淡水鱼养殖场主要病原菌耐药性及全基因组特征研究

Antimicrobial resistance and Whole-Genome characteristics of major pathogenic bacteria in freshwater fish farms

摘要

为揭示淡水鱼重要病原菌的流行、耐药、毒力特征及系统发育关系，本研究采用分离培养和全基因组测序技术，对四川省乐山和眉山市13个淡水鱼养殖场的病鱼样本中分离的重要病原菌进行了系统研究。通过细菌培养法对病原菌进行分离鉴定，采用K-B纸片扩散法测定其对抗菌药物的敏感性，结合全基因组测序技术分析其耐药基因、毒力因子、多位点序列分型及系统发育关系。结果表明，共鉴定出52株气单胞菌、3株邻单胞菌、5株爱德华氏菌和4株弧菌；病原菌对亚胺培南、复方新诺明和诺氟沙星的耐药性较高，分别达到78.13%、46.88%和45.31%，此外，42.19%的病原菌表现出多重耐药性；在64株病原菌基因组中发现14种一级风险耐药基因（ARGs）和7种二级风险ARGs，气单胞菌中注释到266种毒力因子，弧菌中注释到97种毒力因子；多基因位点序列分型（MLST）分析揭示了淡水鱼养殖场中病原菌的多样性，基于病原菌核心基因SNP构建系统发育树显示，来自不同养殖场的相同序列类型（ST）菌株聚集于同一分支，提示不同养殖场之间可能存在克隆传播和交叉污染的情况。本研究揭示了淡水鱼病原菌耐药性问题的严重性，并指出了克隆传播和交叉感染的可能，作为科学防控提供依据。

Abstract

To elucidate the prevalence， drug resistance， virulence characteristics， and phylogenetic relationships of major pathogenic bacteria in freshwater fish， this study systematically investigated pathogens isolation from diseased fish collected from 13 freshwater aquaculture farms in Leshan and Meishan， Sichuan Province， using bacterial isolation and whole genome sequencing. A total of 52 Aeromonas strains， 3 Plesiomonas strains， 5 Edwardsiella strains， and 4 Vibrio strains were identified through bacterial culture method. Antimicrobial susceptibility testing using the K-B disk diffusion method revealed high resistance rates to imipenem （78.13%）， trimethoprim-sulfamethoxazole （46.88%）， and norfloxacin （45.31%）. In addition， 42.19% of the isolates showed multidrug resistance. Whole genome sequencing identified 14 high-risk and 7 medium-risk antibiotic resistance genes （ARGs） among the genomes of 64 pathogenic strains. A total of 266 virulence factors were annotated in Aeromonas and 97 in Vibrio. Multilocus sequence typing （MLST） revealed substantial genetic diversity among pathogens from freshwater fish farms. Phylogenetic analysis based on conre-genome SNPs showed that strains of the same sequence type （ST） from different farms clustered within the same clade， suggesting potential clone transmission and cross-contamination among different farms. This study reveals the severity of antimicrobial resistance in freshwater fish pathogens and underscores the risk of clonal dissemination， providing a scientific basis for disease prevention and control.

Graphical abstract

关键词

淡水鱼养殖场 / 病原菌 / 耐药性 / 交叉感染

Key words

reshwater fish farms / pathogenic bacteria / drug resistance / cross-infection

得益于集约化和半集约化水产养殖模式的发展以及抗菌药物的使用，水产养殖的产量保持着持续的增长^［1］。中国是一个水产养殖大国，2019年水产品总产量为6480.36万吨，约占世界产量的60%，居世界首位，其中淡水产品产量为3197.87万吨，在水产品占有举足轻重的地位^［2］。在水产养殖产量激增的同时，病害的发生给水产养殖企业带来了巨大的经济损失，其中细菌性疾病是主要的病害之一，造成的损失占全部病害损失的50%以上^［3］。这些细菌性疾病往往传播速度快且危害面广，经常呈爆发性流行，防控困难^［3］。

在养殖过程中，通过口服、沐浴、池塘喷洒和注射等方式使用抗菌药物可以有效预防和治疗水产养殖疾病，其中一些抗菌药物甚至被用作生长促进剂，导致水产动物体内及周围环境中残留大量抗菌药物^{［1， 4-7］}。长期暴露于低水平的抗菌药物残留会对消费者及从业者的健康产生诸多不良影响，这些抗菌药物残留会给周围的细菌施加选择压力，促进抗菌药物耐药基因（Antimicrobial resistance genes， ARGs）的产生和水平基因转移（Horizontal gene transfer， HGT），使预防和治疗细菌感染的难度增加^［8-12］。已有研究表明水环境中抗菌药物的大量使用会导致水环境中生物体内抗菌药物残留和耐药细菌（Antimicrobial resistant bacteria， ARB）水平升高^［13］。然而，ARB在淡水鱼养殖环境中的流行情况尚不清楚，其是否会在养殖环境中积累并传播还尚不明确。因此，有必要对淡水鱼养殖场不同类型样本中ARB的分布及组成情况进行调查，以便于对淡水鱼养殖环境进行进一步的卫生监控并保障消费者和从业人员的健康。

本研究采用细菌培养法对水产养殖中重要的病原菌进行分离鉴定，测定其抗菌药物耐药性表型并对其系统发育关系进行探究，以期为淡水鱼养殖产业病原菌防控和抗菌药物耐药性的预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

气单胞菌培养基基础（RYAN）、气单胞菌培养基添加剂、麦康凯琼脂培养基（MAC）、LB肉汤培养基购买于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；哥伦比亚CNA血琼脂平板购买于广东环凯微生物科技有限公司；BHI、MH琼脂（MHA）水解酪蛋白胨琼脂培养基购买于OXOID。药敏纸片购买于Liofilchem；细菌基因组DNA提取试剂盒购买于TIANGEN；2×SanTaq Fast PCR Mix购买于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 仪器设备

超净工作台由苏净安泰生产；真空过滤泵由天津奥特塞恩斯公司生产；多管混匀仪由德国JOANLAB生产；台式超高速冷冻离心机、NanoDrop 2000超微量分光光度计、PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪由美国Thermo Scientific Forma生产；药敏纸片分配器由OXOID公司生产；恒温培养箱由Keelrein公司生产。

1.2 方法

1.2.1 患病鱼体采集及处理

2021年至2022年间，从四川省乐山市和眉山市等地的淡水鱼养殖场采集13批患病鱼体及水样用于病原菌的分离鉴定。在无菌条件下对鱼体进行解剖，用不同选择性培养基对病原菌进行分离纯化。

1.2.2 病原菌分离

从发病的淡水鱼养殖场采集患病（大口黑鲈、黄颡鱼、鲤鱼）样本，对病鱼样本进行解剖，用无菌接种环分别挑取磷下、鳃、肾、肝、肠及胃于RYAN培养基、麦康凯琼脂培养基、血琼脂培养基上划线，置于35 ℃恒温培养箱培养18~24 h，分别挑取绿色单菌落（气单胞菌）、半透明单菌落（邻单胞菌）、β溶血环的单菌落（爱德华氏菌）和α溶血环单菌落接种于无菌LB液体培养基中，35 ℃，180 r/min培养至对数期后再次接种于各选择培养基上，重复上述步骤3~5次后获得单克隆菌株。以上试验均在BSL-2实验室进行。

1.2.3 DNA提取与菌种鉴定

利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒按照说明书操作步骤提取分离病原菌基因组DNA，用Nanodrop 2000超微量分光光度计对所得DNA样本进行质量和浓度检测。

取上述细菌基因组DNA 2 μL作为模板，选择细菌16S rRNA通用引物（27F：5'-AGAGTTTG ATCATGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGTT ACCTTGTTACGACTT-3'）扩增细菌16S rRNA片段，反应体系为：2×SanTaq Fast PCR Mix 12.5 μL；上下游引物1 μL；模板DNA 2 μL；ddH₂O补足25 μL。反应程序为：95 ℃预变性10 min，94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共30个循环；72 ℃终延伸5 min，16 ℃结束反应。取4 μL PCR产物加入1%琼脂糖凝胶点样孔中，置于电泳槽中130 V恒温电泳15 min。电泳结束后，用凝胶成像仪观察条带，目的条带为1500 bp，将扩增成功的PCR产物送至生工生物工程股份有限公司进行序列测定。将结果上传至NCBI数据库进行序列比对，鉴定细菌种属。

1.2.4 病原菌药物敏感试验

依据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）发布的《抗菌药物敏感性试验测定执行标准2022年32版》，以大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株，用K-B纸片扩散法测定分离病原菌对10种重要抗菌药物的敏感性，所有试验均进行3组重复。根据CLSI药物敏感性试验执行标准（MS100-S31）判定菌株对药物的敏感性。药敏纸片含量及抑菌圈解释标准如表1所示。

1.2.5 病原菌全基因组测序及分析

将提取的病原菌基因组DNA送至北京贝瑞和康生物技术有限公司进行高通量测序。基于二代测序平台，构建合适长度的插入片段文库，对这些文库进行测序，构建DNA文库，获得原始测序数据。

使用Trimomatic对得到的FASTQ数据进行质量控制。质控完成后使用SPAdes v 3.13.1对数据进行组装。使用Species finder再次对菌株种属进行鉴定。使用CARD数据库注释细菌基因组中的ARGs。与VFDB数据库（http：//www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）进行比对，注释细菌基因组中的毒力因子。将细菌基因组信息上传至MLST 2.0（https：//cge.food.dtu.dk/services/MLST/）进行多位点序列分型，使用GrapeTree软件对MLST分型结果进行可视化。将细菌基因组上传至CSI Phylogeny 1.4进行单核苷酸多态性分析，并据此预测菌株间的系统发育关系，使用iTol（https：//itol.embl.de/）对SNPs分析结果进行可视化。

2 结果与分析

2.1 淡水鱼养殖场病原菌分离

对患病样本进行解剖，使用RYAN培养基、麦康凯培养基和血琼脂培养基进行选择性培养，在培养基上观察到特征性菌落，如图1所示，分离到疑似气单胞菌、邻单胞菌和爱德华氏菌。结合16S rRNA序列比对结果，共分离到52株气单胞菌、3株邻单胞菌、5株爱德华氏菌和4株弧菌，病原菌分离情况如表2所示。

2.2 淡水鱼养殖场病原菌抗菌药物耐药特征

用K-B纸片法测定淡水鱼养殖场分离菌对10种抗菌药物的敏感性，结果如图2所示。病原菌对亚胺培南、复方新诺明和诺氟沙星的耐药率较高，分别为78.13%、46.88%和45.31%。17.19%和15.63%的病原菌对氟苯尼考和恩诺沙星表现出高度耐药，31.25%和26.56%的病原菌对氟苯尼考和恩诺沙星表现出中度耐药。42.19%（27/64）的病原菌表现出多重耐药（对3类或3类以上抗菌药物耐药）。气单胞菌对亚胺培南、诺氟沙星和复方新诺明耐药性最高，分别为94.23%、51.92%和51.92%；邻单胞菌对复方新诺明和诺氟沙星耐药率最高，分别为100%和66.67%；爱德华氏菌对亚胺培南耐药率为20%；弧菌对10种抗菌药物均敏感。

2.3 淡水鱼养殖场病原菌耐药基因种类和风险等级分析

在64株病原菌基因组中共注释到45种ARGs，介导细菌对氨基糖苷类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、大环内酯类及四环素类等抗菌药物的耐药性。用Zhang等人发现的ARGs风险等级评估方法^［14］对这45种ARGs进行评估，发现其中有46.67%为高风险ARGs，结果如图4所示。其中31.1%（14/45）的ARGs风险等级为Ⅰ级，这些ARGs具有广泛的宿主谱、高度的移动性以及广泛的生态适应性，15.6%（7/45）的ARGs风险等级为II级，存在较高的风险，可能会传播至人类病原菌。所有气单胞菌、弧菌和爱德华氏菌均携带rsmA，介导病原菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性。

2.4 淡水鱼养殖场病原菌毒力因子特征分析

通过VFDB数据库对病原菌基因组中毒力基因进行注释，如图5所示，在气单胞菌中注释到266种毒力因子，检出率在30%以上的毒力因子有54种，在弧菌中注释到97种毒力因子，表明气单胞菌和弧菌可能对宿主具有较强致病性。

2.5 淡水鱼养殖场病原菌MLST分析

使用MLST 2.0根据不同菌株对应的管家基因（气单胞菌：gyrB、groL、gltA、metG、ppsA和recA；弧菌：adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM和pyrC；爱德华氏菌：adk、atpD、dnaJ、gapA、glnA、hsp60、phoR、pyrG、rpoA和tuf；邻单胞菌：gyrB、pyrH、recA和atpA）对细菌进行全基因组MLST分析，结果如图6所示。在52株气单胞菌中鉴定出44种ST型，表明气单胞菌在淡水鱼养殖环境中存在遗传多样性。3株邻单胞菌中鉴定出2种ST型；5株爱德华氏菌中鉴定出3种ST型；4株弧菌中鉴定出4种ST型。其中气单胞菌ST517、ST709和ST1737和邻单胞菌ST136在两个及两个以上的养殖场中都有检出，如图7所示。

2.6 不同淡水鱼养殖场病原菌系统发育分析

基于不同病原菌核心基因SNP构建系统发育树，结果如图8所示，52株气单胞菌被分为34个分支，3株邻单胞菌被分为2个分支，5株爱德华氏菌被分为3个分支，4株弧菌被分为3个分支。与MLST分析结果一致，ST型相同的菌株在SNP系统发育树中位置相近，来自多个养殖场的ST517、ST709和ST1737型气单胞菌分别聚集在同一分支，来自两个养殖场的ST136型邻单胞菌聚集在同一分支，表明多种ST型的气单胞菌和邻单胞菌可能在不同养殖场中出现交叉感染。

3 讨论

本研究采用细菌分离培养法对不同淡水鱼养殖场病原菌进行分离鉴定，测定病原菌对重要抗菌药物的敏感情况，并进一步采用全基因组测序技术对病原菌基因组进行分析，解析病原菌基因组中ARGs与毒力因子特征。同时开展溯源研究，探明不同养殖场细菌之间潜在的传播关系，为淡水鱼养殖场病原菌的有效防控提供理论支持。

在淡水鱼养殖过程中，细菌性疾病往往传播速度较快且危害面广，经常呈爆发性流行，并且已有研究报道许多重要的鱼类病原菌对一种或多种抗菌药物出现耐药性，给病原菌防控带来巨大困难^{［3， 15-16］}。本研究从多个发病的淡水鱼养殖场采集患病鱼样本，并分离得到52株气单胞菌、3株邻单胞菌、5株爱德华氏菌和4株弧菌，通过K-B纸片法测定这些病原菌对10种重要抗菌药物的敏感性，发现有42.19%的细菌具有多重耐药表型，如此高的多重耐药菌MDR检出率表明需要对淡水鱼养殖过程中的病原菌耐药性进行持续监测与控制。复方新诺明是治疗临床嗜麦芽葡萄球菌感染的一线药物^［17］，而本研究中分离株对复方新诺明的耐药率高达46.88%，所有邻单胞菌均对复方新诺明耐药，在29株细菌的基因组中注释到了复方新诺明耐药基因sul1。Zhao等人的研究结果表明，二氢叶酸合成酶基因sul的全球传播导致了复方新诺明耐药率的增加^［18］。因此细菌对复方新诺明的耐药性需要引起重视。

根据Zhang等人发现的ARGs风险等级评估方法^［14］，本研究在64株病原菌中鉴定到14种风险等级为Ⅰ级的ARGs，这些ARGs已经在人类相关环境中富集、具有移动能力并且在许多致病菌中都有发现，是目前临床病原菌对重要抗生素耐药的关键因素；此外，还鉴定到7种风险等级为Ⅱ级的ARGs，这些ARGs在人类相关环境中含量丰富且具有移动能力，目前Ⅱ级ARGs尚未在人类病原体中出现，但有很大可能转入人类病原体，具有潜在威胁。这些高风险ARGs可以介导细菌对多种抗菌药物的耐受，并且有可能通过HGT转移至其他人类重要病原菌中，需要重点关注。已有研究在医院污水中发现多重耐药气单胞菌的存在，并证实了部分气单胞菌中的bla_GES 编码质粒可成功进行接合转移^［19］。综上所述，淡水养殖环境中病原菌的耐药性问题不容忽视，给公共卫生安全造成极大的安全隐患，亟需采取措施来降低淡水养殖环境中细菌的耐药性。

毒力基因在病原菌黏附、定植、逃逸宿主免疫中发挥关键作用^［20］。气单胞菌、爱德华氏菌、弧菌、邻单胞菌等淡水鱼常见病原菌中均含有高丰度毒力基因，造成鱼类腹胀、烂鳍等症状，并造成养殖鱼类的高死亡率^［21-22］。本研究在分离的气单胞菌和弧菌中均注释到多种毒力基因，其中fliG等毒力基因在病原菌运动能力、趋化性、黏附性和生物膜形成等方面发挥重要功能^［23］，高水平的毒力基因赋予了病原菌对养殖鱼类的高致病性。

根据全基因组测序结果，对细菌进行遗传相关性分析，在52株气单胞菌中鉴定出44种ST型，在4株弧菌中鉴定出4种ST型，在5株爱德华氏菌中鉴定出3种ST型，在3株邻单胞菌中鉴定出2种ST型，表明淡水鱼养殖环境中病原菌存在丰富的遗传多样性。气单胞菌ST709、ST517和ST1737在两个或多个养殖场中都有检出，邻单胞菌ST136在两个养殖场中都有检出。依据病原菌核心基因SNP构建系统发育树，结果显示相同ST型的菌株聚集为同一分支。表明淡水鱼养殖过程中重要病原菌存在遗传多样性，且不同养殖场之间可能存在潜在的传播关系。

4 结论

本研究对四川省乐山和眉山市13批淡水鱼养殖场样本分离的64株病原菌进行了耐药表型鉴定和全基因组分析，结果显示，两地区淡水养殖环境中部分病原菌表现出耐药表型，且检出多种耐药基因，提示两地区淡水养殖病原菌的耐药性状况值得关注。同时，所检测的重要病原菌存在一定的遗传多样性，基因组分析结果提示不同养殖场之间可能存在病原菌的传播关联。上述发现为淡水鱼养殖产业病原菌耐药性的监测、防控策略制定及抗菌药物合理使用提供了初步的科学参考。

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基金资助

国家重点研发计划课题(2023YFC2307100)

四川省科技厅杰出青年基金项目(2025NSFJQ0038)

校企合作典型生产实践项目(CNY-CJRH-202535)