面向前列腺癌精准诊疗的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序系统研发

摘要

目的 构建一套集高通量循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）分选、纯化与单细胞测序于一体的集成式系统，为前列腺癌液体活检提供技术创新与转化基础。方法 收集2023年7月—2025年3月于上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科确诊且符合纳排标准的5例前列腺癌患者资料。通过白细胞单采技术采集高浓度有核细胞血样，结合自主设计的微流控分选系统进行CTC分离与分析。系统由3部分组成：磁控亲和界面分选模块，基于多物理场协同调控实现CTC高效捕获与温和释放；白细胞共同抗原（cluster of differentiation 45,CD45）负分选纯化模块，利用免疫识别与流体力学协同机制去除白细胞，提高CTC纯度；单细胞测序模块，通过双孔配对微腔结构实现单细胞与编码微球的高精度配对及转录组分析。通过细胞系掺杂实验及患者样本进行系统性能验证。结果 单采前后患者外周血中红细胞、白细胞和血小板计数均无显著变化[单采红细胞：（3.7±0.4）×10¹²/L比（3.5±0.4）×10¹²/L,P=0.263；单采白细胞：（6.8±1.8）×10～9/L比（6.2±1.5）×10～9/L,P=0.139；单采血小板：（210±60）×10～9/L比（190±50）×10～9/L,P=0.110]。经Ficoll密度梯度离心分离后，单采样本中单个核细胞平均浓度较常规外周血显著提升[单采比外周血样本：[110（80,140）]×10～9/mL比[5（2,10）]×10～9/mL,P<0.000 1]。进一步检测显示，单采样本中单位体积CTC数量显著高于外周血样本[单采比外周血样本：（1 242.4±910.7）个/10 mL比（19.2±17.3）个/10 mL,P=0.039 8]。性能测试显示，在流速1.75mL/h条件下，细胞捕获效率达（90.32±1.41）%，分选纯度为（13.87±3.07）%，释放效率超过90.00%。性能测试显示，经优化流速与表面密度后，芯片对白细胞的拦截率达（91.23±0.98）%,CTC损失率仅（0.76±0.16）%。纯化后样本中CTC纯度平均提升约4倍。在功能验证中，单细胞捕获率达50%～60%，双胞率低于8%，编码微球配对率超过90%，磁性微球回收率高于98%。单细胞测序通量达2 957个CTC，单细胞可检测基因数中位值为1 302个，外显子覆盖率为71.94%，总体测序利用率达87.92%。结论 构建了高通量CTC分选与单细胞测序集成系统，实现了CTC的高效捕获、纯化及单细胞转录组解析。该系统在保持细胞活性的前提下，显著提升了CTC检测灵敏度与测序利用率，为前列腺癌液体活检提供了创新的技术平台。该系统有望在生化复发及转移性前列腺癌的早期诊断、疗效监测和机制研究中发挥重要作用。

关键词

循环肿瘤细胞 / 微流控芯片 / 单细胞测序 / 前列腺癌 / 液体活检