细胞骨架相关蛋白2在结直肠癌中的潜在预后价值及功能验证研究

摘要

目的 全面分析结直肠癌相关数据集，旨在为结直肠癌的预后评估和治疗策略提供新的信息和诊断标志物。方法 对GSE41258数据集筛选出的差异表达基因进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）,得到关键模块。对关键模块与癌症基因组图谱（TCGA）结肠癌样本的差异表达基因进行功能富集分析，依次进行重叠基因分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和生存分析，从中确认关键基因。通过公共数据库检测细胞骨架相关蛋白2（CKAP2）在结直肠癌中的蛋白质表达水平及临床表达特征。选择2011年1月—2016年11月在同济大学附属杨浦医院接受手术且病理诊断为结直肠癌的患者89例，共获得石蜡包埋结直肠癌组织样本89个、正常结直肠组织样本（癌旁组织）89个，并收集患者的临床资料。采用免疫组织化学（IHC）分析结直肠癌组织中CKAP2的表达情况，比较不同CKAP2表达组结直肠癌患者的临床和病理参数，采用Kaplan-Meier生存分析不同CKAP2表达组患者的总生存期（OS）。将靶向CKAP2的敲低质粒（si-CKAP2）或阴性对照小干扰RNA（si-NC）转染至HTC-116和RKO细胞。采用qRT-PCR、蛋白质印迹法检测HTC-116和RKO细胞中CKAP2的基因和蛋白质表达量；采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定法评估细胞增殖情况，记录HTC-116和RKO细胞分别与CCK-8共孵育0、24、48、72 h后波长为450 nm处的光密度(A₄₅₀)值；Transwell实验检测HTC-116和RKO细胞的侵袭和迁移细胞数量。结果 生物信息学分析结果：（1）WGCNA结果揭示，GSE41258数据集中的棕色模块与结直肠癌样本之间存在显著相关性[皮尔森相关系数（r）为0.786]。（2）差异表达基因的功能富集分析确定了结直肠癌中与差异基因相关的生物过程和信号通路，包括p53信号通路、Wnt信号通路、细胞周期、DNA复制、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（cGMP-PKG）信号通路、cAMP信号通路、血管平滑肌收缩等；通过交集分析，从棕色模块（102个基因）和TCGA数据库的上调表达基因中得到95个重叠基因。（3）最大领域分量密度（DMNC）算法从PPI网络中筛选出10个与结直肠癌相关的相互作用基因，TCGA数据集和GSE41258数据集中，结直肠癌样本CEP55、CKAP2、ECT2、ERCC6L、GINS1、KIF14、KIF20A、KIF23、KIF4A、TRIP13基因表达量均显著高于正常结直肠样本（P值均<0.01）。Kaplan-Meier生存分析显示，CKAP2和KIF14高表达组的患者OS分别显著低于CKAP2和KIF14低表达组（P=0.008 1、0.030 0）。（4）通过人类蛋白质图谱（HPA）数据库对提供的结直肠癌组织样本和正常结直肠组织样本进行IHC分析显示，正常结直肠组织未见CKAP2染色，结肠癌组织见CKAP2染色。对美国阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据门户（UALCAN）数据库中TCGA样本的分析显示，CKAP2的蛋白质表达量在不同肿瘤分期、患者年龄及淋巴结转移状态之间的差异均无统计学意义（P值均>0.05）,腺癌与黏液性腺癌、TP53突变体与TP53非突变体之间CKAP2的蛋白质表达量的差异均有统计学意义（P值均<0.05）。细胞实验结果：（1）结直肠癌组织中CKAP2的蛋白质高表达患者（63例）显著多于低表达患者（26例，P=0.009）,正常结直肠组织中CKAP2的蛋白质高表达患者（45例）与低表达患者（44例）的差异无统计学意义（P>0.05）。（2）CKAP2高表达组脉管侵犯和死亡患者均显著多于低表达组（P=0.008 9、0.000 1）。（3）Kaplan-Meier生存分析显示，CKAP2高表达组患者的OS显著短于低表达组（P=0.02）。（4）qRT-PCR检测结果显示，与si-NC处理组比较，si-CKAP2处理组HCT-116、RKO细胞中CKAP2基因相对表达量均显著降低（P值均<0.05）。蛋白质印迹法检测结果显示，与si-NC处理组比较，si-CKAP2处理组HCT-116、RKO细胞中CKAP2蛋白质相对表达量均显著降低（P值均<0.05）。（5）CCK-8检测结果显示，与si-NC处理组比较，si-CKAP2处理组HCT-116、RKO细胞培养24、48、72 h时的A₄₅₀值均显著降低（P值均<0.01）。Transwell实验结果显示，与si-NC处理组比较，si-CKAP2处理组HCT-116、RKO细胞迁移数量和侵袭数量均显著减少（P值均<0.05）。结论 CKAP2可作为结直肠癌的潜在预后生物标志物。

关键词

结直肠癌 / 细胞骨架相关蛋白2 / 预后 / 生物信息学分析 / 免疫组织化学