siRNA效率预测的不确定性评估及数据筛选策略

Uncertainty quantification and data screening strategies for siRNA efficacy prediction

摘要

RNA干扰技术在靶向治疗领域展现出巨大的潜力.以往的siRNA效率预测模型缺乏对结论不确定度的量化评估.在OligoFormer基础上构建分类模型，针对常用Huesken和Mixset数据集，定量评估了模型不确定度与数据不确定度.结果显示，数据集中数据内禀不确定度整体较高，并在总体不确定度中占主导.因此，将不确定度作为数据质量信号，提出一个新的样本筛选策略并构建低不确定度子集Huesken'和Mixset'，并开展了数据集内与跨数据集性能验证.五折交叉验证结果显示，筛选后的Huesken'数据集的AUC，PRC，F1⁃score，PCC等指标达到0.950，0.941，0.936，0.791，Mixset'数据集达到0.901，0.930，0.773，0.733，均较原数据集显著提升.跨数据集评估显示，在使用相同Mixset'数据集测试时，基于低不确定度的Huesken'数据集训练的模型相较原来，AUC，PRC和PCC分别提升1.29%，0.93%和0.72%.这表明不确定度估计可用于提供预测可信度信息、支持基于不确定度的数据筛选，并在数据集内与跨数据集评估中提升siRNA效率预测的性能与泛化表现.进一步指出，对基于深度学习的siRNA效率预测模型，提高数据质量相较于增加数据数量更加重要.

Abstract

RNA interference (RNAi) is a promising therapeutic strategy. However,existing siRNA efficacy predictors lack uncertainty quantification. Here,we present an OligoFormer⁃based model to quantify both model and data uncertainty using the Huesken and Mixset datasets. Our analysis reveals that data uncertainty dominates overall uncertainty. Using it as a filter，we derived low⁃uncertainty subsets,denoted as Huesken' and Mixset'. In cross⁃validation，the Huesken' achieved AUC，PRC，F1⁃score,and PCC scores of 0.950，0.941，0.936,and 0.791，respectively,while Mixset' scored 0.901，0.930，0.773，and 0.733，surpassing the performance on the original data. In cross⁃dataset tests，models trained on Huesken' outperformed those on the original data，with AUC，PRC，and PCC improving by 1.29%，0.93%，and 0.72%,respectively. Uncertainty estimation thus enhances both prediction confidence and model generalizability via data filtering. Crucially，for deep learning–based siRNA prediction，improving data quality is more impactful than increasing data quantity.

Graphical abstract

关键词

siRNA效率预测 / 不确定性量化 / 模型不确定度 / 数据不确定度 / 数据筛选

Key words

siRNA efficacy prediction / uncertainty quantification / model uncertainty / data uncertainty / data filtering

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA触发的序列特异性基因沉默机制^［1］.在哺乳动物细胞中，小干扰RNA （简写为“siRNA”）可被装载进入RNA诱导沉默复合体（RNA⁃Induced Silencing Complex，RISC），并通过与互补mRNA配对实现靶基因表达下调^［2］.然而，同一靶基因通常对应大量候选siRNA，且不同候选siRNA在沉默效率与脱靶风险上有显著差异，因此通过建立可靠的计算预测方法来辅助筛选与评估，成为siRNA设计流程中的关键环节.

早期siRNA预测方法主要依赖特征工程学习，例如基于线性回归的i⁃Score^［3］、热力学驱动的OligoWalk^［4］以及基于支持向量机的siRNAPred^［5］等.受限于数据规模和实验流程差异带来的数据异质性^［6］以及抑制效果与脱靶效应所呈现的多因素耦合与非线性特征^［7］，此类方法在不同数据集间的性能与泛化稳定性仍受到挑战.随着深度学习的发展，siRNA预测研究逐步转向从序列中自动学习特征.例如Han et al^［8］利用卷积神经网络提取序列模体，并融合热力学信息以提升预测性能^［9］，GNN4siRNA采用图神经网络建模siRNA与mRNA的交互结构^［10-11］.近年来，Transformer^［12］架构的引入推动了该领域的新一轮进展.例如，OligoFormer^［13］以Transformer编码器为核心构建Oligo编码模块，并融合热力学计算与预训练语言模型RNA⁃FM^［14］的表征进行预测，实现了性能的进一步提升^［15］；ENsiRNA^［16］融合序列、结构等信息，采用多模态几何图神经网络进行训练与预测.

尽管siRNA效率预测模型持续演进，但其性能仍在很大程度上受训练数据制约.现有数据集规模有限、类别分布不均，且不可避免地包含生物实验引入的噪声^［17］.此外，现有的不少预测方法仅提供单一预测值，较少对预测分布及其不确定度进行系统量化与验证，因而决策者难以判断预测的可信程度.若进一步将模型输出直接用于决策，过度自信但错误的预测可能难以被识别，从而增加错误决策风险^［18-19］.

图1a~d以小样本二分类直观地说明有限数据条件下预测的不稳定性.从贝叶斯视角看，模型参数不再是固定值，而是由后验分布p\left(w\left|X,Y\right.\right)描述（图1b）；在推理阶段若仅使用一组确定参数（如{\widehat{w}}_{\mathrm{M}\mathrm{A}\mathrm{P}}，图1a），模型只能对应一条固定的决策边界（图1c）.因此，当样本位于边界附近时，边界的轻微偏移就可能导致类别预测发生翻转，带来较高的决策风险.贝叶斯预测则在后验分布的意义下考虑不同模型权重所对应的预测结果，使参数不确定性体现在预测分布中.相应地，不同权重样本可能产生不同决策边界（图1d），同一输入也可能得到不同的预测结果.基于这种预测分布，可以采用预测熵、预测方差等统计量对预测的不确定程度进行量化，从而为稳健决策提供依据^［20-21］.

事实上，将不确定性量化已成为深度学习的一个重要的研究方向.相关方法已在多个领域得到应用，例如医学图像分割^［22］和分子图数据噪声诊断^［23］等.然而，针对siRNA效率预测这一特定任务，目前仍缺乏系统性的不确定度评估框架.

因此，本研究以siRNA效率预测为核心任务，引入不确定度量化方法，对数据不确定度与模型不确定度进行分解分析.进一步，提出了不确定度驱动的数据筛选方案、构建了低不确定度子集，并基于此训练模型验证了这一方案对模型性能与泛化能力的提升.

1 方法

1.1　理论背景

基于贝叶斯建模视角，神经网络权重ω不再被视作固定的值，而是被建模为随机变量，其不确定性由概率分布描述.在观测到训练数据集\mathit{𝒟}后，对权重的认知更新为后验分布p\left(\omega \left|\mathit{𝒟}\right.\right).对于新输入的样本x^{*}，模型的预测输出y^{*}遵循后验预测分布：

p\left(y^{\mathrm{*}}\left|x^{\mathrm{*}}\right.,\mathit{𝒟}\right)=\int p\left(y^{*}{x}^{*},\omega \right)p\left(\omega \left|\mathit{𝒟}\right.\right)\mathrm{d}\omega(1)

然而，p\left(\omega \left|\mathrm{𝒟}\right.\right)及其积分通常难以直接计算.为此，变分推断引入一个可由参数θ优化的易处理分布q_{\theta }\left(\omega \right)来近似真实后验，并通过从q_{\theta }\left(\omega \right)中采样多组权重，进行多次前向传播，从而近似计算后验预测分布.在Gal and Ghahramani^［24］提出的框架下，带dropout的训练被视为一种变分近似.dropout引入的随机掩码可看作从近似后验q_{\theta }\left(\omega \right)中采样，因此在推理阶段保持dropout开启并对同一输入多次前向传播，可以通过蒙特卡罗近似后验预测分布.在采样得到预测集合后，模型可进一步对预测不确定性进行定量估计.

预测不确定性的方法通常被划分为两类：一是捕捉数据与标注中固有随机性的数据不确定度（偶然不确定度）；二是反映模型参数不确定性的模型不确定度（认知不确定度）^［25］.本研究采用Kwon et al^［26］提出的不确定度的度量方法.通过对输入x^{\mathrm{*}}进行T次采样与随机前向传播，令{\widehat{\omega }}_t\sim q_{\theta }(\omega )，并记为：

{\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}=\mathrm{s}\mathrm{o}\mathrm{f}\mathrm{t}\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}\left(f^{\widehat{{\omega }_t}}\left(x^{*}\right)\right)(2)

\overline{\mathit{y}}={\sum }_{t=\mathrm{1}}^T\frac{{\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}}{T}(3)

不确定度公式如下所示：

\begin{array}{l}\widehat{Var}\left[y^{*}\left|x^{*}\right.\right]=\frac{\mathrm{1}}{T}{\sum }_{t=\mathrm{1}}^T\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}-\overline{\mathit{y}}\right){\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}-\overline{\mathit{y}}\right)}^{\mathrm{T}}+\\ \frac{\mathrm{1}}{T}{\sum }_{t=\mathrm{1}}^T\left(\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{a}\mathrm{g}\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}\right)-\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}\right){\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}\right)}^{\mathrm{T}}\right)\end{array}(4)

公式的第一项\frac{\mathrm{1}}{T}{\sum }_{t=\mathrm{1}}^T\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}-\overline{\mathit{y}}\right){\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}-\overline{\mathit{y}}\right)}^{\mathrm{T}}为模型不确定度，来源于给定数据集\mathit{𝒟}下参数\omega的随机性，通常随着样本量的增加而减少^［27-28］.公式的第二项\frac{\mathrm{1}}{T}{\sum }_{t=\mathrm{1}}^T\left(\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{a}\mathrm{g}\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}\right)-\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}\right){\left({\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}\right)}^{\mathrm{T}}\right)是数据不确定度，来自输出{\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}的固有随机性^［18］.

本实验通过在推理阶段保持dropout开启^{［20，24］}的方法对不确定性进行度量.每次前向传播对应一次随机子网络，对同一输入x^{*}重复进行T次随机采样与前向计算，得到一组概率预测{\left\{{\widehat{\mathit{y}}}_{\mathit{t}}^{\mathit{*}}\right\}}_{t=\mathrm{1}}^T，代入式（4）分别计算模型不确定度与数据不确定度.

1.2　数据集

采用Huesken et al^［29］在实验中整理的数据集以及Bai et al^［13］在OligoFormer中整理的Mixset数据集作为不确定度评估的数据集.如表1所示，Mixset数据集整合了多项研究数据，包括Amarzguioui et al^［30］，Harborth et al^［31］，Hsieh et al^［32］，Katoh and Suzuki^［33］，Reynolds et al^［34］，Vickers et al^［35］和Ui⁃Tei et al^［36］的工作.

1.3　模型

OligoFormer是siRNA效率预测领域一个常用的模型^［13］.基于这一模型，通过调整其部分网络架构，构建了一个用于siRNA效率预测与不确定度评估的分类模型.模型整体架构如图2a所示，其核心由三个并行特征提取模块构成.

（1）热力学计算模块：用于提取siRNA与靶标mRNA相互作用的热力学参数；

（2） RNA⁃FM模块：基于预训练语言模型生成序列的嵌入表示；

（3） Oligo编码器：整合二维卷积（Conv2d）、双向长短期记忆网络（BiLSTM）和两层Transformer编码器，以提取深层序列特征.

上述三个模块的输出特征经拼接后，送入一个多层感知机（Multi⁃Layer Perceptron，MLP）分类器，最终实现对siRNA效率的预测.为了实现分类任务，本研究对原模型的输出层及损失函数进行了相应调整.

为了通过dropout变分分布近似后验分布^［6］，在训练及推理阶段均保持隐藏层后的dropout开启.模型使用Adam优化器^［37］进行训练，批量大小为16，训练轮数为100，使用早停策略.不确定度计算流程如图2b所示：推理时，执行20次随机前向传播采样，并基于各次输出以及式（4）计算模型不确定度与数据不确定度.

1.4　评估指标公式

采用机器学习中常用评估指标：受试者工作特征曲线下的面积（Area Under the ROC Curve，AUC），精确率⁃召回率曲线（Precision⁃Recall Curve，PRC），准确率（Accuracy，ACC），精确率（Precision，P），召回率（Recall，R），F1分数（F1⁃score），皮尔逊相关系数（Pearson Correlation Coefficient，PCC）.其中ACC，P，R和F1⁃score的计算公式如下所示：

ACC=\frac{TP+TN}{TP+TN+FP+FN}(5)

P=\frac{TP}{TP+FP}(6)

R=\frac{TP}{TP+FN}(7)

F\mathrm{1}\mathrm{-}\mathrm{s}\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{r}\mathrm{e}=\frac{\mathrm{2}\times P\times R}{P+R}=\frac{\mathrm{2}\times TP}{\mathrm{2}\times TP+FP+FN}(8)

其中，TP （True Positive）表示模型将正类样本正确预测为正类的样本数，TN （True Negative）表示模型将负类样本正确预测为负类的样本数，FP （False Positive）表示模型将负类错误预测成正类的样本数，FN （False Negative）表示模型将正类错误预测成负类的样本数.

2 结果与讨论

2.1　siRNA数据集不确定度分析

依据式（4），针对Huesken数据集和Mixset数据集分别计算不确定度，结果如图3所示.两个数据集的数据不确定度分布（图3a和图3d）峰值均集中在0.45~0.5，而模型不确定度（图3b和图3e）峰值约为0.005.上述数据表明，在当前模型中数据不确定度显著高于模型不确定度，成为总不确定度的主要构成部分，即数据固有的噪声对模型结果的影响远远超过模型自身的不确定度.需要特别指出，数据不确定度的理论上限为0.5.由图3可见，在两个数据集的数据不确定度分布中，近四分之一的数据点的不确定度接近理论上限.因此，数据的固有不确定性来自实验噪声.具体地，Huesken数据集的噪声主要来源于高通量荧光报告的系统偏差与实验操作中的随机偏差.Huesken数据集采用高通量荧光报告系统作为抑制效率的代理指标，不可避免地引入了与内源基因真实沉默效果的偏差.其次，在进行大规模转染时，各孔位间转染试剂浓度的细微波动以及细胞周期状态的差异，引入了难以消除的随机技术噪声.此外，板孔边缘与中心位置的温控差异，也会影响细胞代谢速率.对于Mixset数据集，其数据噪声主要来源于多组实验数据的整合以及实验过程中的随机偏差.首先，不同研究使用的细胞类型和物种背景并不一致，但siRNA的沉默效率本身会受到这些生物学背景的影响.其次，不同研究采用的检测方法并不相同，不同方法得到的沉默效率数值之间可能存在系统性差异，因此会进一步降低不同数据来源之间的一致性.此外，数据获取过程中具体的实验时长、浓度等条件也并不一致.并且，OligoFormer还将这些来源合并为Mixset数据集并统一归一化，再以70%为阈值分类，因此Mixset数据集的高不确定度不仅包含原始实验差异，还叠加了跨研究归一化带来的噪声.这些噪声来源在削弱样本质量的同时，还限制了模型的预测性能.因此，在siRNA效率预测中，相较于单纯扩大数据规模，提升数据质量更可能决定模型的性能上限.

2.2　输出概率与不确定度的分析

分析了Huesken数据集和Mixset数据集不确定度和模型预测输出概率的关联.其中，网络输出的未归一化类别得分（logits）经softmax转换得到类别概率向量.通过对同一输入进行多次随机前向传播，将各次得到的概率向量取平均，得到最终输出概率（图4）.在两类数据集中，当输出概率接近0或1时，数据不确定度（图4a和图4d）降至最低值.当输出概率接近0.5时，数据不确定度达到峰值.即高数据不确定度样本主要出现在预测概率接近决策边界的区域.此外，模型不确定度（图4b和图4e）在整个输出概率范围内均保持较低水平，且无明显集中趋势.总不确定度（图4c和图4f）的变化趋势与数据不确定度高度一致，数值范围相近.以上观察再一次证实了在siRNA效率预测中，数据不确定度在总不确定度中的主导地位，并且不确定度可作为预测可靠性的衡量指标.

依据数据的不确定度，以0.1为间隔对数据集进行分组，计算各组对应的平均预测准确度.如图5所示，对于Huesken数据集和Mixset数据集，组内准确度均随不确定度增大而呈单调下降趋势.在［0.0，0.1），准确度达到最高值；随着不确定度增至［0.1，0.3），准确度均下降，但仍高于0.8；在［0.3，0.5）的高不确定度区间，准确度进一步降至0.6~0.8.这一结果表明，不确定度与预测准确度之间存在显著的负相关关系，且这种趋势在两个数据集中表现一致.高不确定度样本的准确度显著低于低不确定度样本，验证了不确定度作为预测可靠性指标的合理性.

2.3　不确定度筛选后的模型性能

筛选不确定度小于0.3的数据分别构建新的数据集，并命名为Huesken'数据集和Mixset'数据集.原始数据分布如图6所示，Huesken和Mixset数据集均呈现相同趋势——随着不确定度增加，区间内数据量增多.在［0，0.3）的低不确定度区间内，Huesken数据集保留了713个数据（Huesken'），Mixset数据集保留了164个数据（Mixset'）.通过筛选低不确定度样本，获得了可靠性更高的数据集.

2.3.1　阈值敏感性分析

设定阈值分别为0.4，0.3和0.2，对两个数据集进行阈值敏感性分析.由表2可见，当阈值从0.4收紧至0.3时，两个筛选后数据集的各项指标均有明显提升，说明以0.4作为筛选阈值时条件相对宽松.进一步地，当阈值由0.3降低到0.2时，由于数据筛选过于严苛，在Huesken和Mixset数据集中，筛选后仅分别保留416和90个样本.与此同时，尽管两个数据集的部分指标仍有小幅上升，但F1⁃score均出现了明显的下降.这表明，过低的阈值会导致过度筛选，从而影响模型的整体表现.此外，表3展示了不同阈值下筛选数据集各项指标的波动情况.可以看出，以0.3为阈值筛选得到的数据集，在五折交叉验证中大部分指标的标准差表现更稳健.与之相比，尽管以0.2为阈值筛选的数据集在部分指标上取得了更优结果，但五折交叉验证中大部分指标的标准差却高于其他阈值对应的指标，反映出其结果稳定性相对较弱.因此，在当前实验设定下，综合考虑去噪收益、模型性能与结果稳健性等因素，最终选取0.3作为经验上的平衡阈值.

2.3.2　数据集内的性能验证

本研究分别使用不确定度筛选后的Huesken'数据集和Mixset'数据集在OligoFormer模型上进行数据集内的性能测试.采用五折交叉验证，AUC，PRC，F1⁃score和PCC作为评估指标.如图7所示，在所有四个评估指标下，筛选后数据集（Huesken'和Mixset'）的模型性能均显著优于原始数据集（Huesken和Mixset）.

五折交叉验证的平均结果如表4所示，表中黑体字表示最优性能.使用筛选后的Huesken'数据集时，OligoFormer模型在AUC，PRC，F1⁃score和PCC四个指标上分别达到0.950，0.941，0.936和0.791，相比于原始Huesken数据集提升了10.21%，16.2%，23.41%和11.19%.Mixset'数据集同样表现出性能提升，四个指标分别达到0.901，0.930，0.773和0.733，相比于Mixset数据集提升了6.57%，5%，1.17%和11.67%.这一全面的性能提升表明低不确定度数据有助于提升模型的训练效果，使模型学习到低噪声数据对应的更高质量的特征.

2.3.3　跨数据集的性能验证

使用Huesken数据集和不确定度筛选后的Huesken'数据集在OligoFormer模型上对Mixset'数据集进行跨数据集的性能测试.从表5（表中黑体字表示最优性能）可以看到，尽管Huesken'数据集样本量减少了，但模型在AUC，PRC和PCC指标上分别提升了1.29%，0.93%和0.72%，达到0.873，0.883和0.78.结果表明，不确定度筛选不仅有效降低了数据集中的数据噪声，还提升了模型在跨数据集场景下的泛化能力.

3 结论

本研究针对siRNA效率预测中数据规模小、实验噪声大且缺乏预测可信度评估的问题，在OligoFormer框架上引入基于dropout采样的不确定性量化方法，将总不确定度分为模型不确定度与数据不确定度进行讨论.在Huesken数据集与Mixset数据集上的结果显示：数据不确定度显著高于模型不确定度，且不确定度在预测概率接近0.5的决策边界附近最高；同时，不确定度与组内准确度呈稳定负相关，说明其可作为预测可靠性指标.这一发现表明，当前siRNA效率预测的主要瓶颈来自固有噪声导致的数据质量问题，相较于单纯扩充数据规模，优先提升数据质量更可能带来性能收益.进一步提出基于不确定度的样本筛选策略，构建低不确定度子集并进行训练与评估.筛选后的数据集在五折交叉验证中多项指标均明显提升，跨数据集测试也表现出更好的泛化能力.整体而言，不确定性量化不仅为siRNA预测提供了可信度信息，也为数据质量控制与模型稳健学习提供了可行路径.

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