膀胱癌是泌尿系最常见的肿瘤，也是全球第十大恶性肿瘤。2015年，我国新增膀胱癌病例82 300例，并有膀胱癌死亡病例33 700例
[1]。20世纪90年代开始，我国居民膀胱癌发病率整体呈上升趋势
[2]。膀胱癌根据进展程度的不同，分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）
[3]。NMIBC的特点是癌细胞仅限于膀胱内黏膜或黏膜下层，未侵犯膀胱壁的肌层。而MIBC癌细胞已经侵入膀胱壁的肌层或更深层，往往具有更高的复发率和更差的预后，其发病率约占膀胱癌的25%
[4]。
目前膀胱癌诊断的金标准是膀胱镜检查
[5]。然而膀胱镜检查具有侵入性，会给病人带来明显的痛苦，与感染、血尿等风险相关，并且检查昂贵，这影响了患者接受检查或监测的意愿
[6]。因此，需要开发高度准确、经济高效、快速和无痛的方法来诊断和检测膀胱癌。液体活检是一种非侵入性检测，在体液（例如尿液、血液等）中检测生物标志物，分析这些物质的特征来获取有关疾病状态的信息，被广泛应用于癌症的早期检测和监测
[7]。液体活检操作简单方便，能减少患者痛苦、降低患者的就医成本
[8]。本文概述了液体活检在膀胱癌诊断和监测的新进展。
1 膀胱癌液体活检的标志物
1.1 循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）
CTC是一种罕见的细胞类型，它们是从原发肿瘤中脱落的癌细胞，在体液中（通常是血液）流动，定植于其他器官，从而促成肿瘤的转移。CTCs在健康人的体液中很少出现，却能够在有实体肿瘤患者中被找到，所以CTCs对于癌症的诊断、预后评估和治疗监测都具有重要意义
[9]。CTCs的检测和分离是一项技术挑战，因为它们在血液中的数量非常稀少，而且它们的特性（如表面标志物）与周围正常细胞相似，因此难以将它们从血液中准确地鉴定和捕获。然而，随着技术的发展，已经有一些高灵敏度的方法可以检测和分离CTCs，例如细胞表面标志物的免疫磁珠分选、微流控技术和微小装置的使用等。通过在磁珠上装载CTCs对应的特异性抗体、微流控和针对细胞大小的过滤来富集CTCs，被富集的CTCs将用免疫荧光染色检测或单细胞测序分析所以CTCs成为膀胱癌液体活检有潜力的标志物
[10]。
Yang X等
[11]采用SE-iFISH方法富集和鉴定了CTCs，在196例膀胱癌患者中，有163例患者检测到阳性CTCs（83.2%），表明CTCs有希望用于膀胱癌的诊断。研究还发现在患者接受新辅助化疗之前患者循环中四倍体CTC和小细胞CTC数量与患者对新辅助治疗的敏感性呈正相关，这表明CTCs能指导患者治疗方案的选择。另外，Carrasco R等
[12]在对进行了MIBC根治性手术的患者的研究中发现，16名患者经历了复发，CTCs计数在10例中比影像学更早地预测到了复发（63%），表明CTCs可用于膀胱癌复发的监测。此外，与影像技术相比，CTCs的复发中位时间为120 d，而影像技术为255 d。Fu GH等
[13]开发了一种微流控方法，用于检测膀胱癌患者外周血中的CTCs。在涉及48名膀胱癌患者（33例NMIBC；15例MIBC）的队列研究中，用于区分MIBC和NMIBC队列的AUC、敏感性和特异性分别为0.707、80.0%和66.7%。因此，本研究认为CTCs的微流控分析是膀胱癌风险评估中有用的辅助手段。
1.2 循环肿瘤DNA
人体内所有细胞都会排出DNA片段，这些排出细胞的DNA片段被称为细胞游离DNA（cell free DNA，cfDNA），循环系统中的cfDNA则被称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）
[14]。肿瘤细胞会将ctDNA释放到血液中，通过检测这些ctDNA，可以揭示肿瘤的基因构成。ctDNA分析具有高灵敏度和特异性，能够实时检测肿瘤特异性突变和修饰，因此已成为一种有望用于非侵入性癌症诊断、监测和治疗反应评估的方法
[15]。
ctDNA可以在各种体液中检测到，如血液、尿液和脑脊液，可以使用多种方法进行分离和分析，包括下一代测序（next generation sequencing，NGS）和数字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR），NGS是一种高效率的分析方法，能够同时运行数百万个序列以全面检测突变，而dPCR针对特定引物，相较于NGS更准确
[16-17]。ctDNA分析可以提供有关肿瘤的遗传异质性、克隆演变和耐药机制的信息，有助于指导个性化和靶向治疗的选择。因此，ctDNA分析在膀胱癌研究中引起了相当大的关注。目前，研究人员用于检测膀胱癌的ctDNA生物标志物包括DNA突变和DNA甲基化
[14，18]。
Jain M等
[19]进行了1项在尿液中检测TERT启动子突变的诊断效能的研究，该研究包括60例参与者，其中包括27例组织学确认的膀胱癌患者，23例对照组中无症状的个体，以及在提供尿液样本前3~6个月接受经尿道膀胱肿瘤切除术的10例“复查”患者。数据分析显示AUC为0.768，敏感性为55.56%，特异性为100%。值得注意的是，“复查”亚组中有4例患者检测到肿瘤DNA。因此，该研究表明利用尿液中的TERT启动子突变进行液体活检具有重要的诊断和监测膀胱癌的潜力。Ward DG等
[20]通过深度测序验证了使用尿液DNA分析检测膀胱癌的能力。尿液DNA突变分析对2个不同的血尿症状队列进行膀胱癌诊断，显示敏感性为87.3%，特异性为84.8%。此外，研究人员还检查了NMIBC患者的尿液DNA，能够以86.2%的敏感性和62.5%的特异性检测到膀胱癌复发。尽管团队在本研究中膀胱癌复发检测的特异性相对较低，但不能否认检测尿液DNA仍然是检测和监测膀胱癌的有效手段。Ruan WM等
[21]通过尿液DNA甲基化测试探讨了膀胱癌的检测和术前分层。在1项涵盖前瞻性和回顾性分析的单中心研究中，研究人员设置了3个患者队列：队列1（
n=192；疑似膀胱癌患者）和队列2（
n=98；疑似膀胱癌患者）作为试验队列，队列3（
n=174；血尿患者）作为验证队列。结果显示，双标记检测在队列2中表现出88.1%和91.2%的敏感性，在队列3中的特异性分别为89.7%和85.7%。此外，在队列2中，模型在检测高风险NMIBC和MIBC方面表现出90.5%的敏感性和86.8%的特异性。这表明DNA甲基化检测在膀胱癌的诊断、危险分层方面都有良好的表现。
1.3 细胞游离RNA
RNA在细胞内发挥着各种重要的生物学作用，是蛋白质合成、基因表达和遗传信息传递等过程的关键组成部分。细胞游离RNA（cfRNA）是脱离于细胞而存在于体液中的各种RNA分子，它们通过细胞代谢被释放入循环中。许多不同类型的cfRNA被认为是膀胱癌潜在的非侵入性液体活检生物标志物，包括mRNA、miRNA和lncRNA等。
mRNA是一种关键的单链核糖核酸分子，在蛋白质合成中发挥着重要作用。mRNA的变化可能导致细胞产生的蛋白质发生改变，这些变化可能与癌症的发展和进展有关，特定mRNA分子的表达谱在癌细胞和正常细胞之间存在差异
[22]。因此，在血液或尿液样本中检测mRNA可能作为膀胱癌的诊断工具。Xpert膀胱癌监测测试是一种基于mRNA的液体活检测试，采用PCR来测量在膀胱癌患者中经常过度表达的5个mRNA靶点（ABL1、CRH、IGF2、UPK1B和ANXA10）的水平。有研究人员使用Xpert分析了828名患者的尿液样本
[23]。结果显示，Xpert的总体敏感性为78%，对高级别肿瘤的敏感性为90%，总体阴性预测值为98%。Xpert表现出84%的特异性，在具有微观血尿的患者中，只有1个高级别患者被漏诊（阴性预测值为99%）。
miRNA是一类短的非编码RNA分子，通常约有18到25个核苷酸的长度。miRNA作为转录后调节因子，结合目标信使mRNA分子的3'非翻译区域（UTR），引起翻译抑制或mRNA的降解
[24]，对于肿瘤的发展、扩散和转移是至关重要的。通过采用qRT-PCR、NGS和FISH等技术，可以在血液和尿液中检测到miRNA
[25]。Li XJ等
[26]确定了1 个包括miR-181b-5p、miR-183-5p、miR-199-5p和miR-221-3p的诊断标志物组合，其AUC为0.893，敏感性为82.14%，特异性为83.33%。在另一项研究中，研究人员利用来自血清样本的miR-125b-5p、miR-182-5p和miR-200c-3p形成了1个诊断标志物组合，曲线下面积为0.959，敏感性为91.67%，特异性为92.5%
[27]。还有研究人员构建了1个由miR-27b-3p、miR-381-3p和miR-451a组成的诊断标志物
[28]，这3个miRNA标志物的曲线下面积为0.894，具有86.90%的敏感性和77.38%的特异性。
长链非编码RNA（lncRNA）是一类RNA分子家族，它们不编码蛋白质，长度超过200个核苷酸
[29]。尽管不编码蛋白质，但lncRNA可通过干扰转录、翻译等方式在细胞内发挥着关键的调节作用，并被证明在癌症发展中起到了重要的作用
[30]。Wang JR等
[31]确定了7个与免疫相关的lncRNAs（Z84484.1、AC009120.2、AL450384.2、AC024060.1、TNFRSF14-AS1、AL354919.2、OCIAD1-AS1），ROC曲线显示其在预测生存结果方面具有高准确性（AUC=0.734），表明lncRNA在膀胱癌预后分析中具有较高价值。
1.4 外泌体
外泌体，或称细胞外囊泡，是一种由细胞释放的小型膜包囊，直径通常在30~150 nm
[32]。它们的生成是通过细胞胞吐的过程进行的，涉及多囊体与细胞膜的融合，导致它们的内容物释放到细胞外环境
[33]。外泌体充当各种分子的载体，包括DNA、RNA、蛋白质和脂质，其载荷直接反映了其起源细胞的代谢状态。外泌体具有双层脂质膜，保证了它们的内容物不受体液酸性条件的影响
[34]。因此，外泌体的内容物具有潜在的生物标志物价值。目前分离外泌体的主要方法为超速离心和密度梯度离心，但在临床应用中存在太过复杂的问题。
Qiu TT等
[35]使用尿液外泌体的RMRP、UCA1和MALAT1 lncRNA建立了支持向量机（SVM）模型，其ROC曲线下面积为0.875，灵敏度为80.0%，特异性为81.4%。在另一项研究中，研究人员发现在膀胱癌患者的尿液细胞外囊泡中，Ephrin A受体2（EphA2）是唯一明显升高的蛋白质，敏感性为61.1%，特异性为97.2%
[36]。此外，Lin H等
[37]在临床试验中发现，miR-93-5p等外泌体中的miRNAs有望作为早期膀胱癌检测和了解其发展机制的非侵入性工具。Tomiyama E等
[38]对膀胱癌患者和健康对照组的尿液样本中的外泌体进行了蛋白质组学分析，其中，HSP90具有最大的AUC值（0.813），敏感性和特异性分别为82.5%和70.0%。
1.5 蛋白质组
蛋白质组是所有蛋白质在生物体、特定细胞、组织或生物体液中的集合，涵盖了这些蛋白质的种类、数量、结构、作用以及相互影响的信息。分析蛋白质的主要方法有酶联免疫吸附测定、Western blot、免疫组化和质谱等。血浆中蛋白质成分更复杂，所以大部分蛋白质标志物都是针对尿液。蛋白质是最早用于膀胱癌液体活检的生物标志物，包括NMP22在内的多个膀胱癌液体活检产品已获得美国FDA的批准上市。得益于蛋白质组学的发展，研究人员通过对膀胱癌患者进行蛋白质组学分析，不断发现新的生物标志物。
在1项涉及732个尿液样本的多中心研究中，研究人员评估了NMP22和BTA作为膀胱癌诊断生物标志物的性能
[39]。对于低级别NMIBC，BTA和NMP22的诊断敏感性分别为13.4%和62.4%；对于高级别NMIBC，BTA和NMP22的诊断敏感性分别为49.5%和83.4%；而对于所有NMIBC，BTA和NMP22的诊断敏感性分别为35.2%和95.8%，特异性分别为95.5%和67.9%。在另一项研究中，研究人员发现Survivin、BTA和细胞学的三重组合是区分膀胱癌和对照组的最有前景的模型，其敏感性为67%，特异性为96%，AUC为0.86
[40]。
Oncuria™是一种用于诊断膀胱癌的多重免疫测定方法。在1项多机构队列研究中，研究人员评估了362个样本中10种不同蛋白质生物标志物（A1AT、APOE、ANG、CA9、IL8、MMP9、MMP10、PAI1、SDC1和VEGFA）的量
[41]。ROC曲线显示该方法具有93%的总体敏感性，93%的特异性，65%的PPV和99%的NPV。
ADXBLADDER是一种新型的尿液生物标志物检测方法，可检测尿沉淀中MCM5蛋白。研究人员进行了一项前瞻性、双盲、多中心研究来评估ADXBLADDER尿液测试对膀胱癌复发的监测能力
[42]。ADXBLADDER对于识别HG/CIS复发具有99.15%的NPV和66.7%的敏感性。ADXBLADDR呈阳性的个体复发风险为5.0%，而在ADXBLADDER呈阴性状态的患者中，HG/CIS复发仅为0.85%。
2 局限性
正如前文所述，液体活检在膀胱癌的诊断、监测领域已经有了较多的研究，但其在临床应用中还存在一定的局限性。首先，不同实验室处理体液样本之间的均质化很难实现统一，这导致了标志物性能验证的偏差，同时，不同地区或实验室之间存在技术差距，这也影响了液体活检在临床上的应用。其次，之前的大部分研究中只设置了健康人群的对照组而忽视了其他非肿瘤疾病的影响，这可能导致标志物的低特异性。因此，还需要大量的前瞻性、多中心、大样本研究来进一步验证液体活检的临床价值，减少病例对照研究可能带来的偏倚。
不同液体活检标志物也有各自的局限性。CTC在血液和尿液中数量较少，可能存在漏检的情况，其临床应用有赖于捕获和识别CTC技术的更新。ctDNA在体液中半衰期较短，相关突变及甲基化检测也较困难，同样，cfRNA也面临着不稳定和半衰期短的问题，这对临床上标本的储存、运输及有效成分分离提出了挑战。不同的外泌体分离技术对外泌体数量及其内容物数量有较大影响，所以对外泌体分离方法进行标准化非常重要。且外泌体分析成本较高，需要改进现有的外泌体分析方法。
3 总结与展望
膀胱癌液体活检已经取得了明显的进步，尤其是在DNA、RNA、蛋白质等生物标志物的检测和分析方面取得了重大突破，CTC和外泌体的分离与检测技术也在不断进步，使得其在膀胱癌早期诊断、疾病监测和治疗反应评估方面的应用逐渐成为可能。在膀胱癌液体活检研究中出现的新趋势是采用多个生物标记的组合来进行诊断，这一策略使诊断准确性和监控膀胱癌的能力得到了提高。然而，尽管液体活检在膀胱癌领域显示出巨大的潜力，但仍然存在一些挑战和限制，包括标志物的选择、相应标志物特异性低、检测方法的标准化、技术的成本和复杂性等。虽然目前还没有完全替代膀胱镜检查的液体活检方法，但作为一种宝贵的辅助工具，液体活检可以指导患者的诊治。但可以预见的是随着技术的不断进步，在临床治疗膀胱癌的过程中，液体活检手段将发挥更为关键的作用。未来还需要大量的前瞻性、多中心研究来验证液体活检的诊断效能，从而弥补现在的研究多为回顾性病例对照分析所带来的偏倚，同时还要注意与其他良性泌尿系统疾病的对比，以降低假阳性率。在对膀胱癌转移与进展的监测中，可能需要开发血液与尿液联合检查的液体活检方法。
京公网安备11010202008535号
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