过表达EP₄基因的人CD34⁺细胞构建及EP₄A对其在小鼠体内的归巢影响

摘要

目的 通过构建前列腺素E受体4（EP₄）基因过表达慢病毒载体，将外源性EP₄基因克隆至人CD34⁺细胞中；观察过表达EP₄基因的人CD34⁺细胞在小鼠体内的归巢现象，初步探讨EP₄受体激动剂（EP₄A）对人CD34⁺细胞在小鼠体内归巢效应的影响。方法 （1）采用化学方法合成EP₄-cDNA片段，将其克隆至GL107质粒载体中，构建GL107-EP₄⁺质粒。（2）通过293T细胞将其包装成GL107-EP₄⁺慢病毒，同时包装GL107慢病毒作为阴性对照。（3）用上述慢病毒感染人CD34⁺细胞，通过倒置荧光显微镜观察慢病毒感染效果，流式检测慢病毒感染效率，定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot）检测EP₄基因表达情况。（4）活体成像观察EP₄A对EP₄⁺-人CD34⁺细胞在小鼠体内归巢效应的影响及确定适宜观察时间。（5）免疫组化检测EP₄A刺激后人CD34⁺细胞输注小鼠的骨髓组织中EP₄分子的表达情况。（6）qRT-PCR和Western blot检测上述小鼠骨髓细胞中CXC家族趋化因子受体4（CXCR₄）的表达情况。结果 （1）DNA测序证实GL107-EP₄⁺质粒中的EP₄-cDNA序列正确。（2）GL107-EP₄⁺质粒能通过293T细胞包装成慢病毒，病毒滴度大于1×10～8 TU/mL。（3）荧光显微镜观察到GL107-EP₄⁺及GL107慢病毒感染的人CD34⁺细胞的GFP荧光强度比未感染慢病毒的人CD34⁺细胞（背景对照）增强；流式检测GL107-EP₄⁺和GL107慢病毒感染效率分别为28.06%和66.76%。GL107-EP₄⁺组的EP₄信使RNA（mRNA）及蛋白表达高于背景对照及GL107慢病毒感染组（0.580±0.032 vs.0.256±0.027 vs. 0.250±0.043，均P<0.001）。（4）移植后第3天为EP₄A促进EP₄⁺-人CD34⁺细胞归巢效应的适宜观察时间（P<0.05）。（5）移植后EP₄A刺激组的骨髓组织EP₄的相对表达量较未刺激组（EP₄⁺-Luc）高（0.164±0.004 vs.0.118±0.007,P=0.016）。（6）EP₄A刺激组的CXCR₄ mRNA及蛋白表达均高于对照组（均P<0.05）。结论 EP₄基因可成功克隆至人CD34⁺细胞，且EP₄蛋白可成功过表达。EP₄A可能通过促进CXCR₄表达，提高人CD34⁺造血细胞向受体小鼠骨髓组织中的定向归巢效率。

关键词

人CD34⁺细胞 / 慢病毒载体 / EP₄受体 / EP₄受体激动剂 / 造血干细胞归巢