毛白杨E3泛素连接酶PtoCOP1.1调控杨树花青素积累

Anthocyanin accumulation regulated by E3 ubiquitin ligase PtoCOP1.1 in Populus tomentosa

摘要

为阐明COP1基因在林木植物中的功能特性，本研究以毛白杨（Populus tomentosa）为材料，克隆获得拟南芥AtCOP1同源基因PtoCOP1全长编码序列，生物信息学分析其序列特征与进化关系表明，杨属植物含3个拟南芥AtCOP1同源基因，其中同源性最高的成员命名为 COP1.1，PtoCOP1.1与AtCOP1的氨基酸相似性为81.21%。进化聚类中，毛白杨PtoCOP1.1与新疆杨PaCOP1.1、毛果杨PtrCOP1.1聚为自举支持率100%的分支，序列比对显示，三者氨基酸相似性分别为99.55%、98.51%，体现该基因在杨属中的高保守性。采用实时荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的表达模式，分析发现，PtoCOP1.1在毛白杨各组织中普遍表达，其中在韧皮部、叶柄和成熟叶中的表达水平较高。利用聚乙二醇介导的原生质体转化进行亚细胞定位，实验进一步证实，PtoCOP1.1-GFP融合蛋白特异性定位于细胞核。转录组分析显示，在毛白杨COP1.1基因敲除植株（Ptocop1.1-ko）突变体中，类黄酮生物合成通路被显著富集，花青素合成关键基因（LAR、F3H、ANS1等）表达显著上调。在高光处理后，与野生型（WT）相比，Ptocop1.1-ko植株中花青素积累显著增加。上述结果表明，COP1.1 在毛白杨中作为负调控因子通过抑制花青素合成通路，从而参与光信号介导的次生代谢过程，其功能在草本植物和杨属植物中具有保守性，为解析林木光信号转导机制提供了理论依据。

Abstract

To elucidate the functional characteristics of the COP1 gene in woody plants， this study cloned the full-length coding sequence of PtoCOP1， a homolog of Arabidopsis thalianaCOP1 （AtCOP1）， from Populus tomentosa and analyzed its sequence features and evolutionary relationships through bioinformatics. Bioinformatics analysis revealed that the Populus genus contains three AtCOP1 homologs， among which the member with the highest sequence similarity was designated COP1.1.PtoCOP1.1 shared 81.21% amino acid identity with AtCOP1. In phylogenetic clustering， PtoCOP1.1 from P. tomentosa formed a clade with PaCOP1.1 from Populus alba and PtrCOP1.1 from Populus trichocarpa with 100% bootstrap support， and sequence alignment showed amino acid identities of 99.55% and 98.51%， respectively， indicating that this gene is highly conserved within the Populus genus. Tissue expression patterns were analyzed by quantitative real-time PCR， and the results showed that PtoCOP1.1 was ubiquitously expressed in various tissues of P. tomentosa， with higher expression levels in the phloem， petioles， and mature leaves. Subcellular localization was performed using polyethylene glycol-mediated protoplast transformation， and the results further confirmed that the PtoCOP1.1-GFP fusion protein was specifically localized to the nucleus. Transcriptome analysis revealed that the flavonoid biosynthesis pathway was significantly enriched in the PtoCOP1.1 knockout mutant （Ptocop1.1-ko）， with key anthocyanin biosynthetic genes （LAR， F3H， ANS1， etc.） significantly upregulated. After high-light treatment， anthocyanin accumulation was significantly increased in Ptocop1.1-ko plants compared with the wild type （WT）. These results indicate that COP1.1 functions as a negative regulator in P.tomentosa by suppressing the anthocyanin biosynthesis pathway， thereby participating in light signal-mediated secondary metabolism， and that its function is conserved between herbaceous plants and the genus Populus， providing a theoretical basis for elucidating light signal transduction mechanisms in woody plants.

Graphical abstract

关键词

毛白杨 / 花青素 / E3泛素连接酶 / PtoCOP1

Key words

Populus tomentosa / anthocyanin / E3 ubiqutitin ligase / PtoCOP1

光信号作为植物生长发育的核心环境调控因子，不仅为光合作用提供能量，更重要的是通过复杂的光信号传导网络调控植物的形态建成、生理代谢及逆境响应。在这一精密调控系统中，COP1（Constitutive photomorphogenic 1）作为多个光受体下游的关键枢纽元件，其功能在模式植物拟南芥中已被深入阐明。COP1是一种具有 E3 泛素连接酶活性的核蛋白，在黑暗条件下通过与 SPA 等蛋白形成复合体，介导光形态建成正调控因子的泛素化降解，从而抑制光响应基因的表达；而在光照条件下，光受体的激活可抑制 COP1 活性，解除其对光信号通路的抑制^［1-2］。

花青素作为类黄酮代谢途径的重要产物，在植物应对环境胁迫中发挥着多方面的生理功能。这类水溶性色素能够有效吸收高能紫外辐射和过量可见光，作为内源性光保护物质减轻光氧化损伤；同时，其强大的抗氧化活性有助于清除逆境条件下积累的活性氧簇，维持细胞氧化还原稳态。研究表明，花青素在增强植物对干旱、低温、强光及病原侵染等多种逆境的抵抗能力中具有重要作用^［3-4］，如拟南芥中UGT79B2和UGT79B3通过调控花青素积累显著提高植株对冷、盐和干旱胁迫的耐受性^［5］。花青素的生物合成受多层级调控网络控制，其中光信号是核心环境调控因子^［6-7］。在拟南芥中，COP1介导的调控机制直接参与花青素合成：HY5作为光信号通路的关键转录因子，可直接结合花青素合成关键基因（如PAL、CHS、DFR、ANS 等）的启动子并激活其转录^［7］。光照条件下，光受体被激活后抑制COP1-SPA复合体的E3泛素连接酶活性，促进HY5蛋白积累^［8-9］，进而启动花青素合成途径。

然而，目前关于COP1功能的研究主要集中于一年生草本植物。木本植物与草本植物在生活史、生长发育策略及环境适应机制方面存在显著差异。乔木树种具有多年生、次生生长发达、季节性休眠等特性，这些特点决定了其光信号传导网络可能具有独特的调控机制^［10-12］。杨树作为林木生物学研究的模式物种，其基因组中虽已鉴定出 COP1同源基因，但该基因在木本植物光信号传导及次生代谢调控中的具体功能，特别是其对花青素积累的调控机制，尚缺乏直接的实验证据。

毛白杨（Populus tomentosa）是我国重要的乡土树种和用材树种，具有显著的生态和经济价值。本研究以毛白杨为材料，对其COP1同源基因PtoCOP1.1进行系统研究。通过生物信息学分析明确其序列特征及进化关系；利用分子生物学技术检测其组织表达模式；通过亚细胞定位实验验证其细胞内分布特性；并利用基因编辑技术构建突变体材料，在高光胁迫条件下分析其对花青素积累的调控功能。研究结果将揭示COP1在林木光信号传导及次生代谢调控中的功能特性，为解析林木光响应分子机制提供新的理论依据，同时也为林木抗逆育种提供潜在的基因资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

实验所用植物材料包括：野生型毛白杨（Populus tomentosa Carrière）由西南科技大学树木实验室保存并提供。

1.1.2 菌株与载体

实验所用菌株包括大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌EHA105（西南科技大学国际树木实验室提供）；载体包括：pEASY-T1/pEASY-Blunt（克隆载体）、pTEX-GFP（亚细胞定位载体）和pYLCRISPR-DH（基因编辑载体）。

1.1.3 主要试剂

分子酶类：Primer STAR Max高保真DNA聚合酶（Takara）、T4 DNA连接酶（Takara）、2×Tag Master Mix与2×KeyPo Master Mix（Vazyme）。

试剂盒：质粒提取与DNA纯化回收试剂盒（TIANGEN）；EasyScript一步法gDNA去除及cDNA合成试剂盒（全式金）；Perfect Start Green qPCR SuperMix（全式金）；植物总RNA提取试剂盒（康为）。

抗生素与植物激素：利福平、卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢曲松、特美汀；3-吲哚乙酸、萘乙酸、玉米素、乙酰丁香酮。

1.2 实验方法

1.2.1 PtoCOP1.1 基因克隆及序列分析

由于毛白杨全基因组序列信息尚未完全公开，本研究基于拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtCOP1的编码序列，通过NCBI数据库检索其近缘物种毛果杨（Populus trichocarpa）、银白杨（Populus alba）与胡杨（Populus euphratica）中的COP1同源基因序列。在高度保守区域设计特异性引物，以毛白杨cDNA为模板进行PCR扩增，克隆得到毛白杨PtoCOP1.1基因的完整CDS序列，本研究所有引物见表1。

通过Phytozome数据库检索毛白杨近缘物种（毛果杨、银白杨、胡杨）及模式植物（拟南芥、番茄Solanum lycopersicum、水稻Oryza sativa等）的COP1同源蛋白完整序列。利用MEGA 11软件对目标序列进行多物种同源性比对，并采用邻接法（Neighbor-Joining， NJ）构建系统发育树。

1.2.2 组织表达谱分析

组织表达分析采用实时荧光定量PCR技术。分别采集毛白杨的幼叶、成熟叶、老叶、木质部、韧皮部、叶柄、顶芽、侧芽、茎和根等10个组织样品，每个样品设置3个生物学重复。使用植物总RNA提取试剂盒（康为）提取总RNA，通过EasyScript一步法gDNA去除及cDNA合成试剂盒（全式金）反转录获得cDNA。以毛白杨UBQ基因为内参，使用Perfect Start Green qPCR SuperMix（全式金）在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应^［13］。采用2^-ΔΔCt 方法计算基因相对表达量，利用 SPSS 22.0软件进行单因素方差分析。

1.2.3 亚细胞定位

亚细胞定位分析通过构建PtoCOP1.1-GFP 融合表达载体进行。首先，通过PCR扩增获得 PtoCOP1.1基因的完整编码序列，将其克隆至 pTEX-GFP载体的多克隆位点，构建由35S启动子驱动的35S：：PtoCOP1.1-GFP重组质粒。经限制性内切酶酶切及测序验证正确后，采用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化法，将该重组质粒与核定位标记蛋白HMGB1-mCherry共同转染至毛白杨叶肉原生质体中。转染后的原生质体于22 ℃黑暗条件下培养16~20 h，随后利用激光共聚焦显微镜观察GFP与RFP的荧光信号。GFP 使用488 nm激光激发，500~530 nm波段接收；RFP使用561 nm激光激发，580~620 nm波段接收实验设置转染空载pTEX-GFP的原生质体作为阴性对照。

1.2.4 Ptocop1.1-ko基因编辑植株的构建

基于PtoCOP1.1基因的CDS序列，利用CRISPR在线设计平台（CRISPR-P 2.0）筛选获得3个特异性靶点^［14］。采用Golden Gate克隆方法，将设计的gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体进行组装。通过大肠杆菌转化、质粒提取及测序验证，获得正确的重组载体。将验证成功的重组载体转化至根癌农杆菌EHA105菌株。毛白杨的遗传转化采用叶盘法：选取无菌苗叶片，农杆菌悬浮液中浸泡10 min，随后转移至共培养基暗培养2 d。经过潮霉素（25 mg/L）抗性筛选、芽诱导及生根培养，获得再生幼苗。通过PCR扩增及测序分析靶位点序列，最终获得2个纯合Ptocop1.1-ko突变体株系（L1和L6）。

1.2.5 低温胁迫处理

将2 mo苗龄的野生型（WT）与突变体植株置于冬季自然低温环境（6~10 ℃）中处理7 d，进行表型分析。

1.2.6 高光胁迫处理方法

将生长至2 mo苗龄的野生型毛白杨（WT）和Ptocop1.1-ko突变体植株置于人工气候箱中，设置光强为800 μmol·m^-²·s^-¹（使用LED白光光源），温度22 ℃，相对湿度60%。处理期间持续光照16 h/暗期8 h，处理周期为7 d。以正常生长光强（200 μmol·m^-²·s^-¹）条件下培养的植株作为对照。处理结束后，采集第7 d的成熟叶片进行花青素含量测定。

1.2.7 花青素含量测定

采用酸性甲醇提取法测定花青素含量。具体步骤如下：称取50 mg毛白杨叶片组织置于预冷的1.5 mL离心管中，于液氮中快速冷冻后充分研磨成细粉；加入1 mL提取液（含5%乙酸和45%甲醇的酸性甲醇溶液），涡旋振荡混匀；于4 ℃条件下避光旋转萃取过夜（约16 h）；随后在室温下以12 000 r/min离心5 min，吸取上清液作为待测样品；将100 μL上清液加入96孔酶标板中，以等体积提取液作为空白对照；使用酶标仪分别测定样品在530 nm 和657 nm波长下的吸光度值。花青素含量按以下公式计算：每个生物学重复的结果取其3个重复的平均值，最终实验结果以3次生物学重复的平均值±标准差（Mean±SD）表示，单位为吸光度单位每克鲜重（AU/g FW）：花青素相对含量（AU/g FW）=［（A₅₃₀-0.25×A₆₅₇）×提取液体积（mL）］/样品鲜重（g），其中A₅₃₀和A₆₅₇分别为相应波长下测得的吸光值。

2 结果分析

2.1 毛白杨PtoCOP1.1基因的克隆和同源性分析

为明确PtoCOP1.1的进化关系与结构保守性，本研究对其进行了进化树分析和氨基酸序列比对。进化树如图1a所示，毛白杨PtoCOP1.1与银白杨PaCOP1.1序列一致性最高，表明该基因在杨属植物具有高度保守性。同时，在毛白杨所含3个COP1同源基因中，PtoCOP1.1与拟南芥AtCOP1的亲缘关系最近，提示其可能承担着与AtCOP1相似的核心调控功能。

进一步对氨基酸序列进行比对显示，COP1.1蛋白在不同植物物种间具有显著的结构保守性（图1b）。值得注意的是，其N端典型的RING锌指结构域和C端多个WD40重复结构域均高度保守。RING结构域作为E3泛素连接酶的关键功能区域，其保守性暗示PtoCOP1.1可能具备类似的泛素化活性；而WD40结构域则通常介导蛋白质相互作用，其在序列上的保守性进一步支持了该蛋白在光信号传导网络中可能扮演枢纽角色。

2.2 PtoCOP1.1基因组织表达谱和蛋白亚细胞定位分析

亚细胞定位结果显示，空载GFP对照组在烟草叶肉细胞中呈现均匀分布，荧光信号存在于细胞膜、细胞质和细胞核等各个区域。图2a中细胞核采用核定位标记蛋白HMGB1-mCherry进行标记，可特异性定位于细胞核，通过荧光信号指示细胞核位置，为PtoCOP1.1-GFP融合蛋白与细胞核的共定位分析提供参照。结果显示，PtoCOP1.1-GFP融合蛋白则特异性定位于细胞核内，核内荧光信号显著富集，细胞质中未检测到明显荧光分布，这一明确的核定位特征与PtoCOP1.1作为E3泛素连接酶的分子功能高度吻合。

组织表达谱分析结果表明，PtoCOP1.1在毛白杨各个组织中均具有表达，但表达水平存在显著差异。在韧皮部中的表达量最高，成熟叶和叶柄中的表达量次之，根和茎中的表达水平相对较低；而在侧芽中的表达量最为微弱。这种组织特异性表达模式提示PtoCOP1.1可能在光合作用活跃的组织中发挥主要功能，其在高表达的韧皮部组织中的优势表达，表明该基因可能参与调控韧皮部发育或物质运输过程。

2.3 PtoCOP1.1的CRISPR-Cas9基因敲除植株（Ptocop1.1-ko）的阳性苗鉴定及表型分析

如图3a和3b所示，经过分子鉴定，获得了两个纯合突变体株系，分别命名为Ptocop1.1-ko L1与L6。测序分析结果显示，这两个株系均在目标区域发生了编码框移码碱基突变，导致翻译提前终止（图3d），从而有效破坏了PtoCOP1.1蛋白的正常功能。

在连续处理7 d后，观察到Ptocop1.1-ko植株叶片出现显著的表型变化：与WT相比，突变体叶片中花青素积累量明显增加，表现为叶片基部及叶脉周边区域呈现明显的紫红色着色（图3c）。这一表型在两个独立突变株系中均稳定出现，表明该现象具有基因型特异性，而非随机变异。该结果表明，PtoCOP1.1作为负调控因子参与毛白杨低温胁迫响应中的花青素合成途径。其功能缺失解除了对花青素生物合成相关基因的抑制作用，从而增强了植株在低温条件下的花青素积累能力。

2.4 Ptocop1.1-ko 转录组分析

为进一步解析PtoCOP1.1基因的分子功能，通过比较野生型（WT）、高光处理的野生型（WT-HL）以及 Ptocop1.1-ko突变体的叶片的叶片转录组数据发现，在“WT-M vs WT-HL”和“WT-M vs Ptocop1.1-ko”两组比较中共同存在2642个差异表达基因（图4a），其中包括1227个共同下调基因和1415个共同上调基因，表明PtoCOP1.1功能缺失在一定程度上模拟了高光胁迫引起的转录组重编程。

对Ptocop1.1-ko突变体进行转录组学分析，KEGG通路富集结果显示类黄酮生物合成途径被显著富集（图4b）。进一步通过热图分析发现，花青素合成通路中的关键基因LAR、F3H3、F3H 及ANS1在突变体中表达水平显著升高。qRT-PCR验证实验证实这些关键基因在Ptocop1.1-ko突变体中的表达量确实显著上调。这些结果表明，PtoCOP1.1功能的丧失解除其对类黄酮合成途径关键基因的转录抑制作用，从而促进了花青素的生物合成。

2.5 Ptocop1.1-ko高光条件下花青素积累

为探究PtoCOP1.1在高光胁迫下对花青素积累的调控作用，本研究检测了野生型和突变体植株的花青素含量。研究结果显示（图5），在正常光照条件下，WT与Ptocop1.1-ko植株的花青素含量基本相当，未表现出显著差异（P0.05）。然而，经高光胁迫处理后，两种材料的生理响应呈现显著分化：WT和Ptocop1.1-ko植株的花青素含量均出现明显上升，但Ptocop1.1-ko突变体中的积累幅度显著高于WT，其花青素含量达到WT的3~6倍（P0.000 1）。这一现象表明，PtoCOP1.1功能的缺失，显著增强了植株在高光胁迫下合成花青素的能力。这表明，PtoCOP1.1可能通过调控光信号通路中的关键转录因子（如HY5）的稳定性，间接抑制花青素合成相关基因的表达。在Ptocop1.1-ko突变体中，这种抑制作用被解除，导致花青素生物合成通路被充分激活。

3 讨论

杨树作为我国重要的速生用材树种和生态修复树种，其遗传改良研究一直备受关注。光信号转导是植物生长发育的核心调控网络，COP1作为该通路的关键抑制因子，在草本植物中的功能已较为明确，但在木本植物中的调控机制尚待深入解析。本研究首次在毛白杨中克隆了PtoCOP1.1基因，发现其编码的蛋白具有典型的E3泛素连接酶特征，包含保守的RING锌指结构域和WD40重复结构域，与拟南芥AtCOP1序列相似性达81.21%，表明该基因在进化过程中功能较为保守^［1］。组织表达分析显示，PtoCOP1.1在韧皮部表达量最高，成熟叶和叶柄次之，这种表达模式暗示其可能主要在光合作用活跃的组织和物质运输通道中发挥功能。亚细胞定位实验证实PtoCOP1.1定位于细胞核，这与其作为E3泛素连接酶参与核内蛋白降解的分子功能相符^［1］。

研究表明，PtoCOP1.1在高光胁迫响应中起负调控作用，基因敲除突变体 Ptocop1.1-ko在高光条件下花青素积累显著增强，且花青素合成关键基因（LAR、F3H、ANS1等）表达上调，这表明 PtoCOP1.1 通过抑制花青素合成途径参与毛白杨的光胁迫响应。基于已有研究，我们推测PtoCOP1.1可能通过泛素化降解HY5-like等转录因子来调控花青素合成基因的表达^［7］。这一调控模式与草莓（Fragaria×ananassa）中FvCOP1靶向 FvHY5和FvMYB10进行泛素化降解的机制具有相似性^［15］，也与青蒿（Artemisia annua）中AaCOP1通过降解HY5-BBX21复合体调控次生代谢的方式形成跨物种呼应^［16］。在苹果（Malus domestica）中，COP1通过降解MYB转录因子影响花青素合成^［17］，在拟南芥中，COP1通过降解MYB转录因子PAP1和PAP2抑制花青素合成^［18］，提示木本植物中COP1可能通过多重靶蛋白调控次生代谢，这一机制值得在杨属植物中进一步验证。

值得注意的是，MYB转录因子家族是花青素合成通路的核心正向调控因子，其家族成员（如MYB75、MYB113、MYB114）可直接结合LAR、ANS等关键酶基因的启动子区域激活转录^{［17，19-20］}；而BBX家族蛋白作为光信号转导的重要中介分子，既能与HY5形成复合体增强调控活性，也可独立结合靶基因启动子参与花青素合成调控^{［9，21-22］}。结合已有物种中COP1与MYB、BBX的互作证据，推测PtoCOP1.1可能存在“PtoCOP1.1-MYB”“PtoCOP1.1-BBX”的多重靶蛋白调控模式：一方面通过降解HY5-like转录因子间接抑制花青素合成，另一方面可能直接泛素化降解MYB 或BBX家族成员，形成协同调控网络。后续可通过酵母双杂交、免疫共沉淀（Co-IP）及双荧光素酶报告实验，验证PtoCOP1.1与这些候选靶蛋白的相互作用及泛素化修饰关系，明确其分子调控的精准机制。

光信号与胁迫信号的交叉调控是植物适应环境的核心机制之一。研究发现拟南芥中CRY1-COP1-HY5轴介导蓝光对耐热性的调控，CRY1通过磷酸化依赖的方式与COP1互作，在不同温度条件下动态调控HY5蛋白稳定性^［23］。本研究中PtoCOP1.1在高光胁迫下的功能，暗示其可能参与光和温度信号的整合，未来可探究毛白杨中CRY家族蛋白与PtoCOP1.1的互作关系，解析木本植物特有的环境信号整合机制。此外，BBX21作为COP1靶蛋白，通过激活HY5转录放大光信号响应^［8］，这一调控模块是否在毛白杨中保守，也是值得深入研究的方向。

本研究表明，敲除PtoCOP1.1可显著增强毛白杨在高光胁迫下的花青素积累，提高植株对强光的适应性，为林木光信号转导机制提供了新见解，也为杨树抗逆育种提供了候选基因。未来可通过CRISPR/Cas9技术对PtoCOP1.1进行精准编辑，培育抗逆性增强的杨树新种质，应用于高光、干旱等逆境区域。

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基金资助

国家自然科学基金(32572019)

西南科技大学龙山人才计划支持项目(3510000221)