（对照组n=3，炎症组n=3），在R环境中读入数据并构建分组信息。采用DESeq2进行差异表达分析，差异基因判定为padj0.05且|log₂FoldChange| 1（富集分析部分采用|log₂FoldChange|2）。样本整体表达结构通过方差稳定变换后的主成分分析评估，热图、火山图展示差异表达结果。功能注释与通路分析使用clusterProfiler与org.Mm.eg.db完成，基于按log₂FoldChange排序的全基因列表开展基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路的基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）（nPerm=10 000），重点评估Toll-like receptor signaling pathway（mmu04620）的富集情况。

1.2.9 分子对接

本研究通过AlphaFold 3预测小鼠SAA3与TLR4的复合物结构，进行分子对接分析。使用PRODIGY计算复合物的结合自由能并进一步推算对应的解离常数；同时利用PDBePISA对复合物界面进行解析，计算界面/埋藏表面积、界面相互作用特征（如氢键、盐桥等）及相关能量项。

1.2.10 酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

按照制造商说明书，使用ELISA试剂盒检测小鼠肺组织中白细胞介素1β（interleukin 1 beta，IL-1β）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的浓度。

1.2.11 蛋白质免疫印迹

采用含PMSF及蛋白酶抑制剂（上海碧云天生物技术股份有限公司）的RIPA裂解缓冲液（上海碧云天生物技术股份有限公司）裂解细胞或组织蛋白，冰上裂解5 min后于4 ℃、12 000×g离心3 min，收集上清液，按4∶1体积比加入5×SDS上样缓冲液（上海雅酶生物医药科技有限公司），混匀后100 ℃变性10 min。所有免疫印迹分析均以12.5% SDS-PAGE（上海雅酶生物医药科技有限公司）分离蛋白，转移至0.45 μm PVDF膜（美国Sigma公司），在室温下用快速封闭液（上海雅酶生物医药科技有限公司）封闭1 h，并根据分子量切膜后，分别加入相应一抗进行孵育过夜，用相应二抗室温孵育1 h。最后，使用OI600型全自动化学发光成像系统采集蛋白印迹信号。

1.3 统计学方法

所有数据通过GraphPad Prism 9.5软件进行统计分析。满足正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，2组数据进行比较时选用独立样本t检验进行分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 CORM-3治疗浓度的确定及LPS诱导的内皮反应模型建立

为评估CORM-3的细胞毒性，本课题组采用浓度梯度（0、30、60、90和120 μmol/L）的CORM-3处理小鼠肺微血管内皮细胞（以下简称内皮细胞）。CCK-8实验显示，在一定浓度范围内，CORM-3处理未对内皮细胞活力产生明显抑制作用（0 μmol/L组：1.000±0.028；30 μmol/L组：0.973±0.016；60 μmol/L组：0.960±0.026；各组间两两比较均P0.050），当浓度高于60 μmol/L时，CORM-3会显著抑制细胞活性（60 μmol/L组：0.960±0.026；90 μmol/L组：0.652±0.033；120 μmol/L组：0.441±0.035；各组间两两比较均P0.001）（图1A）。

在此基础上，本课题组进一步在LPS刺激条件下评估CORM-3的抗炎效果。qPCR结果显示，与LPS共处理的CORM-3可明显抑制炎症因子Il-1β、Il-6、Tnf-α的mRNA表达水平。其中，60 μmol/L CORM-3在不影响细胞活力的前提下，对炎症因子的抑制作用最为显著（Il-1β：0 μmol/L组1.000±0.032；60 μmol/L组 0.394±0.028；F=260.6；P0.001；Il-6：0 μmol/L组 1.000±0.044；60 μmol/L组0.559±0.040；F=107.1；P0.001；Tnf-α：0 μmol/L组1.000±0.039；60 μmol/L组0.454±0.039；F=184.3；P0.001），因此，该浓度被选为后续实验的治疗浓度（图1B~D）。

随后，本课题组采用CCK-8法和炎症因子qPCR检测，对CON组、LPS组和CO组内皮细胞模型进行验证。结果表明，与CON组相比，LPS处理显著降低细胞活力[CON组：（1.000±0.028）；LPS组：（0.757±0.035）；P0.001]并诱导炎症因子高表达[Il-1β：CON组：（1.000±0.038）；LPS组：（7.521±0.261）；P0.001；Il-6：CON组：（1.000±0.071）；LPS组：（5.323±0.244）；P0.001；Tnf-α：CON组：（1.000±0.096）；LPS组：（11.551±0.339）；F=2 672；P0.001]；而CO处理可显著改善LPS诱导的细胞活力下降[LPS组：（0.757±0.035）；CO组：（0.897±0.025）；P0.001]并抑制炎症反应[Il-1β：LPS组：（7.521±0.261）；CO组：（4.677±0.259）；P0.001；Il-6 LPS组：（5.323±0.244）；CO组：（3.405±0.307）；P0.001；Tnf-α：LPS组：（11.551±0.339）；CO组：（4.601±0.263）；P0.001]。单因素方差分析显示，Il-1β（F=135.6）、Il-6（F=1 412）、Tnf-α（F=533.3）各组间差异有统计学意义（图2A~D）。

2.2 CO恢复LPS诱导的内皮细胞血管生成障碍并促进细胞增殖

为进一步评估CO对内皮细胞功能的影响，本课题组采用体外基质成管实验检测不同处理条件下内皮细胞的血管生成能力。分别在6 h、12 h和24 h时间点对CON组、LPS组及CO组细胞进行成管观察与定量分析。结果显示，与CON组相比，LPS处理显著抑制内皮细胞成管能力，表现为分支点数量[6 h：CON组：（271.333±15.631）；LPS组：（122.000±13.454）；P0.001；12 h：CON组：（435.000±21.656）；LPS组：（224.000±17.349）；P0.001；24 h：CON组：[（564.667±15.535）；LPS组：（316.333±8.737），P0.001]和毛细血管长度[6 h：CON组：（4 406.667±161.290）；LPS组：（2 197.333±207.399）；P0.001；12 h：CON组：（5 443.000±242.539）；LPS组：（3 774.333±207.965）；P=0.002；24 h：CON组：（7 895.667±61.720）；LPS组：（4 298.333±299.109）；P=0.002]明显减少；而CO处理可显著逆转LPS诱导的成管障碍，在多个时间点均表现出分支点数量[6 h：LPS组：（122.000±13.454）；CO组：（192.333±9.609）；P=0.005；12 h：LPS组：（224.000±17.349）；CO组：（351.333±16.258）；P=0.001；24 h：LPS组：（316.333±8.737）；CO组：（451.000±25.000）；P=0.012]和毛细血管长度[6 h：LPS组：（2 197.333±207.399）；CO组：（3 606.333±133.770）；P=0.002；12 h：LPS组：（3 774.333±207.965）；CO组：（4 814.333±73.228）；P=0.014；24 h：LPS组：（4 298.333±299.109）；CO组：（5 480.000±196.726）；P=0.015]显著增加（图3A）。

本研究通过EdU实验检测内皮细胞的增殖活性。结果显示，与CON组相比，LPS处理显著降低EdU阳性细胞比例，提示细胞增殖能力受损[CON组：（0.755±0.011）；LPS组：（0.485±0.052）；P0.001]；而在LPS处理基础上加入CO后，EdU阳性细胞比例显著升高[LPS组：（0.485±0.052）；CO组：（0.640±0.039）；P=0.005]。单因素方差分析显示，各组间差异有统计学意义（F=38.69）（图3B）。

2.3 CO在新生小鼠中减轻LPS诱导的肺组织损伤及炎症反应

为验证CO在体内的保护作用，本课题组建立了新生小鼠LPS诱导的肺损伤模型。对6~7日龄C57BL/6仔鼠进行腹腔注射LPS（5 mg/kg），并给予或不给予CORM-3（4 mg/kg）处理24 h。HE染色结果显示，与CON组相比，LPS处理导致肺组织结构明显破坏，伴随显著出血和炎症改变；而CO治疗后，肺组织出血程度明显减轻，整体组织结构得到改善（图4A）。

接着检测肺组织中炎症因子的表达水平。qPCR结果显示，LPS处理显著上调肺组织中Il-1β、Il-6和Tnf-α的mRNA相对表达量[Il-1β：CON组：（1.000±0.028）；LPS组：（26.261±0.316）；P0.001；Il-6：CON组：（1.000±0.021）；LPS组：（14.330±0.363）；P0.001；Tnf-α：CON组：（1.000±0.016）；LPS组：（17.583±0.283）；P0.001]，而CO治疗可显著抑制上述炎症因子的转录水平[Il-1β：LPS组：（26.261±0.316）；CO组：（18.090±0.406）；P0.001；Il-6：LPS组：（14.330±0.363）；CO组：（6.532±0.356）；P0.001；Tnf-α：LPS组：（17.583±0.283）；CO组：（9.654±0.213）；P0.001]。单因素方差分析显示，Il-1β（F=11 250）、Il-6（F=3 117）、Tnf-α（F=9 840）各组间差异有统计学意义（图4B~D）。

与此同时，ELISA检测结果显示，LPS处理显著升高肺组织中炎症因子的蛋白水平。与CON组比较，LPS组IL-1β水平由（74.340±3.725） pg/mL升高至（926.647±37.625） pg/mL（P0.001），IL-6水平由（1 173.755±132.009） pg/mL升高至（2 566.920±255.564） pg/mL（P0.001），TNF-α水平由（173.128±24.863） pg/mL升高至（772.649±35.484） pg/mL（P0.001）。CO处理后，上述炎症因子蛋白水平较LPS组明显降低，其中IL-1β由（926.647±37.625）pg/mL降至（353.335±29.279） pg/mL（P0.001），IL-6由（2 566.920±255.564） pg/mL降至（1 759.241±200.466） pg/mL（P0.001），TNF-α由（772.649±35.484） pg/mL降至（449.698±25.686） pg/mL（P0.001）。单因素方差分析显示，IL-1β（F=1 486）、IL-6（F=71.65）、TNF-α（F=638.8）各组间差异均有统计学意义（图4E~G）。

2.4 GEO转录组分析鉴定Saa3为炎症诱导内皮炎症的关键差异基因

为从转录组层面检索LPS诱导内皮炎症的核心分子事件，本课题组下载并分析了GEO数据集GSE291989。该实验分别使用生理盐水（对照组）和铜绿假单胞菌（炎症组）处理21~24 d或8~10周的小鼠并提取肺内皮细胞进行转录组测序，本课题组选取P21~P24的数据集进行分析。主成分分析评估样本整体表达谱的组间差异，结果显示对照组与炎症组在主成分空间中明显分离，提示炎症刺激引起内皮细胞转录组发生显著重塑，且组内聚类良好，数据重复性较高（图5A）。差异基因表达热图显示对照组与炎症组在多基因层面存在一致且清晰的表达模式差异（图5B）。火山图展示了差异基因的整体分布特征，其中编码血清淀粉样蛋白A3的基因Saa3位于差异倍数最大且统计学差异最显著的区域，提示其可能是炎症诱导内皮炎症反应的关键差异基因（图5C）。为进一步验证该基因在组间的表达变化，绘制了Saa3的小提琴图，结果显示炎症组Saa3表达显著高于对照组（图5D）。查阅文献发现，Saa3可激活Toll样受体信号通路，并与TLR4密切相关^[19-20]。通过GSEA发现，该通路在炎症组整体呈显著正向富集（图5E）；同样，KEGG富集结果亦显示该通路位列前15个显著富集通路，提示炎症刺激驱动的内皮炎症表型与TLR相关转录程序密切相关（图5F）。

2.5 CO通过调控SAA3-TLR4轴参与内皮炎症反应的调节

基于转录组分析结果，进一步探讨SAA3与TLR4的相互作用，通过AlphaFold 3预测的SAA3与TLR4复合物结构，进行分子对接分析，结果显示其结合自由能为-14.3 kcal/mol（图6）。

在内皮细胞模型中对TLR4和SAA3的表达水平进行验证：qPCR与Western blot结果显示，与CON组相比，LPS处理显著升高SAA3和TLR4的mRNA[Saa3：CON组：（1.000±0.033）；LPS组：（5.346±0.246）；P0.001；Tlr4：CON组：（1.000±0.023）；LPS组：（6.611±0.175）；P0.001]和蛋白质[SAA3：CON组：（1.000±0.070）；LPS组：（1.500±0.088）；P=0.001；TLR4：CON组：（1.000±0.101）；LPS组：（1.708±0.164）；P=0.001]表达水平；而在LPS处理基础上加入CO后，SAA3和TLR4的mRNA[Saa3：LPS组：（5.346±0.246）；CO组：（3.083±0.265）；P0.001；Tlr4 LPS组：（6.611±0.175）；CO组：（3.838±0.317）；P0.001]和蛋白质[SAA3：LPS组：（1.500±0.088）；CO组：（1.164±0.110）；P=0.009；TLR4：LPS组：（1.708±0.164）；CO组：（1.178±0.123）；P=0.006]表达水平均显著降低。单因素方差分析显示，Saa3（F=645.1）、Tlr4（F=1 077）、SAA3（F=23.59）、TLR4（F=23.27）各组间差异有统计学意义（图7A~C）。

为探究SAA3的功能作用，本课题组建立了Saa3基因敲低细胞模型。采用shRNA靶向Saa3进行转染，通过qPCR验证敲低效率。结果显示，与对照shRNA（sh-NC）组相比，sh-Saa3组中Saa3的mRNA表达水平显著降低[Saa3：sh-NC组：（1.000±0.227）；sh-Saa3组：（0.518±0.180）；t=4.081；P=0.002]，提示敲低模型构建成功（图8A）。在Saa3敲低条件下对内皮细胞进行LPS刺激，并检测炎症因子的表达变化。qPCR结果显示，与sh-NC+LPS组相比，sh-Saa3+LPS组LPS诱导的Il-1β、Il-6和Tnf-α的mRNA表达水平显著降低[Il-1β：sh-NC+LPS组：（26.144±3.752）；sh-Saa3+LPS组：（17.020±2.683）；P0.001；Il-6：sh-NC+LPS组：（25.414±2.866）；sh-Saa3+LPS组：（14.012±1.954）；P0.001；Tnf-α：sh-NC+LPS组：（16.446±2.161）；sh-Saa3+LPS组：（8.229±1.936）；P0.001]。单因素方差分析显示，Il-1β（F=156.5）、Il-6（F=254.3）、Tnf-α（F=127.2）各组间差异有统计学意义（图8A~D）。

3 讨 论

在急性呼吸窘迫综合征的炎症网络中，急性期反应蛋白SAA家族正从旁观型生物标志物逐步被重新认识为可直接参与免疫放大与血管稳态调控的效应分子^[21-24]。SAA可通过多受体并行的方式触发丝裂原活化蛋白激酶与核因子κB等关键信号轴，并与Th17细胞-白细胞介素17相关炎症回路形成正反馈，从而可能在肺部炎症持续与微血管屏障失衡中占据枢纽位点^[25-26]。同时，SAA在重症病毒性肺炎及ARDS样表型中与疾病严重度和不良结局呈显著相关，因而可作为反映肺部高炎症状态及内皮应激损伤的敏感指标^[27-29]。然而，在脂多糖驱动的肺微血管内皮细胞炎症中，SAA（尤其是SAA3）究竟主要充当上游促炎放大器，还是下游效应分子，仍缺乏明确的机制证据。

TLR4作为模式识别受体，在肺微血管内皮细胞及多种免疫细胞表面高表达，暴露于LPS后可迅速招募接头蛋白髓样分化因子88并启动下游信号级联反应，从而驱动Il-1β、Il-6和Tnf-α等促炎细胞因子及多类趋化因子的转录上调，导致炎症放大与细胞损伤^[30-34]。与此同时，TLR4相关激活还可诱导内皮细胞功能障碍，促进黏附分子表达增加并破坏屏障完整性，最终引发肺泡–毛细血管屏障破坏、蛋白质渗出性水肿以及呼吸功能受损^[35-37]。既往研究亦不断证实TLR4信号轴在LPS诱导肺损伤中的核心驱动作用：抑制TLR4可显著减轻炎症介质释放、肺组织病理损伤及毛细血管渗漏，而通路持续激活则与更严重的炎症级联和组织破坏相关^[38-40]。值得注意的是，除经典的肺泡巨噬细胞外，越来越多的证据提示肺微血管内皮细胞的TLR4依赖性信号同样参与损伤早期的炎症启动与放大过程^[41-43]。

在此背景下，本研究揭示了CO在LPS诱导的急性肺损伤相关模型中可显著改善内皮炎症表现，并提出其通过调控SAA3–TLR4信号轴发挥抗炎作用的潜在机制。本研究结果显示，CO能够明显抑制LPS刺激下IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达上调，同时显著恢复内皮细胞增殖能力及管腔形成能力，提示其不仅可抑制炎症反应放大，也可能改善内皮修复与再生相关功能。这些发现为CO相关干预在炎症性肺损伤，尤其是新生儿呼吸窘迫综合征中的潜在应用提供了实验依据，并为CO介导的肺保护策略进一步向临床转化提供了理论支持。

但SAA3在LPS诱导的内皮炎症中的作用此前尚未得到充分阐明，本研究通过转录组分析明确了Saa3为关键差异表达基因，并提示其与TLR信号通路密切相关。分子对接分析提示SAA3与TLR4具有潜在相互作用界面，而基因敲低实验进一步验证了Saa3在LPS诱导内皮炎症应答中的促进作用。同时，本课题组发现CO可通过抑制SAA3-TLR4轴的表达，进而显著缓解LPS诱导的内皮炎症反应。上述结果共同支持：SAA3–TLR4轴可能是连接LPS刺激与内皮炎症放大的关键节点，而CO对该轴的调控构成其肺保护作用的重要分子基础。这一发现不仅拓展了对SAA3在内皮炎症中功能的理解，也为未来开发靶向SAA3-TLR4信号轴的干预策略提供了新的理论依据与潜在靶点。

但需要注意的是，本研究主要观察短期效应，CO在更长时间窗内的持续疗效、安全性及潜在不良反应仍需系统评估。转录组结果支持SAA3与TLR4通路相关，但二者的直接因果关系与关键调控节点尚未明确，后续可借助CRISPR/Cas9等手段进行靶向验证与功能回补。

未来研究可聚焦于建立长期给药与随访体系以界定最佳剂量与干预窗口以及拓展机制解析以判断CO是否同时调控其他炎症及屏障稳态网络。总体而言，本研究为CO的肺保护作用提供了机制线索，并为后续靶向抗炎策略的开发奠定基础。

参考文献

[1] Liu H， Li J， Guo JY，et al. A prediction nomogram for neonatal acute respiratory distress syndrome in late-preterm infants and full-term infants：A retrospective study[J]. eClinicalMedicine，2022，50：101523．

[2] Yehya N， Fazelinia H， Lawrence GG，et al. Plasma nucleosomes are associated with mortality in pediatric acute respiratory distress syndrome[J]. Crit Care Med，2021，49（7）：1149-1158．

[3] Chen L， Li J， Shi Y. Clinical characteristics and outcomes in neonates with perinatal acute respiratory distress syndrome in China：A national，multicentre，cross-sectional study[J]. EClinicalMedicine，2022，55：101739．

[4] De Luca D， Tingay DG， van Kaam AH，et al. Epidemiology of neonatal acute respiratory distress syndrome：prospective，multicenter，international cohort study[J]. Pediatr Crit Care Med，2022，23（7）：524-534．

[5] Bos LDJ， Ware LB. Acute respiratory distress syndrome：causes，pathophysiology，and phenotypes[J]. Lancet，2022，400（10358）：1145-1156．

[6] Hogan G， Geoghegan P， Carroll TP，et al. α1-antitrypsin：key player or bystander in acute respiratory distress syndrome?[J]. Anesthesiology，2021，134（5）：792-808．

[7] Vassiliou AG， Kotanidou A， Dimopoulou I，et al. Endothelial damage in acute respiratory distress syndrome[J]. Int J Mol Sci，2020，21（22）：8793．

[8] Whitney JE， Feng R， Koterba N，et al. Endothelial biomarkers are associated with indirect lung injury in sepsis-associated pediatric acute respiratory distress syndrome[J]. Crit Care Explor，2020，2（12）：e0295．

[9] Upadhyay M， Nelson D， Phillips M，et al. Regulation of endothelial cell death in inflammatory lung injury[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2025. 74（5）：575-589.

[10] Yang ZS， Nicholson SE， Cancio TS，et al. Complement as a vital nexus of the pathobiological connectome for acute respiratory distress syndrome：An emerging therapeutic target[J]. Front Immunol，2023，14：1100461．

[11] Bauer N， Mao QY， Vashistha A，et al. Compelling evidence：a critical update on the therapeutic potential of carbon monoxide[J]. Med Res Rev，2025，45（4）：1275-1301．

[12] Appetecchia F， Consalvi S， Berrino E，et al. A novel class of dual-acting DCH-CORMs counteracts oxidative stress-induced inflammation in human primary tenocytes[J]. Antioxidants （Basel），2021，10（12）：1828

[13] Park J， Zheng M， Gong JH，et al. CO-PERK-IRG1 axis attenuates oxidative stress and ferroptosis in hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. Free Radic Biol Med，2025，240：253-266．

[14] Zhang JY， Liu LW， Dong Z，et al. An ischemic area-targeting，peroxynitrite-responsive，biomimetic carbon monoxide nanogenerator for preventing myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. Bioact Mater，2023，28：480-494．

[15] Kwong AM， Luke PPW， Bhattacharjee RN. Carbon monoxide mechanism of protection against renal ischemia and reperfusion injury[J]. Biochem Pharmacol，2022，202：115156．

[16] 王　灿，蔡康兴，陈　龙，等. 基于随机双盲安慰剂对照试验的一氧化碳吸入疗法在新生儿肺炎应用的安全性研究[J]. 中国循证儿科杂志，2015，10（3）：171-175．

[17] Wang C， Cai KX， Chen L，et al. Safety and feasibility of inhaled carbon monoxide treatment for neonates with stabilized pneumonia：a randomized-blinded study[J]. Chin J Evid Based Pediatr，2015，10（3）：171-175．

[18] Ryter SW. Therapeutic potential of heme oxygenase-1 and carbon monoxide in acute organ injury，critical illness，and inflammatory disorders[J]. Antioxidants，2020，9（11）：1153．

[19] Bai J， Bai Y， Wang XP，et al. Carbon monoxide-releasing molecule-3 ameliorates acute lung injury in a model of hemorrhagic shock and resuscitation：roles of p38MAPK signaling pathway[J]. Shock，2021，55（6）：816-826．

[20] Li ML， Kim YM， Koh JH，et al. Serum amyloid A expression in liver promotes synovial macrophage activation and chronic arthritis via NFAT5[J]. J Clin Investig，2024，134（5）：e167835．

[21] Yan YY， Wang HY， Deng HZ，et al. Porphyromonas gingivalis OMVs inhibit osteogenic differentiation of BMSCs via SAA3/TLR4/MyD88/NF-κB axis[J]. J Oral Microbiol，2025，17（1）：2540823．

[22] Papareddy P， Herwald H. From immune activation to disease progression：Unraveling the complex role of Serum Amyloid A proteins[J]. Cytokine Growth Factor Rev，2025，83：77-84．

[23] Mohanty T， Miličević K， Göthert H，et al. Balancing inflammation：the specific roles of serum amyloid A proteins in sterile and infectious diseases[J]. Front Immunol，2025，16：1544085．

[24] Liu XL， Song YM， Hu SL，et al. Serum amyloid A contributes to radiation-induced lung injury by activating macrophages through FPR2/Rac1/NF-κB pathway[J]. Int J Biol Sci，2024，20（12）：4941-4956．

[25] Yang XY， Liu Y， Li W，et al. Serum amyloid A3 aggravates bleomycin-induced pulmonary fibrosis through Krüppel-like factor 6-dependent interleukin-36α expression[J]. Acta Pharmacol Sin，2025，46（12）：3244-3256．

[26] Qian H， Yang HL， Li X，et al. Andrographolide sulfonate attenuates alveolar hypercoagulation and fibrinolytic inhibition partly via NF-κB pathway in LPS-induced acute respiratory distress syndrome in mice[J]. Biomed Pharmacother，2021，143：112209．

[27] Ni JL， Wang FJ， Wu YC，et al. B. adolescentis alleviates inflammation and suppresses PGE2 through remodling gut microbiota to attenuate pulmonary fibrosis in aging mice[J]. NPJ Sci Food，2025，9（1）：251．

[28] Beijer E， Roodenburg-Benschop C， Schimmelpennink MC，et al. Elevated serum amyloid a levels are not specific for sarcoidosis but associate with a fibrotic pulmonary phenotype[J]. Cells，2021，10（3）：585．

[29] Sorić Hosman I， Kos I， Lamot L. Serum amyloid a in inflammatory rheumatic diseases：a compendious review of a renowned biomarker[J]. Front Immunol，2021，11：631299．

[30] Evren G， Er E， Yalcinkaya EE，et al. Electrospun nanofibers including organic/inorganic nanohybrids：polystyrene- and clay-based architectures in immunosensor preparation for serum amyloid A[J]. Biosensors，2023，13（7）：673．

[31] 罗　陈，杨　燕，令狐莉，等. 野马追倍半萜内酯对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的保护作用研究[J]. 重庆医科大学学报，2025，50（7）：889-897．

[32] Luo C， Yang Y， Linghu L，et al. Study on the protective effect of sesquiterpene lactones of Eupatorium lindleyanum DC. on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats[J]. J Chongqing Med Univ，2025，50（7）：889-897．

[33] Ma DY， Peng LF， Gao XY，et al. Solidago decurrens Lour. controls LPS-induced acute lung injury by reducing inflammatory responses and modulating the TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway[J]. J Ethnopharmacol，2025，352：120172．

[34] Oh J， Kwon TW， Choi JH，et al. Ginsenoside-Re inhibits experimental autoimmune encephalomyelitis as a mouse model of multiple sclerosis by downregulating TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathways[J]. Phytomedicine，2024，122：155065．

[35] Xing YY， Zheng YK， Yang S，et al. Artemisia ordosica polysaccharide alleviated lipopolysaccharide-induced oxidative stress of broilers via Nrf2/Keap1 and TLR4/NF-κB pathway[J]. Ecotoxicol Environ Saf，2021，223：112566．

[36] Xing YY， Zheng YK， Chen L，et al. Artemisia ordosica polysaccharides enhance antioxidant capacity of peripheral blood lymphocytes in poultry through Nrf2/Keap1 and TLR4/NF-κB signal pathway[J]. Antioxidants，2024，13（11）：1308．

[37] Wu YH， Yu X， Wang YW，et al. Ruscogenin alleviates LPS-triggered pulmonary endothelial barrier dysfunction through targeting NMMHC IIA to modulate TLR4 signaling[J]. Acta Pharm Sin B，2022，12（3）：1198-1212．

[38] Karki P， Ke YB， Zhang CO，et al. GPR68 mediates lung endothelial dysfunction caused by bacterial inflammation and tissue acidification[J]. Cells，2024，13（24）：2125．

[39] 张令轩，李　萌，宋　歌，等. 慢性烟曲霉暴露对支气管哮喘大鼠气道Toll样受体4表达的影响[J]. 重庆医科大学学报，2025，50（12）：1702-1709．

[40] Zhang LX， Li M， Song G，et al. Effect of chronic Aspergillus fumigatus exposure on the expression of Toll-like receptor 4 in the airway of rats with bronchial asthma[J]. J Chongqing Med Univ，2025，50（12）：1702-1709．

[41] 李克锋，徐　昉. 右美托咪定调控巨噬细胞TLR4/ACOD1免疫代谢偶联减轻小鼠急性肺损伤实验研究[J]. 重庆医科大学学报，2025，50（1）：65-71．

[42] Li KF， Xu F. Dexmedetomidine alleviates acute lung injury in mice by regulating Toll-like receptor 4/aconitate decarboxylase 1 immune metabolism coupling in macrophages：an experimental study[J]. J Chongqing Med Univ，2025，50（1）：65-71．

[43] Song LJ， Shi XF， Kovacs L，et al. Calpain promotes LPS-induced lung endothelial barrier dysfunction via cleavage of talin[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2023，69（6）：678-688．

[44] Sayers I， Thakker D， Billington C，et al. Interleukin-1 receptor-associated kinase 4 （IRAK4） is a critical regulator of inflammatory signalling through toll-like receptors 4 and 7/8 in murine and human lungs[J]. Br J Pharmacol，2024，181（22）：4647-4657．

[45] Fu Y， Gong T， Loughran PA，et al. Roles of TLR4 in macrophage immunity and macrophage-pulmonary vascular/lymphatic endothelial cell interactions in sepsis[J]. Commun Biol，2025，8：469．

[46] Zhang LH， Gao S， White Z，et al. Single-cell transcriptomic profiling of lung endothelial cells identifies dynamic inflammatory and regenerative subpopulations[J]. JCI Insight，2022，7（11）：e158079．

[47] Zhang K， Qin X， Qiu JH，et al. Desulfovibrio desulfuricans aggravates atherosclerosis by enhancing intestinal permeability and endothelial TLR4/NF-κB pathway in Apoe ^-/- mice[J]. Genes Dis，2021，10（1）：239-253．

基金资助

重庆医科大学附属儿童医院学科登峰计划临床研究专项揭榜挂帅项目