低氧预处理脂肪间充质干细胞来源的外泌体减轻小鼠血管损伤后新生内膜形成及其机制

摘要

目的 探究低氧预处理脂肪间充质干细胞来源的外泌体（ADSC-EV）减轻小鼠血管损伤后新生内膜形成及其机制。方法 分离获取脂肪间充质干细胞（ADSC）并鉴定，分别于低氧（体积分数为0.01 O₂）、常氧（体积分数为0.21 O₂）条件下进行培养，收集培养上清液，采用经典超速离心法提取ADSC-EV,利用纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）检测ADSC-EV颗粒粒径分布；采用BCA法测定ADSC-EV的蛋白质浓度；应用透射电子显微镜观察ADSC-EV的形态。采用Western印迹法检测ADSC-EV的标志蛋白，应用荧光显微镜观察ADSC-EV被人主动脉平滑肌细胞（HA-VSMC）吞噬的情况。将HA-VSMC分为对照组（加入PBS）、PDGF-BB组（予PDGF-BB孵育24 h）、PDGF-BB+常氧EV组（予常氧ADSC-EV预处理6 h+PDGF-BB孵育24 h）、PDGF-BB+低氧EV组（予低氧ADSC-EV预处理6 h+PDGF-BB孵育24 h）,采用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU）法检测细胞增殖能力。采用颈动脉导丝损伤术建立小鼠血管损伤模型，将28只C57BL/6小鼠分为假手术组（仅切开皮肤）、模型组（行颈动脉导丝损伤术）、常氧EV治疗组（造模后予尾静脉注射常氧ADSC-EV）、低氧EV治疗组（造模后予尾静脉注射低氧ADSC-EV）。小鼠尾静脉注射ADSC-EV均于术后第1天开始，每7 d注射1次，28 d后采用H-E染色观察血管新生内膜厚度、血管中膜厚度和两者比值。结果 流式细胞仪对提取到的ADSC鉴定结果显示，ADSC高表达CD73、CD90、CD105,几乎不表达CD45。培养传代至P3代，光学显微镜下见，ADSC生长状态良好，细胞呈梭型，成纤维细胞样。透射电子显微镜下见，常氧和低氧ADSC-EV形态均呈大小较均一、圆形、杯口状的膜性囊泡结构。NTA检测结果显示，常氧和低氧ADSC-EV的粒径分布主要为50～150 nm,约占70%。Western印迹法检测结果显示，常氧和低氧ADSC-EV均表达其亲本细胞ADSC的膜标志蛋白CD9、TSG101、CD63,不表达ADSC的内质网膜蛋白Calnexin。荧光显微镜下见，ADSC-EV呈红色（DiI染色）,HA-VSMC骨架呈绿色（Phalloidin染色）,细胞核呈蓝色[4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色],图像整合（Merge图）见ADSC-EV出现在细胞核周围。PDGF-BB组EdU阳性细胞比例显著高于对照组和常氧EV组、低氧EV组（P值均<0.01）,低氧EV组EdU阳性细胞比例显著低于常氧EV组（P<0.01）。模型组和常氧EV治疗组血管新生内膜厚度显著大于假手术组（P值分别<0.01、0.05）,低氧EV治疗组显著小于模型组（P<0.01）,低氧EV治疗组与常氧EV治疗组间的差异无统计学意义（P>0.05）。模型组、常氧EV治疗组、低氧EV治疗组血管中膜厚度均显著大于假手术组（P值均<0.01）,常氧EV治疗组、低氧EV治疗组均显著小于模型组（P值分别<0.01、0.05）,低氧EV治疗组显著低于常氧EV治疗组（P<0.05）。模型组和常氧EV治疗组血管新生内膜厚度/血管中膜厚度比值均显著大于假手术组（P值均<0.01）,常氧EV治疗组和低氧EV治疗组均显著低于模型组（P值均<0.01）,低氧EV治疗组显著低于常氧EV治疗组（P<0.05）。结论 低氧预处理ADSC-EV能有效抑制VSMC的增殖，从而减轻小鼠颈动脉血管损伤后的新生内膜形成。

关键词

脂肪间充质干细胞 / 外泌体 / 低氧预处理 / 血管平滑肌细胞 / 血管狭窄