线粒体复合物Ⅰ亚基NDUFS4在东亚三角涡虫再生中的功能解析

The functional role of mitochondrial complex Ⅰ subunit NDUFS4 in planarian （Dugesia sp.） regeneration

摘要

本研究旨在探究线粒体复合物Ⅰ（Complex Ⅰ， CⅠ）的核心结构蛋白NADH脱氢酶铁硫蛋白4（NADH Dehydrogenase （Ubiquinone） Fe S protein 4， NDUFS4）在涡虫成体干细胞功能维持与神经再生过程中的作用。通过克隆获得东亚三角涡虫（Dugesia sp.）ndufs4基因并进行序列及结构预测分析，结果显示其编码蛋白在保守结构域和关键氨基酸位点高度保守。采用RNA干扰技术持续敲降ndufs4表达，测定再生涡虫胚基（blastema）生长速率，并结合原位杂交与免疫组织化学等实验技术检测成体干细胞（Neoblasts）的增殖与分化、神经再生情况。结果表明，ndufs4敲降导致涡虫再生速率显著减慢，神经再生明显受损；同时，干细胞标记基因表达水平下降，干细胞分化进程受阻。上述结果说明，NDUFS4是维持涡虫成体干细胞群体功能及促进神经再生的必需蛋白，在生物再生中发挥重要调控功能。

Abstract

This study aimed to elucidate the role of NADH dehydrogenase （ubiquinone） iron-sulfur protein 4 （NDUFS4）， a core structural subunit of mitochondrial complex Ⅰ （CⅠ）， in maintenance of adult stem cell function and neural regeneration in planarians. The ndufs4 gene was cloned from Dugesia sp.， and sequence together with structural prediction analyses revealed that the encoded protein is highly conserved in canonical domains and key amino acid residues. To assess its function during regeneration， RNA interference was used to knockdown the ndufs4 expression. Blastema growth rates in regenerating planarians were quantified， and in situ hybridization and immunohistochemistry were performed to assess adult stem cell （Neoblast） proliferation and differentiation， as well as neural regeneration. The results showed that ndufs4 knockdown significantly reduced regeneration speed and severely impaired neural regeneration. Concurrently， the expression levels of stem cell marker genes were markedly decreased， and stem cell differentiation was disrupted. Together， these findings indicate that NDUFS4 is an essential for maintaining the adult stem cell population and promoting neural regeneration in planarians， highlighting its critical regulatory role in biological regeneration.

Graphical abstract

关键词

东亚三角涡虫 / NADH脱氢酶铁硫蛋白4 / 再生 / 干细胞增殖与分化

Key words

Dugesia sp. / NADH dehydrogenase （Ubiquinone） Fe S protein 4 / regeneration / stem cell proliferation and differentiation

NADH脱氢酶铁硫蛋白4（NADH Dehydrogenase （Ubiquinone） Fe S protein 4， NDUFS4）是线粒体呼吸链复合物I的关键结构亚基，参与复合物Ⅰ的组装与功能维护^［1］。NDUFS4含有一个保守的cAMP依赖性蛋白激酶（Protein kinase A， PKA）磷酸化位点，该位点的磷酸化状态可调节复合物Ⅰ的活性，对于维持复合物Ⅰ的正确组装、结构稳定性以及高效催化NADH脱氢和电子传递过程至关重要，是细胞能量代谢的核心调控节点^［2］。此外，NDUFS4对于维持全酶复合物（Holo-complex）的稳定性是必需的^［3］。

在哺乳动物中，NDUFS4功能受损会导致线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性下降并引发能量代谢异常，干细胞增殖受阻、分化受限^［4］。另外，NDUFS4还在神经信号传递、线粒体嵴重塑^［5］、脂肪积累等多个生理过程中扮演着关键角色，其功能失调会引起细胞代谢紊乱和能量代谢障碍，与神经退行性疾病如Leigh综合征密切相关^［6-7］。尽管NDUFS4调控了稳态组织，参与了疾病发生，但是其在机体损伤后再生过程中，尤其是在成体多能干细胞介导的机体再生中的作用，仍缺乏直接的系统证据。

涡虫（planarian）因其体内丰富的成体多能干细胞Neoblasts（约占细胞总数的20%~30%）而具有高度的再生能力，是研究再生生物学与细胞命运调控的重要模型生物之一。在正常情况下，涡虫体内的Neoblasts驱动正常组织周转过程中的细胞更替以维持机体稳态^［8］；当涡虫组织受损或截断后，Neoblasts迅速增殖分化、迁移至伤口处完成组织再生，并在2 wk内重建出包括完整的神经系统、消化系统、肌肉组织等缺失的组织结构，最终成为一个功能健全的个体^［9］。目前，已有研究表明线粒体功能状态与涡虫干细胞分化及再生能力相关^［10-11］，线粒体动力学及代谢模式的改变是决定涡虫干细胞命运的调控因素之一^［12］。因此，在涡虫中解析线粒体复合物I相关基因ndusf4的功能，有助于理解能量代谢与机体系统再生过程之间的关系。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

东亚三角涡虫采自山东省淄博市沂源县，饲养于20 ℃鲁山山泉水中，每周喂食虾肉2次。实验前1 wk对东亚三角涡虫进行饥饿处理。

1.2 实验方法

1.2.1 基因克隆与生物信息学分析

采用Trizol法（Inxitrogen，美国）提取涡虫体内总RNA^［13］。以RNA为模板使用反转录试剂盒（艾科瑞，中国）获得cDNA。以cDNA为模板，设计ndufs4特异性引物，PCR获得ndufs4片段并测序。通过NCBI保守结构域搜索（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）鉴定蛋白保守结构域；通过在线软件CLUSTALW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行多序列比对和数据分析；使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）进行蛋白质三级结构预测与功能预测。系统发育树基于最大自然法（Mx）通过MEGA 11构建，所用蛋白质序列下载自NCBI数据库。相关基因的表达与定位信息，从地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）的单细胞转录组数据库（https：//planosphere.stowers.org/）中检索获得^［14］。

1.2.2 RNA干扰与qRT-PCR

挑选大小5~8 mm饥饿1 wk的涡虫，使用浓度为15 ng/μL的dsndufs4浸泡过夜，随后将涡虫转移到鲁山山泉中终止干扰（干扰实验重复6次）。以加入同样浓度dsGFP的涡虫做为对照组。使用qRT-PCR检测ndufs4干扰效率。所有实验均以G3PDH作为内参基因，按照2^-△△Ct 法测定表达率^［15］。

1.2.3 胚基测量

将成功敲降ndufs4涡虫切割进行3段式切割，选取再生3、5、7 d头部、躯干部、尾部涡虫片段使用2%盐酸处死后，在多聚甲醛中固定并封片。在SMA 1500体式显微镜（尼康，日本）拍摄涡虫胚基图像，使用Image J软件测定再生涡虫新生胚基面积以及涡虫整体面积。胚基再生速率为胚基面积与涡虫整体面积的比值，随后将该比值与对照组涡虫的数据进行标准化分析，以评估胚基再生的相对变化^［16］。

1.2.4 原位杂交与免疫组化

在37 ℃下使用T7 RNA聚合酶（Promega，美国）、DIG RNA标记混合液（Roche，瑞士）和重组RNase抑制剂（Accurate Biology，中国）合成ndufs4特异性单链RNA（ssRNA）探针，在不同时间段对再生涡虫进行原位杂交^{［13， 17］}，使用的标记信号包括干细胞标记基因piwiA⁺、晚期表皮祖细胞标记基因agat1⁺。对于免疫组化实验方法参考前人描述^{［13，18］}，使用anti-SYNORF1抗体（Millipore， USA）标记中枢神经。脑面积通过Image J测定头神经节面积（绿色虚线），并归一化为动物整体面积（黄色虚线），所得比值再与对照组数据进行标准化分析^［16］。

1.2.5 统计学方法

数据采用Student's t检验进行分析。结果表示为平均值±标准差（x±s）。统计学显著性设定为P<0.05（^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001）。

2 实验结果

2.1 东亚三角涡虫ndufs4的克隆及保守性分析

基于本实验室涡虫基因组数据库，我们克隆并获得了东亚三角涡虫ndufs4基因，分析发现其最大开放阅读框（Open Reading Frame）为567 bp，编码188个氨基酸，预测分子量~ 21.84 kDa。蛋白多序列比对显示，东亚三角涡虫NDUFS4包含该家族保守的NDUS4结构域（位于~第90至180位氨基酸处），其内部关键的PKA磷酸化位点（Ser129）在多数物种中高度保守（图1a）；序列相似性分析显示，除与黑腹果蝇的相似性较低（约35%）外，东亚三角涡虫NDUFS4与其它物种同源蛋白相似性均高于42%（图1b），表明他们为直系同源蛋白。同源建模显示，东亚三角涡虫NDUFS4、地中海涡虫（S.mediterranea）NDUFS4的三级结构与数据库模板（8rgp.1，小鼠大脑中线粒体复合体I亚基中NDUFS4）高度相似，核心α-螺旋与β-折叠的排布一致，关键功能域的拓扑结构近似重合（图1c），表明NDUFS4空间构象亦高度保守。系统进化分析显示，东亚三角涡虫NDUFS4与地中海涡虫的同源序列聚为一支，该分支与果蝇共同构成无脊椎动物分支；而脊椎动物（如斑马鱼、非洲爪蟾、人、小鼠）则聚为另一独立分支（图1d），表明NDUFS4在进化上总体保守且其系统发育关系与物种分类一致。随后，基于地中海涡虫单细胞转录组数据库定位预测分析显示，东亚三角涡虫ndufs4同源基因Smendufs4（SMED30020470）在多类Neoblasts亚群（Nb1-Nb12）中广泛高表达（图1e），暗示东亚三角涡虫ndufs4可能在涡虫的多类干细胞中同样高表达。综上，序列比对、结构与进化分析表明东亚三角涡虫NDUFS4为高度保守的NDUFS4家族蛋白，其可能定位于多类干细胞上，参与了涡虫的再生过程。

2.2 东亚三角涡虫ndufs4表达下调影响涡虫胚基的再生速率

为探究ndufs4是否参与涡虫再生，我们利用RNAi敲降ndufs4的表达。结果如图2a所示，与对照组（dsGFP）相比，干扰组（dsndufs4）涡虫中ndufs4的mRNA的表达下降至对照组的~18%。随后，对涡虫进行截断获得头部、躯干部、尾部3个片段，并分别统计再生3、5、7 d个各再生片段胚基生长情况。结果如图2b-c所示，在再生各时间点，ndufs4干扰组涡虫胚基再生速率均显著低于对照组，且其对涡虫后轴再生速率的抑制更加明显。上述结果表明，ndufs4表达下调降低涡虫胚基的再生速率。

2.3 ndufs4表达下调抑制涡虫神经系统再生

为了进一步评估ndufs4敲降后对涡虫组织再生的影响，我们以神经系统再生作为指标，采用荧光免疫组织化学技术检测涡虫躯干片段的神经再生情况。如图3a所示，再生5~10 d，ndufs4干扰组涡虫神经再生整体减慢，其头部神经节在再生第10 d仍未完全闭合；而对照组涡虫在再生5 d时头神经节几乎完全闭合，至再生第10 d时神经再生基本完成。随后，对再生涡虫脑面积进行定量分析显示，在再生各时间点，ndufs4干扰组涡虫脑面积均显著小于对照组（图3b），进一步表明ndufs4表达下调抑制了涡虫神经再生。

2.4 ndufs4影响涡虫干细胞增殖分化

为探究ndufs4影响涡虫胚基及神经再生的原因，我们使用qRT-PCR检测了躯干部再生涡虫干细胞标记基因piwiA⁺ 、增殖标记基因mcm2以及早期表皮分化标记基因Nb21.11e的表达。如4a所示，在再生第3、5、7 d，这三类基因的表达水平均显著下调（除再生第3 d mcm2无变化），暗示了ndufs4可能影响干细胞的数量、增殖与分化。随后我们通过原位杂交进一步检测干细胞标记基因piwiA⁺ 及晚期表皮祖细胞标记基因agat1⁺的表达。结果显示与对照组相比，ndufs4干扰组中piwiA⁺ 细胞在整个再生过程中均显著减少，与qRT-PCR结果一致；尤其在再生第5 d和第7 d，piwiA⁺ 细胞几乎耗竭。此外，再生第5 d时，ndufs4干扰组涡虫的agat1⁺细胞亦显著少于对照组（图4b-c）。综上所述，ndufs4可能通过影响干细胞的增殖与分化，进而影响涡虫的再生过程。

3 讨论

东亚三角涡虫具有丰富的成体多能干细胞并表现出强大的再生能力，当部分组织因损伤丧失功能结构时能够迅速重建缺失结构，从而成为再生生物学研究的重要模型生物^［19］。NDUFS4作为线粒体复合物Ⅰ的关键亚基，在维持线粒体功能、细胞能量供应以及神经元功能中具有重要意义^［20-21］。然而，涡虫组织再生如何受控于线粒体复合物I的功能亚基，特别是NDUFS4在成体干细胞介导的再生中的具体调控机制，依然未知。

在本研究中，我们首先克隆了东亚三角涡虫的ndufs4基因，发现其序列与结构在进化上高度保守。通过RNAi技术下调ndufs4表达，发现胚基再生速率及神经组织再生均被显著抑制。进一步研究发现其影响了涡虫成体干细胞的数量、增殖及分化，表明ndufs4在维持涡虫成体干细胞群体功能及促进神经再生中具有重要作用。在其他生物中，NDUFS4作为线粒体呼吸链复合物Ⅰ的关键亚基，与维持复合物Ⅰ的功能、细胞能量代谢稳态和氧化应激反应密切相关。NDUFS4功能受损可能导致复合物Ⅰ活性下降^［22］、ATP生成减少及代谢紊乱^［10］，进而影响干细胞分化。在涡虫中，已有研究表明线粒体质量低的亚群（low-mt neoblasts）在损伤后会优先分化，并伴随代谢模式由氧化磷酸化向糖酵解的快速转换，从而实现组织修复^［23］。因此，ndufs4可能也通过同样的方式，影响复合物Ⅰ功能或改变线粒体代谢状态参与再生过程；一旦其表达下调，将削弱涡虫干细胞的能量供应或代谢重编程能力，进而改变其增殖-分化动力学^［24］，最终表现为再生能力受损。

另一方面，NDUFS4在神经退行性疾病中发挥重要作用^［25］，其功能障碍主要通过影响线粒体TCA循环，降低ATP的生成，造成线粒体能量代谢的紊乱^［26］，进而引发神经元细胞线粒体膜电位丧失、细胞凋亡及自噬异常。此外，NDUFS4缺失还影响神经胶质细胞的功能^［27］，而神经胶质细胞在神经系统的稳态维持及神经损伤后的修复中起着关键作用。鉴于ndufs4敲降对涡虫神经再生的影响，后续可进一步检测其对再生后神经元功能维持与胶质细胞状态的具体作用，以及其是否影响神经元谱系的分化选择。此外，后续工作还应通过呼吸链活性测定、线粒体膜电位与ATP/ROS检测、以及能量代谢分析（例如氧化磷酸化与糖酵解的相对活性）等实验，直接评估ndufs4对线粒体功能与代谢网络的影响。

4 结论

综述所述，本研究在东亚三角涡虫中系统评估了ndufs4同源基因的保守性及其在再生过程中的功能，结果显示ndufs4在调控干细胞行为和促进神经组织再生中发挥了重要作用。这些发现不仅丰富了对NDUFS4蛋白家族在成体干细胞功能的认识，也为进一步探索线粒体功能障碍相关神经退行性疾病的发病机制及潜在治疗策略提供了新的理论依据。

参考文献

[1] Scacco S， Petruzzella V， Budde S， et al.Pathological mutations of the human NDUFS4 gene of the 18-kDa （AQDQ） subunit of complex Ⅰ affect the expression of the protein and the assembly and function of the complex［J］.J Biol Chem， 2003， 278（45）： 44161-44167.

[2] Papa S.The NDUFS4 nuclear gene of complex Ⅰ of mitochondria and the cAMP cascade［J］.Biochim Biophys Acta BBA Bioenerg， 2002， 1555（1-3）： 147-153.

[3] Calvaruso M A， Willems P， van den Brand M， et al.Mitochondrial complex Ⅲ stabilizes complex Ⅰ in the absence of NDUFS4 to provide partial activity ［J］.Hum Mol Genet， 2012， 21（1）： 115-120.

[4] Biswas S R， Tomsick P L， Kelly C， et al.Impaired complex Ⅰ dysregulates neural/glial precursors and corpus callosum development revealing postnatal defects in Leigh syndrome mice［J］.EMBO Mol Med， 2026， 18（2）： 677-701.

[5] Mise K， Long J， Galvan D L， et al.NDUFS4 regulates cristae remodeling in diabetic kidney disease［J］.Nat Commun， 2024， 15（1）： 1965.

[6] Ortigoza-Escobar J D， Oyarzabal A， Montero R， et al.Ndufs4 related Leigh syndrome： A case report and review of the literature［J］.Mitochondrion， 2016， 28： 73-78.

[7] Kruse S E， Watt W C， Marcinek D J， et al.Mice with mitochondrial complex Ⅰ deficiency develop a fatal encephalomyopathy［J］.Cell Metab， 2008， 7（4）： 312-320.

[8] Reddien P W.The cellular and molecular basis for planarian regeneration［J］.Cell， 2018， 175（2）： 327-345.

[9] Qu X J， Wang Y， Geng W J， et al.Construction of cDNA library and trial EST analysis from planaria （Dujesia japonica）［J］.Sichuan J Zool， 2008， 27（2）： 205-209.

[10] 曲晓娟， 王源， 耿文君， 等.东亚三角涡虫cDNA文库的构建及EST初步分析［J］.四川动物， 2008， 27（2）： 205-209.

[11] Goolab S， Terburgh K， du Plessis C， et al.CRISPR-Cas9 mediated knockout of NDUFS4 in human iPSCs： A model for mitochondrial complex Ⅰ deficiency［J］.Biochim Biophys Acta BBA Mol Basis Dis， 2025， 1871（2）： 167569.

[12] Sonsalla G， Malpartida A B， Riedemann T， et al.Direct neuronal reprogramming of NDUFS4 patient cells identifies the unfolded protein response as a novel general reprogramming hurdle［J］.Neuron， 2024， 112（7）： 1117-1132.

[13] Pan X， Zhao Y， Li Y， et al.Mitochondrial dynamics govern whole-body regeneration through stem cell pluripotency and mitonuclear balance［J］.Nat Commun， 2024， 15（1）： 10681.

[14] Martín-Durán J M.General principles of planarian embryogenesis and its analysis by in situ hybridization and immunohistochemistry methods［J］.Methods Mol Biol， 2018， 1774： 405-421.

[15] Zeng A， Li H， Guo L， et al.Prospectively isolated tetraspanin⁺ neoblasts are adult pluripotent stem cells underlying planaria regeneration［J］.Cell， 2018， 173（7）： 1593-1608.

[16] Livak K J， Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^{-ΔΔ Ct} method［J］.Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[17] Ziman B， Barghouth P G， Maciel E I， et al.TRAF-like proteins regulate cellular survival in the planarian Schmidtea mediterranea ［J］.iScience， 2020， 23（11）： 101665.

[18] Gao L， Li A， Lü Y， et al.Planarian gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase （GILT） is required for gram-negative bacterial clearance［J］.Dev Comp Immunol， 2021， 116： 103914.

[19] Zhang Y， Wu W， Gao L， et al.Protein arginine methyltransferase 1 mediates regeneration in Dugesia japonica ［J］.Biochem Biophys Res Commun， 2020， 524（2）： 411-417.

[20] Guo L.Genetic and genomic insights into planarian biology［J］.Annu Rev Genet， 2025， 59（1）： 315-340.

[21] Shil S K， Kagawa Y， Umaru B A， et al.Ndufs4 ablation decreases synaptophysin expression in hippocampus［J］.Sci Rep， 2021， 11（1）： 10969.

[22] Huff A， Oliveira L M， Karlen-Amarante M， et al.Ndufs4 inactivation in glutamatergic neurons reveals swallow-breathing discoordination in a mouse model of Leigh syndrome［J］.Exp Neurol， 2025， 385： 115123.

[23] Ingraham C A， Burwell L S， Skalska J， et al.NDUFS4： Creation of a mouse model mimicking a complex Ⅰ disorder［J］.Mitochondrion， 2009， 9（3）： 204-210.

[24] Mohamed Haroon M， Lakshmanan V， Sarkar S R， et al.Mitochondrial state determines functionally divergent stem cell population in planaria［J］.Stem Cell Rep， 2021， 16（5）： 1302-1316.

[25] Cabello-Rivera D， Sarmiento-Soto H， López-Barneo J， et al.Mitochondrial complex Ⅰ function is essential for neural stem/progenitor cells proliferation and differentiation［J］.Front Neurosci， 2019， 13： 664.

[26] van de Wal M A E， Adjobo-Hermans M J W， Keijer J， et al.Ndufs4 knockout mouse models of Leigh syndrome： Pathophysiology and intervention［J］.Brain， 2022， 145（1）： 45-63.

[27] Piroli G G， Manuel A M， McCain R S， et al.Defective function of α-ketoglutarate dehydrogenase exacerbates mitochondrial ATP deficits during complex Ⅰ deficiency［J］.Redox Biol， 2023， 67： 102932.

[28] Aguilar K， Comes G， Canal C， et al.Microglial response promotes neurodegeneration in the Ndufs4 KO mouse model of Leigh syndrome［J］.Glia， 2022， 70（11）： 2032-2044.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(32470518)

山东省自然科学基金面上项目(ZR2022MC022)

山东省自然科学基金面上项目(ZR2024MC154)