姜黄素调节NRF2-TXNRD1轴诱导铁死亡对B-CPAP细胞增殖侵袭迁移能力的影响

Curcumin inhibits the growth， invasion and migration of B-CPAP cells by inducing ferroptosis through the NRF2-TXNRD1 axis

摘要

基于铁死亡探究姜黄素（Cur）能否通过NRF2-TXNRD1轴抑制B-CPAP细胞增殖、侵袭及迁移。 通过检测细胞增殖、侵袭、迁移能力以及铁死亡抑制剂Fer-1对Cur所致细胞以上变化的挽救作用，发现 Cur抑制B-CPAP细胞增殖、侵袭及迁移（P0.01或P0.001），且以上变化可被Fer-1逆转（P0.01或P0.001）。透射电镜观察发现Cur诱导细胞发生铁死亡样亚显微结构改变。C11-BODIPY 581/591探针检测细胞内脂质ROS水平显著升高，与Control组细胞比较，Cur组细胞脂质ROS水平SOD及GSH水平、NADPH/NADP⁺比值显著降低，而Fer-1可逆转Cur所致B-CPAP细胞的上述变化（P0.05或P0.01）。分子对接分析模拟发现，Cur与NRF2蛋白可能存在结合位点；生物信息学分析发现，甲状腺癌组织中NRF2下游蛋白TXNRD1与NRF2相关系数最高（r=0.74，P0.001）。TXNRD1基因在甲状腺癌组织高表达，且与甲状腺癌淋巴结转移相关，TXNRD1高表达组的总生存显著下降（P=0.001 1）。而Cur组细胞核内NRF2蛋白分布明显减少。与Control组相比，Cur组细胞SLC7A11、FTH、NRF2及TXNRD1蛋白表达水平显著降低（P0.01）；与Cur组相比，Fer-1+Cur组细胞NRF2、TXNRD1蛋白表达水平显著升高（P0.05）。综上结果表明，姜黄素通过NRF2-TXNRD1轴诱导B-CPAP细胞铁死亡，进而抑制其增殖侵袭迁移。

Abstract

To investigate whether curcumin （Cur） can inhibit the proliferation， invasion， and migration of B-CPAP cells via the NRF2-TXNRD1 axis by inducing ferroptosis， this study examined cell proliferation， invasion， and migration， as well as the rescue effect of the ferroptosis inhibitor Fer-1 on Cur-induced changes. The results showed that Cur suppressed B-CPAP cell proliferation， invasion， and migration （P0.01 or P0.001）， and these effects were reversed by Fer-1 （P0.01 or P0.001）. Transmission electron microscopy revealed that Cur induced ferroptosis-like ultrastructural changes in cells.The C11-BODIPY 581/591 probe detected a significant higher lipid ROS levels but lower levels of SOD， GSH， and the NADPH/NADP⁺ ratio， while Fer-1 reversed the aforementioned changes in B-CPAP cells induced by Cur （P0.05 or P0.01）. Molecular docking analysis suggested potential binding sites between Cur and the NRF2 protein. Bioinformatics analysis revealed that TXNRD1， a downstream protein of NRF2， had the highest correlation coefficient with NRF2 in thyroid cancer tissues （r=0.74，P0.001）. TXNRD1 was highly expressed in thyroid cancer tissues and was associated with lymph node metastasis in thyroid cancer， with the high TXNRD1 expression group showing significantly reduced overall survival （P=0.0011）. Additionally， the nuclear distribution of NRF2 protein was markedly decreased in the Cur group.Compared to the control group， the Cur group showed significantly lower expression levels of SLC7A11， FTH， NRF2， and TXNRD1 proteins （P0.01）. In contrast， the Fer-1+Cur group exhibited significantly higher expression levels of NRF2 and TXNRD1 proteins compared to the Cur group （P0.05）. In summary， these results indicate that curcumin induces ferroptosis in B-CPAP cells via the NRF2-TXNRD1 axis， thereby inhibiting their proliferation， invasion， and migration.

Graphical abstract

关键词

姜黄素 / NRF2-TXNRD1轴 / 铁死亡 / B-CPAP细胞

Key words

curcumin / NRF2-TXNRD1axis / ferroptosis / B-CPAP cells

甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）占甲状腺癌的90%左右^［1］，其发病率每年增长约6%、成为世界上增长速度最快的肿瘤之一，也是甲状腺癌发病率快速增长的主要原因^［2］。PTC患者中癌症复发率约为15%，骨、肺组织远处转移率5%左右，部分患者甚至发生PTC特异性死亡^［3-4］。因此，如何早期识别侵袭性PTC并遏制其恶性进展尤为重要。

鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因的体细胞突变在PTC中的检出率约为80%，是PTC最常见、最重要的遗传突变事件^［5］。BRAF编码激酶结构域的点突变是其致癌性的主要原因。其中，第15外显子的第1799位点的胸腺嘧啶被腺嘌呤取代，导致蛋白质中第600位氨基酸残基由缬氨酸（V）突变为谷氨酸（E），即BRAF^V600E突变，占BRAF突变的95%^［6］。该突变可持续活化下游丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，促进细胞分裂、增殖和侵袭，最终诱发癌变^［6］。90%以上PTC患者的BRAF突变为BRAF^V600E突变，BRAF^V600E突变是PTC中最常见的突变类型。有研究证实，BRAF^V600E突变与PTC患者T、N分期正相关^［7］，是患者淋巴结转移的危险因素^［8-9］。更有意义的发现是，BRAF^V600E突变与PTC患者肿瘤多灶性、腺外侵犯、远处转移、¹³¹I治疗抵抗等具侵袭性的临床病理特征以及术后较高的复发率、病死率正相关^{［7，9-11］}。由此可见，靶向BRAF^V600E突变的治疗策略对预防PTC进展及治疗侵袭性PTC十分必要。

铁死亡是铁依赖性、脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡方式^［13-14］。肿瘤细胞代谢旺盛，铁需求量大、极易发生脂质过氧化，因而对铁死亡敏感^［15］。NRF2是细胞应对脂质过氧化损伤的重要调控蛋白，可调控下游蛋白而抵抗铁死亡^［16］。姜黄素（Curcumin，Cur）可通过上调NRF2下游HO-1蛋白的表达诱导高度侵袭性甲状腺癌——滤泡状甲状腺癌（Follicular thyroid carcinoma，FTC）细胞铁死亡，进而抑制其生长^［17］。B-CPAP细胞为BRAF^V600E突变PTC细胞株^［12］，而姜黄素能否诱导B-CPAP细胞铁死亡及其调控机制仍属未知。因此，我们对姜黄素调控Nrf2-TXNRD1轴诱导B-CPAP细胞铁死亡抑制细胞增殖迁移侵袭展开研究，期望为BRAF^V600E突变型PTC的治疗提供新思路和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

PTC细胞株B-CPAP、胎牛血清（普诺赛）；人甲状腺滤泡上皮细胞Nth-ori-3.1细胞（赛库）MTT细胞增殖及细胞毒性检测、总SOD活性、GSH及NADP+/NADPH检测试剂盒检测试剂盒（碧云天）；BODIPY™ 581/591 C11脂质过氧化传感器（ThermoFisher）；Ferrostatin-1（Fer-1）、（1S，3R）-RSL3（RSL3）（Selleck）；姜黄素（麦克林）。一抗TXNRD1、NRF2、SLC7A11、FTH、b-actin及二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP（Affinity）。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT检测

B-CPAP接种于96孔板，药物作用24 h后每孔加100 μL MTT工作液（90 μL培养液+ 10 μL MTT），培养4 h；加Formazan溶解液、100 μL/孔，混匀、37 ℃孵育3 h至紫色结晶全部溶解，测吸光度（l=570 nm）。

1.2.2 透射电镜

B-CPAP细胞种植于10 cm大皿，药物作用24 h，电镜固定液固定5 min。刮下细胞，2000 r/min、离心2 min，弃旧固定液后加1 mL新固定液，固定1 h。转移至1.5 mL Ep管内，补充固定液至满，4 ℃冰箱固定过夜。第二天将样品寄送至南京塞维尔公司进行透射电子显微镜样品制备和测试。

1.2.3 脂质活性氧（Reactive oxygen species，ROS）

B-CPAP细胞种植在共聚焦小皿中，药物干预后继续培养24 h。按照培养基∶脂质ROS探针=425∶75配脂质ROS探针工作液，500 μL脂质ROS探针工作液/皿，培养箱孵育30 min。培养基清洗小皿3次。加入20 μL DAPI、最后一次洗涤后保留部分培养基以保持小皿内湿润。锡箔纸包裹、放入冰盒中预冷，Zeiss荧光显微镜拍摄。

1.2.4 氧化水平检测

B-CPAP细胞种植于6孔板，药物干预后继续培养24 h。根据SOD、GSH、NADP ⁺/NADPH检测试剂盒说明书，制备相应待测标本。使用酶标仪，532、412及450 nm测量吸光度后数据处理，得出SOD、GSH、NADPH及NADP⁺浓度。

1.2.5 克隆形成实验

B-CPAP细胞接种于6孔板，培养14 d，4%多聚甲醛固定、0.2%结晶紫染色，拍照片并计算细胞克隆数。

1.2.6 迁移和侵袭

B-CPAP细胞接种于已预加无血清培养基的Transwell小室上层，下室加完全培养基。培养12 h，药物干预、培养24 h，多聚甲醛固定、结晶紫染色，采集图片。细胞侵袭实验需预先在小室上层铺一层基质胶，其余步骤同迁移。

1.2.7 免疫荧光

细胞接种于24孔板中的爬片，贴壁后药物干预、培养24 h、500 μL预冷的4%多聚甲醛固20 min，PBS洗3遍，每次5 min。加入封闭液1 （1 mL 1%BSA溶液+2 μL 0.2%Triton X-100）250 μL/孔，常温封闭8 min；PBS清洗后加入封闭液2 （1%BSA）250 μL/孔，常温封闭55 min，弃封闭液2，PBS清洗3次，每次5 min。加抗NRF2一抗稀释液（1∶200）， 4 ℃过夜。PBS洗3次，每次5 min，加二抗稀释液200 μL/孔，孵育60 min后PBS洗2次，每次5 min。加抗荧光淬灭封片液（含DAPI），双光子激光共聚焦显微镜（Olympus：FV-1200MPE SHARE）观察、采集图片。

1.2.8 Western blot

收集细胞加蛋白上样缓冲液（1X）裂解，BCA蛋白测定试剂盒进行定量。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品后，200 mA持续转膜2 h。TBST清洗，封闭液封闭，一抗NRF2（1∶1000）、TXNRD1（1∶1000）和内参β-actin（1∶1000），4 °C孵育过夜，二抗室温孵育2 h，HRP底物显色。图像结果用Image J软件处理。

1.2.9 生物信息学分析

从PubChem中下载姜黄素的sdf格式图像，并通过calculations将其转换为mol2格式；在UniProt中找到NRF2蛋白对应的Entry ID，在RCSB PDB中通过Entry ID找到并下载NRF2蛋白立体结构pdb格式图；应用AutoDockTool将NRF2与姜黄素进行对接，并以output.pdbqt格式存储对接结果；在Pymol中打开对接结果，用PLIP网站查找连接位点、通过pymol进行位点的修饰。

从癌症基因组图谱数据库（TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下载甲状腺癌患者转录组TPM格式数据，并进行log2转化。利用ggplot2包绘制甲状腺癌患者NRF2基因表达量与其下游基因表达量的相关性曲线。

读取预先整理好的tpms_log2数据，将样本分为正常样本与甲状腺癌肿瘤样本后，利用ggplot2画出两个样本组中的NRF2、TXNRD1表达情况；在xena上下载THCA的临床数据，筛选出需要的N stage列，将N stage中的N1a、 N1b等整合为N1期，并去除缺失数据NX；再筛选出其中的肿瘤样本部分，提取出与先前整理的肿瘤样本的tpms_log2数据交叉部分，再与其合并；最后利用ggplot2画图。

基于UCSCXena网站（https：//xena.ucsc.edu/）中TCGA甲状腺癌生存临床数据信息，使用survminer包中的surv_cutpoint函数，确定TXNRD的最佳截断值为5.173 2，将患者分为高表达组和低表达组，使用Kaplan-Meier方法绘制TXNRD的总体生存率（Overall survival，OS）生存曲线。

1.2.10 统计学分析

数据以均数±SD表示，组间差异采用单因素方差分析，P0.05表示差异具统计学意义。采用SPSS 19.0分析。

2 结果

2.1 Cur抑制B-CPAP细胞增殖

梯度浓度（0、 2.5、 5、10、 20、 40 μmol/L）Cur作用B-CPAP、Nth-ori-3.1细胞24 h，Cur剂量依赖性抑制B-CPAP细胞增殖（P0.05或P0.01）；20 μmol/L及其以下浓度的姜黄素对Nth-ori-3.1细胞增殖情况无显著影响，但40 μmol/L Cur可显著抑制Nth-ori-3.1细胞的增殖（P0.01）（图1a）；Cur浓度为20 μmol/L时，B-CPAP细胞抑制率约为50%（图1b），此后细胞实验操作Cur均采用20 μmol/L。

2.2 Cur诱导B-CPAP细胞铁死亡

透射电镜检测结果显示，Cur组细胞线粒体表现出萎缩、嵴断裂，膜肿胀等铁死亡样亚显微结构改变（图2a）。与Cur组相比，Fer-1（1 μmol/L）显著逆转Cur所致细胞死亡（P0.01）（图2b）。与Control组相比，Cur组细胞氧化型脂质ROS（绿色荧光）的平均荧光强度显著升高（33.22±7.58 vs 11.00±0.21，P=0.037），即Cur组细胞内脂质ROS水平显著升高（图2c），SOD水平、GSH水平及NADPH/NADP⁺比值降低（P0.01），而Fer-1可逆转Cur所致B-CPAP细胞的上述变化（P0.05）（图2d~f）。

2.3 Cur通过诱导B-CPAP细胞铁死亡抑制其增殖、迁移及侵袭

与Control组比较，Cur组细胞增殖、迁移、侵袭能力显著降低（P0.01或P0.001）；与Cur组相比，Fer-1（1 μmol/L）显著逆转Cur所致细胞的增殖、迁移、侵袭能力的抑制（P0.01或P0.001）。综上，Cur对B-CPAP细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制可被Fer-1部分逆转（图3）。

2.4 甲状腺癌组织NRF2、TXNRD1表达及对患者生存情况影响

将Cur与铁死亡相关蛋白进行分子对接分析，发现Cur与NRF2蛋白可能存在结合位点，且二者结合的关键位点为VAL-606，结合方式为氢键，结合能为-8.7 kcal/mol（图4a）。NRF2在甲状腺癌肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P0.001）（图4b），生物信息学分析发现，甲状腺癌组织中NRF2下游蛋白TXNRD1与NRF2相关性系数最高、为0.74（P0.001）（图4c）。在甲状腺癌肿瘤组织中，TXNRD1显著高表达（P0.001）（图4d），且淋巴结转移组（N1）表达量显著高于无淋巴转移组（N0）（P=0.019）（图4e）。基于肿瘤中TXNRD1的表达水平，将TCGA队列中的甲状腺癌患者分为两组，Kaplan-Meier生存分析结果显示，TXNRD1高表达组患者的总生存显著下降（P=0.001 1）（图4f）。

2.5 Cur降低B-CPAP细胞中NRF2活性

共聚焦显微镜检测NRF2蛋白在B-CPAP细胞中的定位，结果发现：与Control组相比，Cur组细胞核内NRF2蛋白明显减少（图5）。

2.6 Cur通过调控NRF2-TXNRD1途径诱导B-CPAP细胞铁死亡

Western Blot结果显示：与Control组比较，Cur组细胞SLC7A11、FTH表达显著降低（P0.01）（图6a、b）。为进一步验证NRF2-TXNRD1途径在Cur诱导B-CPAP细胞铁死亡中的作用，我们应用Western Blot检测Cur（20 μmol/L）、RSL3（0.02 μmol/L）、Fer-1（1 μmol/L）作用B-CPAP细胞24 h后NRF2、TXNRD1蛋白水平。与Control组相比，Cur组和RSL3组细胞NRF2、TXNRD1蛋白表达水平显著降低（P0.05或P0.01）；与Cur组相比，Fer-1+Cur组细胞NRF2、TXNRD1蛋白表达水平显著升高（P0.05）（图6c、d）。

3 讨论

姜黄素升高乳腺癌MDA-MB-231细胞^［18］、结直肠癌SW480细胞^［19］活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。我们的前期研究亦发现，姜黄素处理后，B-CPAP细胞ROS升高^［20］。ROS生成与细胞抗氧化防御系统失衡可诱发氧化应激，而氧化应激通过脂质过氧化、抗氧化系统失衡等多重机制驱动铁死亡^［12］。姜黄素可诱导滤泡状甲状腺癌FTC-133、FTC-238细胞铁死亡，而抑制二株细胞生长、迁移及侵袭，其机制与脂质ROS积累及上调HO-1表达相关^［16］。作为BRAF^V600E突变研究中最常用的PTC细胞株，深入研究姜黄素抑制B-CPAP细胞增殖、迁移及侵袭能力的机制，对优化PTC治疗策略尤为重要。受以上研究结果启发，我们设想在既往研究的基础上，进一步探究姜黄素能否通过升高B-CPAP细胞ROS水平而诱发细胞脂质过氧化，进而诱导铁死亡发生并挖掘其机制。

铁死亡是新发现的一种与铁、脂质和氨基酸代谢密切相关的细胞死亡类型^［13］，在肿瘤尤其是难治性肿瘤治疗中的潜在作用巨大^［14］。因此，铁死亡成为癌症治疗中极具前景的策略。本研究结果显示，姜黄素对B-CPAP细胞增殖、侵袭及迁移的抑制作用可被铁死亡抑制剂Fer-1逆转，结合姜黄素所致B-CPAP细胞线粒体的铁死亡特征改变、脂质ROS蓄积、抗氧化水平降低的变化情况，证实姜黄素可诱导B-CPAP细胞铁死亡。以上结果与姜黄素诱导肝癌细胞铁死亡的研究一致^［21］。

NRF2是细胞应对氧化应激损伤及抵抗铁死亡的关键调控蛋白。受ROS刺激后，NRF2由细胞浆进入细胞核并发挥转录活性，通过调控下游抗氧化蛋白，发挥抗氧化作用^［22］。活化的NRF2可激活200个以上靶基因的转录，这些基因涉及抗氧化反应^［23］、线粒体功能^［24］等方面。其中，NRF2与抗氧化基因硫氧还蛋白还原酶1（Thioredoxin reductase 1，TXNRD1）及铁死亡基因间的关系，已成为肿瘤研究中的热点。TXNRD1作为抗氧化酶，主要参与硫氧还原蛋白系统，是细胞内的辅助抗氧化系统，在调节、维持细胞氧化还原平衡发挥重要作用^［25］。但有关TXNRD1的研究较少。有研究证实，TXNRD1与肿瘤细胞增殖、凋亡、耐药密切相关^［26］。靶向抑制NRF2/TXNRD1可显著抑制SLC27A5缺失肝癌细胞的增殖、促进其凋亡^［26］。去铁胺通过激NRF2/TXNRD1轴减轻蛛网膜下腔出血后海马神经元的铁死亡和炎症^［27］。正常组织中，NRF2可抗氧化应激、抑制肿瘤形成。肿瘤细胞内NRF2的过度活化、TXNRD1的高表达可抵抗细胞内ROS的过度累积^{［23， 28］}，利于肿瘤细胞适应高氧化应激微环境，甚至在此恶劣、有限的微环境中获得显著的生存优势^［29-31］。NRF2、TXNRD1在多种恶性肿瘤高表达^［28］。由此可见，靶向NRF2成为肿瘤治疗新策略，NRF2也成为治疗甲状腺癌症的潜在治疗靶点^［32］。

细胞发生氧化应激反应时，TXNRD1、铁蛋白等保护基因受NRF2调控^{［27， 33］}，NRF2活化后通过上调TXNRD1表达而清除肿瘤细胞ROS，抑制细胞凋亡，进而促进其增殖、化疗耐受^{［23， 27， 32］}。目前已知，铁死亡相关基因均与NRF2的转录调控有关，NRF2可通过调控靶基因影响细胞的氧化应激、铁代谢调控铁死亡过程。姜黄素可降低B-CPAP细胞NRF2活性^［20］。鉴于前期研究基础，并综合国内外文献报道，我们设想姜黄素诱导B-CPAP细胞铁死亡而抑制其增殖、迁移及侵袭是否与NRF2-TXNRD1通路有关。

NRF2生理情况时锚定于细胞浆，受氧化应激因素刺激激活后，活化的NRF2发生核内移，因此核内NRF2表达量增加。Li等的研究结果显示，姜黄素通过在蛋白水平上促进NRF2降解而非影响NRF2转录活性而诱导非小细胞肺癌铁死亡^［34］。本研究通过分子对接分析证实，姜黄素与NRF2蛋白可能存在结合位点，免疫荧光共聚焦显微镜检测姜黄素处理后B-CPAP细胞NRF2定位情况，发现姜黄素通过降低NRF2入核而抑制其发挥转录活性。结合此次NRF2细胞定位分析结果及既往实验结果^［20］，我们推测姜黄素可能通过促进NRF2降解而降低活性NRF2数量。结合姜黄素通过增加HO-1的表达激活铁死亡通路而抑制FTC生长的研究报道^［16］，有望为姜黄素诱导甲状腺癌铁死亡相关研究提供新的理论基础。

综上所述，本研究发现姜黄素可通过抑制NRF2-TRNXD1轴诱导B-CPAP细胞铁死亡进而抑制其增殖、侵袭、迁移。为进一步完善课题内容，后续我们将继续深入研究NRF2-TRNXD1轴与铁死亡的关系。较多报道提示，姜黄素可与放疗、化疗联用以增强疗效并减轻副作用，且部分临床前研究支持其作为辅助治疗候选药物。期望我们的研究为临床BRAF^V600E突变型PTC的治疗提供新的实验基础。

参考文献

[1] Chen D W， Lang B H H， McLeod D S A， et al. Thyroid cancer ［J］.Lancet， 2023， 401（10387）： 1531-1544.

[2] Miranda-Filho A， Lortet-Tieulent J， Bray F， et al. Thyroid cancer incidence trends by histology in 25 countries： A population-based study ［J］.Lancet Diabetes Endocrinol， 2021， 9（4）： 225-234.

[3] Boucai L， Zafereo M， Cabanillas M E. Thyroid cancer： A review ［J］.Jama， 2024， 331（5）： 425-435.

[4] Kwon H， Lim W， Moon B-I. Number of tumor foci as a risk factor for recurrence in papillary thyroid carcinoma： Does it improve predictability？ ［J］.Cancers， 2022， 14（17）： 4141.

[5] Zhou C， Li J， Wang Y， et al.Association of BRAF gene and TSHR with cervical lymph node metastasis of papillary thyroid microcarcinoma ［J］.Oncol Lett， 2019， 17（1）： 183-194.

[6] Wei X， Wang X， Xiong J， et al.Risk and prognostic factors for BRAF^V600E mutations in papillary thyroid carcinoma ［J］.BioMed Res Int， 2022， 2022（1）： 9959649.

[7] Wang Q， Yu B， Zhang S， et al.Papillary thyroid carcinoma： Correlation between molecular and clinical features ［J］.Mol Diagn Ther， 2024， 28（5）： 601-609.

[8] Song J Y， Sun S R， Dong F， et al.Predictive value of BRAF^V600E mutation for lymph node metastasis in papillary thyroid cancer： A meta-analysis ［J］.Curr Med Sci， 2018， 38（5）： 785-797.

[9] Tao Y， Wang F， Shen X， et al. BRAFV600E status sharply differentiates lymph node metastasis-associated mortality risk in papillary thyroid cancer ［J］.J Clin Endocrinol Metab， 2021， 106（11）：3228-3238.

[10] Attia A S， Hussein M， Issa P P， et al.Association of BRAF^V600E mutation with the aggressive behavior of papillary thyroid microcarcinoma： A meta-analysis of 33 studies ［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（24）：15626.

[11] Shangguan L， Zhang P， Fang S， et al. Preliminary study on the relationship of BRAF mutations with the outcome of the first ¹³¹I radiotherapy and malignant biological characteristics in papillary thyroid carcinoma ［J］. Int J Gen Med， 2021， 14： 8981-8989.

[12] Jiang X， Stockwell B R， Conrad M.Ferroptosis： Mechanisms， biology and role in disease ［J］.Nat Rev Mol Cell Biol， 2021， 22（4）： 266-282.

[13] Chen X， Kang R， Kroemer G， et al. Broadening horizons： The role of ferroptosis in cancer ［J］.Nat Rev Clin Oncol， 2021， 18（5）： 280-296.

[14] Rodriguez R， Schreiber S L， Conrad M. Persister cancer cells： Iron addiction and vulnerability to ferroptosis ［J］. Mol Cell， 2022， 82（4）： 728-740.

[15] Ye S， Hu X， Sun S， et al.Oridonin promotes RSL3-induced ferroptosis in breast cancer cells by regulating the oxidative stress signaling pathway JNK/Nrf2/HO-1 ［J］.Eur J Pharmacol， 2024， 974： 176620.

[16] Chen H， Li Z， Xu J， et al. Curcumin induces ferroptosis in follicular thyroid cancer by upregulating HO-1 expression ［J］.Oxid Med Cell Longev， 2023， 2023： 6896790.

[17] Siraj A K， Parvathareddy S K， Pratheeshkumar P， et al.PD-L1 is an independent prognostic marker in middle eastern PTC and its expression is upregulated by BRAFV600E mutation ［J］.Cancers， 2021， 13（3）： 555.

[18] Hartl D M， Hadoux J， Guerlain J， et al.Risk-oriented concept of treatment for intrathyroid papillary thyroid cancer ［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab， 2019， 33（4）： 101281.

[19] Perillo B， Di Donato M， Pezone A， et al.ROS in cancer therapy： The bright side of the moon ［J］. Exp Mol Med， 2020， 52（2）： 192-203.

[20] Ren L， Zou M Y， Zhu X C， et al. Curcumin suppresses proliferation， migration and invasion of papillary thyriod cancer B-CPAP cells through the Keap1-Nrf2 pathway ［J］. J South Med Univ， 2023， 43（8）： 1356-1362.

[21] 任丽， 邹明远， 朱行春， 等. 姜黄素通过Keap1-Nrf2通路抑制甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞的增殖、迁移及侵袭［J］. 南方医科大学学报， 2023， 43（8）： 1356-1362.

[22] Gall Trošelj K， Tomljanović M， Jaganjac M， et al.Oxidative stress and cancer heterogeneity orchestrate NRF2 roles relevant for therapy response ［J］.Molecules， 2022， 27（5）： 1468.

[23] Wang R， Liang L， Matsumoto M， et al.Reactive oxygen species and NRF2 signaling， friends or foes in cancer？ ［J］.Biomolecules， 2023， 13（2）： 353.

[24] Panieri E， Pinho S A， Afonso G J M， et al.NRF2 and mitochondrial function in cancer and cancer stem cells ［J］.Cells， 2022， 11（15）： 2401.

[25] Dagnell M， Arnér E S J.Endogenous electrophiles and peroxymonocarbonate can link tyrosine phosphorylation cascades with the cytosolic TXNRD1 selenoprotein and the KEAP1/NRF2 system ［J］.Curr Opin Chem Biol， 2024， 83： 102522.

[26] Choi B-H， Kim J M， Kwak M-K.The multifaceted role of NRF2 in cancer progression and cancer stem cells maintenance ［J］.Arch Pharmacal Res， 2021， 44（3）： 263-280.

[27] Gao Q， Zhang G， Zheng Y， et al.SLC27A5 deficiency activates NRF2/TXNRD1 pathway by increased lipid peroxidation in HCC ［J］.Cell Death Differ， 2020， 27（3）： 1086-1104.

[28] Hu J， Cheng M， Jiang C， et al.Deferoxamine mitigates ferroptosis and inflammation in hippocampal neurons after subarachnoid hemorrhage by activating the Nrf2/TXNRD1 axis ［J］.Mol Neurobiol， 2024， 61（2）： 1044-1060.

[29] Patwardhan R S， Rai A， Sharma D， et al.Txnrd1 as a prognosticator for recurrence， metastasis and response to neoadjuvant chemotherapy and radiotherapy in breast cancer patients ［J］.Heliyon， 2024， 10（6）： e27011.

[30] Glorieux C， Liu S， Trachootham D， et al.Targeting ROS in cancer： Rationale and strategies ［J］.Nat Rev Drug Discov， 2024， 23（8）： 583-606.

[31] Zhou X， An B， Lin Y， et al.Molecular mechanisms of ROS-modulated cancer chemoresistance and therapeutic strategies ［J］.Biomed Pharmacother， 2023， 165： 115036.

[32] Gong Z， Xue L， Li H， et al.Targeting Nrf2 to treat thyroid cancer ［J］.Biomed Pharmacother， 2024， 173： 116324.

[33] Yan R， Lin B， Jin W， et al.NRF2， a superstar of ferroptosis ［J］.Antioxidants， 2023， 12（9）： 1739.

[34] Liu Z， Ma H， Lai Z.The role of ferroptosis and cuproptosis in curcumin against hepatocellular carcinoma ［J］.Molecules， 2023， 28（4）： 1623.

[35] Li Y， Yan H， Xu X， et al.Erastin/sorafenib induces cisplatin-resistant non-small cell lung cancer cell ferroptosis through inhibition of the Nrf2/xCT pathway ［J］.Oncol Lett， 2020， 19（1）： 323-333.

基金资助

安徽省教育厅自然科学研究重点项目(2024AH051250)

安徽省教育厅自然科学研究重点项目(2025AHGXZK30675)

安徽省卫生健康科研项目(AHWJ2024Aa10058)

蚌埠医科大学自然科学面上项目(2024byzd030)

蚌埠医科大学自然科学面上项目(2025byjbgs049)

安徽省高校中青年教师培养行动项目(JNFX2024038)

国家大学生创新训练项目(202410367033)

国家大学生创新训练项目(202410367050)

国家大学生创新训练项目(202510367072)