基于16S核糖体RNA测序技术探讨隐匿性胰胆反流对胆囊结石患者胆汁菌群的影响

摘要

目的 通过16S核糖体RNA(16SrRNA)测序技术探究隐匿性胰胆反流（OPBR）对胆囊结石患者胆汁菌群结构和功能的影响。方法 选取2024年7月1—12日于同济大学附属东方医院胆石中心就诊，拟行腹腔镜胆囊切除术或保胆手术的胆囊结石患者37例，其中男21例、女16例；根据患者是否合并OPBR，将患者分为对照组和OPBR组。采集患者的胆囊胆汁，测定胆汁淀粉酶水平，胆汁淀粉酶≤110U/L的患者为未合并OPBR纳入对照组，>110U/L的患者为合并OPBR纳入OPBR组。对胆汁样本进行16S核糖体RNA(16SrRNA)测序，并行胆汁菌群生物信息学分析：胆汁菌群测序质量评估（稀释曲线和丰度等级曲线），胆汁菌群测序物种组成分析[花瓣图分析扩增子序列变异（ASV）数量，Circos图呈现样本与物种之间的丰度]，胆汁菌群α多样性分析（指标包括Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数、ACE指数及Observed species指数）和β多样性分析[主成分分析（PCA）及非度量多维尺度（NMDS）分析]，胆汁菌群差异物种线性判别分析（LEfSe）、胆汁菌群差异物种随机森林分析，以及胆汁菌群差异物种代谢KEGG通路预测分析。结果 本研究最终纳入20例患者的有效胆汁样本，对照组、OPBR组各10例。测序质量评估显示，物种稀释曲线与丰度等级曲线表明数据质量可靠；所有样本测序深度及Q30碱基识别准确率均满足后续分析要求。对照组、OPBR组分别有2 005、1 834个ASV，两组共同存在3个ASV，对照组、OPBR组分别有2 002、1 831个独有的ASV。Circos图分析结果显示，两组胆汁菌群的微生物组成主要有5个核心菌门，分别为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和脱硫杆菌门，变形菌门相对丰度在两组中均占据绝对优势地位，厚壁菌门次之。α多样性分析结果显示，在物种多样性方面，OPBR组的Shannon指数显著低于对照组（P<0.05）,Simpson指数显著高于对照组（P<0.05）；在物种数量方面，OPBR组的Chao1指数、ACE指数和Observed species指数均显著低于对照组（P值均<0.05）。PCA与NMDS分析结果显示，PCA第一主成分（PC1）解释65.21%的变异，能够清晰分离两组样本（组间距离>组内离散度）；NMDS应力值为0.038(<0.05)，进一步验证组间菌群结构差异显著。LEfSe分析结果显示，OPBR组瘤胃球菌属显著富集，对照组芽单胞菌门、鞘氨醇单胞菌目、双歧杆菌目、水杆菌属、普雷沃菌科NK3B31组、粪杆菌属等显著富集。随机森林模型显示，粪杆菌属为鉴别两组的关键生物标志物，其次为瘤胃球菌属。KEGG通路功能预测分析结果显示，OPBR组菌群的脂类、糖类、氨基酸的代谢功能降低，微生物的活性和毒性增加。结论 合并OPBR的胆囊结石患者胆汁菌群结构紊乱（粪杆菌属丰度下降而瘤胃球菌属丰度上升）及功能异常（代谢减弱、毒性增强），可能是OPBR诱发胆囊病变的微生物学机制，为防治OPBR提供了潜在靶点。

关键词

隐匿性胰胆反流 / 胆囊结石 / 胆汁菌群 / 16S核糖体RNA测序