基于单细胞测序解析川崎病低密度中性粒细胞异质性

摘要

目的 基于单细胞RNA测序技术，系统解析川崎病患儿外周血低密度中性粒细胞（LDN）的异质性特征，探讨其在疾病发生、发展中的潜在作用机制。方法 选择2019年12月—2022年10月上海市儿童医院收治的川崎病患儿3例，同期于上海市儿童医院诊断为感染性发热患儿3例，以及同期在上海市儿童医院进行正常体格检查的健康儿童2名。共收集11份外周静脉血样本用于测序：3例川崎病患儿分别于静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗前（川崎病急性期）和IVIG治疗结束且发热消退后24h（川崎病恢复期）各采集1份样本，共6份样本；3例感染性发热儿童和2名健康儿童各于入院后立即采集1份血样。记录单细胞数据分析结果，包括川崎病（急性期、恢复期）患儿、感染性发热患儿、健康儿童各细胞类型的占比和细胞数量，以及LDN各簇在不同组别样本的占比和细胞数量。通过差异表达基因（DEG）分析LDN各簇前5个差异基因表达情况，LDN各簇DEG功能富集结果。结果 单细胞数据分析结果：川崎病患儿急性期LDN占比为20.56%，显著高于感染性发热患儿和健康儿童的6.26%和0(P=0.024)。基于单细胞转录组数据的聚类分析结果：共鉴定出6个功能异质性显著的LDN亚群（LDN1至LDN6）。LDN1为感染性发热患儿的优势亚群（占74.26%）,LDN2为川崎病急性期患儿的优势亚群（占55.70%）,LDN3、LDN5为川崎病恢复期患儿的优势亚群（分别占18.75%、24.38%）。LDN亚群的DEG特征分析结果：LDN1中高表达的DEG主要为干扰素诱导相关基因，包括干扰素诱导蛋白含四肽重复序列（IFIT）3、IFIT2和干扰素刺激基因15(ISG15);LDN2中高表达的DEG主要为炎症介导相关基因，包括基质金属蛋白酶9(MMP9)、S100钙结合蛋白A12(S100A12)和肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4);LDN3中高表达的DEG主要为T细胞活化和免疫调控相关基因，包括C-C趋化因子受体7(CCR7)、胸腺表达的分化调控因子（THEMIS）和分化簇2(CD2)。LDN亚群DEG的GO功能富集分析结果：LDN1显著富集于“对病毒的防御反应”“先天反应的调节”，以及“病毒基因组复制的负调控”等生物过程，通过与免疫球蛋白及双链RNA结合，参与病原体的识别、吞噬与清除；LDN2作为典型的促炎性细胞群，主要富集于“中性粒细胞脱颗粒”“活性氧代谢”等炎症相关生物过程；还涉及“晚期糖基化终产物（RAGE）受体结合”和钙依赖性蛋白结合调控过程；LDN3富集于“细胞质翻译”“核糖核蛋白复合物的生物合成”“RNA剪接”等代谢和转录后修饰相关过程，显著上调多种核糖体和线粒体蛋白复合物成分；LDN4主要富集于“黏着斑”“足状体”，以及“细胞-底物连接”等过程，相关基因多编码鸟苷三磷酸（GTP）酶调控因子和黏附分子；LDN5富含特异性颗粒、嗜天青颗粒和三级颗粒相关基因，显著参与“对革兰阴性细菌的防御反应”“抗菌体液反应”等过程，通过细胞毒性作用破坏病原体结构；LDN6富集于“凝血”“止血”，以及“血小板活化”等过程，相关基因涉及巨核细胞分化发育及糖蛋白复合物介导的黏附功能。结论 LDN可能在川崎病的炎症放大、免疫调节及血管修复中发挥关键作用，有望成为特异性生物学标志物，具有临床应用潜力。

关键词

川崎病 / 单细胞测序 / 低密度中性粒细胞 / 异质性