Notch通路基因 Djaph -1、 Djcsl 与 Djnumb 在涡虫再生中的功能研究

Functional roles of the Notch pathway genes Djaph-1， Djcsl and Djnumb in planarian regeneration

摘要

Notch信号通路是一种保守的细胞间通讯机制，在组织发育与稳态维持中发挥重要作用。为探究其在组织再生及干细胞调控中的作用，本研究选择涡虫为实验材料。鉴定了日本三角涡虫中的Notch信号通路基因aph-1、csl、numb的同源基因，并探讨了它们在涡虫再生过程中的生物学功能。研究结果显示，Djaph-1、Djcsl与Djnumb mRNA在整体涡虫中广泛表达，并在再生涡虫的芽基中富集表达。Djaph-1、Djcsl与Djnumb干扰均导致再生涡虫出现身体中线黑斑和眼点不对称的异常表型以及中枢神经系统再生缺陷，引起了不同再生时间点细胞增殖水平的变化以及眼点、表皮相关基因的表达变化。进一步研究表明，Djaph-1和Djcsl均可正调控Notch信号，而Djnumb则发挥负向调控作用。综上，Djaph-1、Djcsl与Djnumb参与调控干细胞增殖与分化，在涡虫再生过程中发挥关键作用。

Abstract

The Notch signaling pathway is a conserved intercellular communication mechanism that plays a crucial role in tissue development and homeostasis. To investigate its functions in tissue regeneration and stem cell regulation， planarians were used as an experimental model. Homologous of the Notch signaling pathway genes aph-1， csl， and numb were identified in Dugesiajaponica and their biological functions during planarian regeneration were characterized. The results showed that Djaph-1， Djcsl， and Djnumb mRNA were broadly expressed in whole planarians and were highly enriched in the regenerating blastema. Knockdown of Djaph-1， Djcsl， and Djnumb led to abnormal phenotypes such as black spots along the body axis and asymmetric eye spots， as well as defects in central nervous system regeneration. These phenotypes were accompanied by altered cell proliferation dynamics at different regeneration stages and chenges in the expression of eye- and epidermis-related genes. Further studies demonstrated that Djaph-1 and Djcsl positively regulate Notch signaling， whereas Djnumb functions as a negative regulator. Collectively， these results suggest that Djaph-1， Djcsl， and Djnumb are key regulators of stem cell proliferation and differentiation and play crucial roles in planarian regeneration.

Graphical abstract

关键词

涡虫 / 再生 / 干细胞 / 增殖 / Notch通路基因

Key words

planarian / regeneration / stem cells / proliferation / Notch signaling pathway genes

Notch信号通路是一种在进化上高度保守的细胞间通讯机制，广泛参与胚胎发育、细胞命运决定和组织稳态维持等核心生物学过程。该通路基因的突变或表达失调与多种恶性肿瘤，如淋巴瘤、白血病、肺癌及胰腺癌等的发生发展密切相关^［1-2］。因此，深入解析Notch信号通路基因的功能及其调控机制是理解细胞命运与疾病发生机制的关键环节。

Notch通路的级联反应依赖γ-分泌酶的作用，该酶可切割Notch受体的跨膜区，释放其胞内段（NICD），随后NICD转入细胞核与下游转录因子CSL（CBF-1/Su（H）/LAG-1）结合，启动基因转录^［3］。APH-1是构成γ-分泌酶的其中一个亚基^［4-5］，aph-1基因的缺失或突变会导致复合体组装失败，Notch受体切割受阻，进而抑制Notch信号通路的正常激活^［6-7］。拮抗因子Numb可通过与Notch受体或NICD结合抑制Notch信号的传导，其泛素化降解，会直接导致Notch信号的持续激活^［8-9］，进而导致细胞过度增殖，最终引发肿瘤。Notch信号通路各组分的同源基因已在多种后生动物中被鉴定^［10-13］，但这些基因在组织再生中的功能及分子机制仍未阐明。

Notch通路的异常激活与癌症发生密切相关。在乳腺癌中，Notch1与TGF-β信号共同诱导E-cadherin下调和波形蛋白（Vimentin）上调，增强肿瘤细胞迁移能力^［14］。有研究证实，Notch通路通过抑制极性蛋白（如Lgl）的表达，维持肿瘤干细胞（CSC）的去极化状态，从而维持干细胞的自我更新并抑制其分化^［15］。Notch信号可通过邻近细胞配体-受体间的作用，调控神经干细胞的增殖、分化及稳态维持^［16-17］。在神经母细胞中，Notch激活导致aPKC（非典型蛋白激酶C）的异常定位，从而抑制干细胞的分化^［18］。Notch通路下游的CSL干扰可加速神经元分化，而Notch信号的过度活化则阻碍分化进程，使细胞维持在未成熟状态^{［2， 19-20］}。这些研究表明，Notch通路基因在干细胞的干性维持及分化中发挥重要作用，其在组织再生中的功能，亟待系统阐明。

淡水涡虫具有极强的再生能力，其除头部顶端以外的任何一个身体片段均可再生为整体个体^［21］。涡虫再生能力源于大量的成体干细胞（neoblasts），这些细胞占体细胞比例高达20%~30%，是体内唯一可持续分裂的细胞群体^［22-23］。此外，涡虫的神经系统与哺乳动物在神经递质及神经元类型上具有较高的进化保守性，是研究神经系统再生与干细胞调控的理想模式生物^［24］。

本研究聚焦Notch信号通路中的3个关键基因Djaph-1、Djcsl与Djnumb，通过分析其在再生过程中的时空表达、干扰表型、对干细胞增殖的影响以及通路基因间的协同调控机制，系统评估其在涡虫再生过程中的功能。研究旨在揭示Notch信号在无脊椎动物再生过程中的核心调节网络，进一步拓展其在进化与再生生物学中的功能图谱，也为相关肿瘤发生机制及再生医学研究奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

日本三角涡虫（Dugesia japonica）为本实验室通过无性繁殖获得的单克隆品系。于20 ℃恒温避光培养，1 wk喂食1~2次新鲜牛肝匀浆，实验前饥饿1 wk。在再生实验中，通过在涡虫的咽前耳突后横切产生头部和尾部再生片段。

1.2 方法

1.2.1 基因的鉴定和生物信息学分析

通过交互BLAST，从实验室的涡虫转录组数据库（登录号：PRJNA627589）中获取与人、果蝇和线虫中的APH-1、CSL及Numb蛋白序列的最优核酸序列，分别命名为Djaph-1、Djcsl和Djnumb。通过NCBI ORFfinder网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）推导其所编码的氨基酸序列，通过NCBI保守结构域数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）对该蛋白的保守结构域进行鉴定，并借助TBtools软件（http：//mdr.tbtools.org/）进行可视化展示。通过交互BLAST找到Djaph-1、Djcsl、Djnumb在地中海涡虫（Schmidtea.mediterranea）中的同源基因（Smedaph-1、Smedcsl、Smednumb），并在地中海涡虫单细胞数据库（https：//digiworm.wi.mit.edu/）查询Smedaph-1、Smedcsl、Smednumb在不同细胞类群中的表达模式^［25］。

1.2.2 整体原位杂交（WISH）

原位杂交探针的合成使用digoxigenin-labeling kit（Roche，11175025910），扩增模板所用的引物序列详见表1。整体原位杂交（whole mount in situ hybridization，WISH）参照Dong等^［26］所述方法进行。主要步骤如下：每组选取6条涡虫，经预冷的2%HCl处死并去除粘液，立即用4%多聚甲醛固定，随后进行梯度甲醇脱水处理。样品经6%H₂O₂室温漂白和蛋白酶K处理后，加入含400 ng/mL探针的杂交液，于56℃杂交16 h以上。杂交信号通过BCIP/NBT（Roche，11681451001）显色液显色，使用Leica M165 C立体显微镜拍摄图像，并借助Adobe Photoshop进行图像处理。

1.2.3 RT-qPCR分析

使用RNAiso Plus（Takara，China）从6条再生3 d的涡虫中提取总RNA，随后通过HiScript Ⅲ- RT SuperMix（+gDNA wiper）（Vazyme，China）合成cDNA。本文使用引物均通过Primer Premier 6.0软件设计，具体信息详见表1。以Djef2为内参基因，采用2^-ΔΔCt 法计算目标基因的相对表达水平，每个实验组独立重复3次。RT-qPCR反应体系及程序参照Dong等^［26］所述方法进行。

1.2.4 RNA干扰实验（RNAi）

本RNAi实验参照Dong等^［26］的方法。将构建好的含Djaph-1、Djcsl、Djnumb序列的L4440干扰载体转化至大肠杆菌HT115中。将上述经转化处理的HT115菌株接种于LB培养基中，在37 ℃条件下振荡培养至菌液的OD值达到0.5~0.6。此时，向菌液中加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG诱导dsRNA表达，诱导时长为4 h。表达诱导完成后与牛肝匀浆混合喂食涡虫。以含有空载L4440的HT115菌饲喂组作为空白对照。每2 d饲喂涡虫1次，共6次。末次喂食1 wk后，通过WISH和RT-qPCR技术检测干扰效率。同时，于耳突后、咽前位置横切获得头、尾两个片段，以观察再生表型变化，并依据实验时间点收集相应样本用于后续分析。

1.2.5 免疫荧光

免疫荧光实验依照Dong等^［26］的方法进行。采用抗磷酸化组蛋白H3抗体（H3P，1∶200，Millipore，06-570）标记涡虫中正在分裂的干细胞，使用抗SYNORF 1抗体（3C11，1∶200，AB Company，528479）标记神经系统。使用Axio Zoom V16立体显微镜（Zeiss，Germany）进行图像采集，使用ImageJ软件统计分裂细胞的密度（细胞数量/面积的比值）。

1.2.6 统计学分析

所有统计学检验均使用SPSS v23.0软件进行。两组间的统计学差异比较采用非配对Student’s t检验，而两组以上则先进行单因素方差分析，随后进行事后LSD检验。所有数值均以均数±标准差（SD）的形式表示。P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 Djaph-1、Djcsl、Djnumb的鉴定和结构域分析

本研究采用交互BLAST方法，从转录组数据库中鉴定出了aph-1、csl、numb的同源基因，分别命名为Djaph-1、Djcsl和Djnumb。Djaph-1 cDNA为1128 bp，开放阅读框（ORF）长954 bp，编码氨基酸序列为317 AA。蛋白质结构域预测显示，DjAPH-1蛋白含有保守的APH-1结构域。Djcsl cDNA为2304 bp，ORF长2178 bp，编码氨基酸序列为725 AA。DjCSL蛋白含有CSL家族特有的结构标志，包括N端的LAG-1 DNAbind结构及C端的BTD结构。Djnumb基因cDNA长为2069 bp，ORF长1602 bp，编码氨基酸序列为533 AA。DjNumb含保守的PTB结构域（图1a）。

2.2 Djaph-1、Djcsl、Djnumb在涡虫中的表达模式分析

本研究首先通过地中海涡虫单细胞数据库查询了aph-1、csl、numb同源基因在涡虫不同细胞类群中的表达模式。结果显示，三基因均广泛表达于地中海涡虫多种细胞类群中，其中Smedcsl和Smednumb在干细胞和神经元中富集（图1b，1c）。接着通过WISH检测了Djaph-1、Djcsl、Djnumb在整体涡虫及不同再生时期涡虫中的表达模式（图1d）。结果显示：Djaph-1主要表达于整体涡虫的肠支和身体两侧的实质组织；在再生的第1、3、5 d，主要富集于芽基处。Djcsl主要表达于整体涡虫的身体两侧的实质组织；在再生的第1 d，主要富集于芽基处；在再生第3、5 d，主要富集于身体两侧。Djnumb主要表达于整体涡虫的肠支和身体两侧的实质组织；在再生第1、3 d，主要富集于芽基处；在再生第5、7 d，主要富集于肠支和身体两侧。RT-qPCR结果显示，Djaph-1在再生第3 d表达显著降低，在再生第7 d显著升高；Djcsl在再生第5 d显著升高；Djnumb在再生第7 d显著升高（图1e）。这些结果表明，Djaph-1、Djcsl与Djnumb可能参与了涡虫的再生过程。

2.3 Djaph-1、Djcsl、Djnumb干扰对涡虫再生的影响

为探究Djaph-1、Djcsl、Djnumb在涡虫再生过程中的功能，通过RNAi技术敲低这些基因，并观察其对再生的影响。形态观察结果显示，3基因干扰均未引起整体涡虫出现明显异常，但导致了不同程度的再生缺陷。Djaph-1干扰导致头部再生片段在再生的第5、7、9 d出现身体中线黑斑；Djcsl、Djnumb干扰导致头部再生片段在再生的第3、5、7 d出现身体中线黑斑，Djcsl干扰在再生第9 d身体中线黑斑已基本消失（图2c）。在尾部片段再生中，Djaph-1干扰后，第5、7 d出现眼点不对称现象；第9 d该现象有所减少；第11 d部分再生个体仍存在眼点不对称的表型。Djcsl干扰后，第5、7 d出现眼点不对称，该现象在第9 d已基本消失；第11 d，个体形态均恢复正常。Djnumb干扰后，第d天表现为再生的眼点较小；第7 d进一步演变为眼点不对称；第9、11 d，该表型个体数量减少，随之完全恢复正常形态（图2d）。以上结果表明，Djaph-1、Djcsl与Djnumb为涡虫再生过程中眼点发育所必需。

2.4 Djaph-1、Djcsl、Djnumb干扰对涡虫干细胞增殖的影响

为探讨Djaph-1、Djcsl、Djnumb干扰导致涡虫再生表型异常的细胞学机制，通过免疫荧光技术分析了再生过程中干细胞增殖水平的变化（图3a）。结果显示，Djaph-1 RNAi组头片段中的增殖水平在再生第1、3、7 d显著高于对照组；尾片段中的增殖水平在再生第3、7 d显著高于对照组。Djcsl RNAi组头片段中的增殖水平在再生第7 d显著高于对照组；尾片段中的增殖水平在再生第3、7 d显著高于对照组。Djnumb RNAi组头片段中的增殖水平在再生第1 d显著高于对照组，在再生第3、5、7 d显著降低；尾片段中的增殖水平在再生第3、5、7 d显著低于对照组（图3b和c）。以上结果表明，干扰Djaph-1或Djcsl的表达均破坏了干细胞增殖的时空动态平衡，这可能是导致再生表型缺陷的细胞学机制。相比之下，Djnumb干扰对细胞增殖的影响主要表现为整体抑制。在头部片段再生中，除第1 d增殖细胞数量升高外，第3、5、7 d均出现极显著降低。在尾部片段再生过程中，细胞增殖整体呈下降趋势。以上结果说明，干扰Djnumb抑制了干细胞增殖水平。

2.5 Djaph-1、Djcsl、Djnumb干扰对涡虫神经再生的影响

使用Anti-SYNAPSIN抗体标记再生涡虫的神经系统。结果显示，与对照组相比，Djaph-1、Djcsl与Djnumb干扰组的头部片段的神经系统再生未见明显异常，腹神经索于再生第7 d在尾尖处聚合（图4a）。尾部片段再生中，对照组再生第3 d时头神经节开始形成，腹神经索间出现横神经连接；至第5 d，横神经与新形成的头神经节相连，神经前联合闭合，并形成明显的脑分支；第7 d时头部神经系统已完全再生（图4b）。Djaph-1、Djcsl与Djnumb干扰组的头部神经系统与对照组相比无明显差异。这个结果表明，Djaph-1、Djcsl与Djnumb的干扰对再生神经系统的结构无明显影响。

2.6 Djaph-1、Djcsl、Djnumb干扰对基因表达的影响

通过RT-qPCR检测干扰Djaph-1、Djcsl和Djnumb对细胞增殖与分化相关基因、Notch通路基因表达的影响。结果显示：干扰Djaph-1导致眼点标记基因Djovo、Djtyrosinase，以及表皮分化标记基因Djprog1、Djagat1的表达则显著降低，DjNotch1、DjNotch2、DjNotch3、Djcsl的表达显著降低，而Djpcna和Djnumb的表达显著升高，DjpiwiA表达无显著差异（图5a）；干扰Djcsl使Djovo、Djtyrosinase、Djprog1、Djagat1的表达显著降低，Djaph-1、Djnumb的表达显著升高，而DjNotch3的表达显著降低，DjNotch1、DjNotch2、DjpiwiA、Djpcna表达无显著差异（图5b）；干扰Djnumb导致DjpiwiA、Djprog1、Djagat1、Djcsl的表达显著降低，Djpcna、Djovo、Djtyrosinase的表达无显著差异，而DjNotch1、DjNotch2、DjNotch3的表达显著升高，Djaph-1表达无显著差异（图5c）。

3 讨论

本研究鉴定并探讨了Notch通路中γ-分泌酶复合体的关键亚基Djaph-1、转录调节因子Djcsl与负调节因子Djnumb在涡虫再生中的功能。DjAPH-1、DjCSL与 DjNumb蛋白序列均含有同源蛋白所特有的保守结构域，表明三者在结构上具有进化保守性。研究表明，哺乳动物Numb蛋白在胸腺、脾脏、淋巴结及骨髓造血干细胞等多种干细胞相关组织中均有表达^［27-29］。地中海涡虫单细胞数据库查询结果显示，aph-1、csl和numb均在干细胞和神经系统中表达。Djaph-1、Djcsl、Djnumb在日本三角涡虫的芽基中富集，而芽基正是涡虫干细胞分化的关键部位，这些发现为三基因在涡虫干细胞中的调控作用研究奠定了基础。

本研究发现，干扰Djaph-1与Djcsl可促进涡虫在再生第3 d和第7 d时的干细胞增殖，但同时下调了眼点标记基因（Djovo、Djtyrosinase）以及表皮分化相关基因（Djprog1、Djagat1）的表达。这表明这两种基因在促进干细胞增殖的同时，抑制了眼点和表皮等组织的分化过程。类似地，在肿瘤干细胞（CSC）中沉默csl可促进细胞增殖与侵袭，进而驱动恶性肿瘤的发生与发展^［30-32］；Notch2的缺失也被报道可促进膀胱癌细胞的增殖^［33］。多项研究证实，Notch信号通路在大多数器官与组织的发育中起着关键作用。例如，线虫aph-1基因功能缺失会导致产卵异常、胚胎发育缺陷以及前咽结构发育异常^［12］；在果蝇神经干细胞中，Notch的激活有助于维持干细胞干性并抑制其过早分化^［34］。该通路可通过调控干细胞的不对称分裂参与胚胎发育及肿瘤发生。干细胞通过不对称分裂产生两个命运不同的子细胞：一个保留干性以实现自我更新，另一个则启动分化程序，发育为特定组织细胞^［15］。Notch通路能够通过抑制极性蛋白（如Lgl、Scribble）的表达，维持CSC的去极化状态，从而促进其自我更新^［35］。在上皮组织（如表皮、肠道）中，Notch通路蛋白可通过影响不对称分裂来决定子细胞走向自我更新或分化^［36-37］。本研究发现，干扰Djaph-1与Djcsl可能降低了Notch通路活性，进而通过抑制不对称分裂使干细胞更倾向于自我更新而非分化，最终导致组织分化受阻。

Numb作为Notch信号的负调控因子，可通过结合Notch胞内结构域抑制该通路活性^［38］。在不对称分裂过程中，Numb被不对称分配至其中一个子细胞，引导其进入分化程序。本研究干扰Djnumb会导致干细胞增殖减少与分化相关基因表达下调，这可能是由于Numb缺失影响了不对称分裂的正常进程，致使干细胞无法协调自我更新与分化。上述结果共同说明，Notch信号通路的异常（缺失或过度激活）均可能通过干扰不对称分裂机制，影响干细胞的自我更新与分化平衡。

Notch信号通路在神经发生中具有关键调控作用。研究表明，Notch通路通过影响放射状胶质细胞（RGCs）的分化参与小鼠神经发育过程^［39］；在涡虫中，干扰Notch1会减少Delta-2+胶质细胞的数量，进而影响周围神经系统的再生与维持^［40］。本研究中，干扰Djaph-1、Djcsl和Djnumb虽然影响了再生涡虫的干细胞增殖，但对抗SYNORF1抗体所标记的中枢神经系统整体结构并未造成显著改变。这可能是由于上述基因的干扰或许特异性地影响了某些神经元或胶质细胞亚群，而这些细胞数量的变化在整体结构标记中不易被察觉。因此，未来有必要通过荧光原位杂交技术，对各类神经元进行特异性标记与定量分析，从而明确Notch通路基因下调对神经系统不同细胞类型的精确影响。

本研究构建了Djaph-1、Djcsl与Djnumb之间的初步调控框架。Djaph-1干扰导致Djcsl表达降低，而Djnumb表达显著升高，同时使Notch基因表达显著降低；Djcsl干扰导致Djaph-1、Djnumb表达显著升高；Djnumb干扰导致Djcsl表达降低，而使Notch基因表达显著升高。这与现有研究结果一致，APH-1通过调控γ-分泌酶对Notch受体的蛋白水解活化，是CSL转录激活复合体形成并启动基因表达的必要上游事件，而Numb与Notch形成相互抑制的调控回路^［41］。

本研究对通路内部基因表达调控关系的解析主要停留在转录水平。未来有必要结合蛋白互作检测、单细胞或空间转录组学等技术，深入阐明Djaph-1、Djcsl与Djnumb之间的互作关系及其调控网络，进一步探索Notch通路与干细胞不对称分裂的关联机制，从而更加全面地揭示Notch信号通路在无脊椎动物再生中的保守功能与进化特征，并为阐明高等动物组织再生和肿瘤发生中的Notch相关机制提供重要参考。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32270501)

国家自然科学基金项目(32470463)

河南省重大公益项目(201300311700)

河南省高等学校重点科研项目(26A180012)