飞燕草素保护视觉机制：NHANES人群数据、网络药理学与细胞实验整合

Protective mechanism of delphinidin on vision： Integration of NHANES population data， network pharmacology， and cell experiments

摘要

为阐明飞燕草素的视觉保护机制，本研究探讨了膳食花青素/飞燕草素摄入与视野丢失风险的关联。基于美国国家健康与营养调查（NHANES）（2007—2008）横断面数据的分析显示，飞燕草素摄入与视野丢失风险显著负相关（OR值：0.665、0.609、0.640）。结合网络药理学与细胞实验发现，飞燕草素对光损伤的视网膜感光细胞（661W）具有保护作用，其机制涉及抑制铁死亡。飞燕草素能提高细胞活力，维持线粒体膜电位，减少脂质活性氧和铁蓄积，并调控铁死亡相关蛋白表达（上调GPX4/FTH1，下调PTGS2）。该研究从人群到细胞层面揭示了飞燕草素通过保护线粒体功能与抑制铁死亡来防护视网膜光损伤，为其作为营养干预策略提供了科学依据。

Abstract

To elucidate the visual protective mechanisms of delphinidin， this study investigated the association between dietary anthocyanin/delphinidin intake and the risk of visual field loss. Based on NHANES （2007—2008） cross-sectional data， the analysis from participants aged 40+ revealed a significant negative correlation between delphinidin intake and the risk of visual field loss （ORs： 0.665， 0.609， 0.640）.Combined with network pharmacology and cell experiments， it was found that delphinidin exerts a protective effect on light-damaged 661W photoreceptor cells by inhibiting ferroptosis. Delphinidin enhanced cell viability， maintained mitochondrial membrane potential， reduced lipid ROS and iron accumulation， and modulated the expression of ferroptosis-related proteins （upregulating GPX4/FTH1， downregulating PTGS2）. These findings provide translational evidence supporting delphinidin's role in mitigating retinal photodamage through mitochondrial protection and ferroptosis suppression.

Graphical abstract

关键词

美国国家健康与营养调查 / 视觉损伤 / 飞燕草素 / 氧化应激

Key words

National Health and Nutrition Examination Survey / visual impairment / delphinidin / oxidative stress

视觉健康是人类生活质量和社会参与的核心要素，而视觉功能障碍已成为一项紧迫且日益严峻的全球公共卫生问题^［1］。全球人口结构的快速老龄化正显著推高对眼健康服务的需求。令人忧虑的是，尽管许多导致失明和视力障碍的原因（如白内障和未矫正的屈光不正）在理论上是可以预防或治疗的，但最新全球疾病负担研究揭示，2010至2019年间，50岁及以上成年人中可避免的视力障碍（包括失明和中重度视力障碍，MSVI）的总体粗略患病率并未显著降低。随着人口老龄化加剧、电子屏幕暴露时间延长以及糖尿病等代谢性疾病流行，预测到2050年全球失明和严重视力障碍人口将突破9亿^{［2， 3］}。这些疾病不仅导致视觉质量下降和生活能力丧失，还显著增加抑郁、认知障碍及意外伤害风险^［4-6］。传统干预手段主要聚焦于晚期治疗，而开发基于早期功能损伤标志物的可干预风险因素特别是营养因子已成为视觉健康研究的关键方向。

花青素的生物活性核心在于其卓越的氧化还原特性，这一特性源自其分子结构中的酚羟基基团。在生理环境中，这些基团可提供氢原子或电子，有效淬灭多种活性氧和活性氮自由基^{［7， 8］}。该研究表明，红肉甜樱桃中提取的花青素，在体外模拟消化后，展现出显著的抗氧化活性，能有效保护人肠道Caco-2细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激损伤，并且这种保护作用显著强于维生素C^［9］。此外在眼部疾病中，花青素同样展现出优秀的保护作用，有研究表明，蓝莓花青素提取物及其主要成分花青素-3-葡萄糖苷对高糖环境下的糖尿病视网膜病变具有显著保护作用^［10］。在分子层面，花青素能够抑NF-κB和MAPK等炎症信号通路的激活，减少TNF-α、IL-6等促炎因子的产生^［11-14］。花青素对视觉系统的另一独特价值在于其优异的生物屏障穿透能力，不同于许多大分子抗氧化剂，花青素可同时穿越血-视网膜屏障和血-脑屏障，直接作用于视网膜神经上皮、黄斑区等深层眼组织结。这一特性使花青素能够在眼底微环境中发挥局部保护作用，包括调节微血管通透性、增强内皮细胞功能、促进视网膜血流灌注等^{［15， 16］}。在大鼠视网膜光化学损伤模型中，黑米皮花青素处理显著提高了视网膜组织中谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转移酶的活性，同时降低了脂质过氧化产物丙二醛的水平，从生化和组织学层面验证了其对视网膜的防护效能^［17］。

本研究整合了NHANES数据库分析与网络药理学方法，系统探讨了花青素及其六种单体膳食摄入与视野缺损风险的关联。人群分析结果显示，膳食中飞燕草素的摄入与视野缺损发生率呈显著负相关。基于这一发现，进一步通过网络药理学方法预测了飞燕草素可能作用的靶点及相关信号通路，此外，细胞实验也验证了飞燕草素在维持视觉健康方面的生物学功能，初步揭示了其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究设计和受试者

这项横断面研究的数据摘自2007—2008 年全国健康与营养检查调查一项评估美国成年人健康和营养状况的计划^［18］。NHANES参与者在家庭访谈中提供了人口统计学、社会经济和医学信息。使用移动检查中心进行身体和实验室检查。NHANES研究的详细设计和数据可在https：//www.cdc.gov/nchs/nhanes/about_nhanes.htm上获得。参与者将满足一下标准的人：1） 接受FDT视野测试；2） 了解花青素总摄入量及其子类的信息。选择过程如图1所示。NHANES 调查协议已获得美国国家卫生统计中心伦理审查委员会的批准。因此，机构审查委员会的批准被医院伦理审查委员会豁免。

1.2 方法

1.2.1 花青素摄入量

本研究主要评估从食物中摄入花青素的情况。使用饮食研究营养数据库（FNDDS）代码对食物类型进行精制，该代码描述了花青素含量。相关的FNDDS 4.1版用于2007—2008年的调查周期。分析包括六种花青素类型（矢车菊素、矮牵牛素、飞燕草素、锦葵素、锦葵素、天竺葵素和芍药素）以及所有食物中的花青素总摄入量^［19］。如果花青素总摄入量为0 mg，则视为无摄入量，如果摄入量超过0 mg，则视为摄入。

1.2.2 视野丢失评估方法

视野评估采用频率加倍技术（FDT），依据NHANES 2007—2008年周期的标准化方案执行。使用Humphrey Matrix视野检测仪及N-30-5筛查协议，对每位参与者的双眼分别进行两次测试，共检测19个视野位点。视野丢失的判定严格遵循官方定义的2-2-1算法：即单眼在两次测试中，均须有至少2个位点的敏感度低于年龄校正后的1%概率阈值（P<1%），且至少1个异常位点在两次测试中重叠。所有分析均排除了存在≥2次假阳性响应、≥2次盲点定位失败或技术人员记录到注视偏离的不可靠测试数据，以确保结果的准确性。最终判定标准为：若双眼检测结果均为阴性（正常），则定义为正常视野；若单眼或双眼检测结果为阳性（满足2-2-1标准），则判定为视野丢失。分析时采用NHANES推荐的眼科样本权重进行加权校正，并遵循标准化质量控制流程（NHANES操作手册）。

1.2.3 统计方法

本研究基于2007—2008年NHANES横断面数据，纳入40岁及以上完成FDT视野检测及膳食花青素评估的参与者。视野丢失通过频率加倍技术（FDT）结合2-2-1算法判定（双眼或单眼满足异常阈值）。统计分析采用R语言（4.2.1），首先通过加权卡方检验比较花青素摄入组与未摄入组的视野丢失率差异，随后构建三阶段多因素加权logistic回归模型：模型1（未调整）、模型2（调整年龄、性别、种族）、模型3（进一步纳入教育程度、婚姻状况、贫困指数、BMI及糖化血红蛋白），以评估花青素总摄入量及其单体与视野丢失的关联性（结果以OR及95%CI表示）。

1.2.4 飞燕草素的靶点获取

利用SwissADME平台预测其类药性及基于结构的靶点，通过SEA服务器基于化学相似性进行靶点预测，从TCMSP数据库中检索已报道的相关靶点。汇集三方结果并经UniProt数据库标准化去重后，最终获得208个飞燕草素的潜在作用靶点基因。

1.2.5 视觉损伤靶标收集

我们在GENECARD数据库中，使用Visual damage为关键词，并且以“智人”作为限制，筛选相关性前2000的靶标。

1.2.6 交集靶点筛选与功能分析

将飞燕草素的潜在靶点与视神经疾病相关靶点通过SangerBox工具进行交集分析，获得共同作用靶。进一步采用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对交集靶点进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路注释，筛选条件为P值＜0.05，以揭示飞燕草素调控视神经疾病的潜在生物学机制。

1.2.7 抗体与试剂

本研究中使用的小鼠源一抗包括：抗FTH1抗体（货号 #3998）、抗PTGS2抗体（货号 #12282）以及抗GPX4抗体（货号 #52455）。细胞活力检测采用CCK-8试剂盒（Elabscience， E-CK-A362）；细胞死活双染使用Calcein-AM/PI染色试剂盒（Elabscience）。线粒体膜电位检测采用JC-1染料（Solarbio）；细胞内脂质活性氧水平使用BODIPY™ 581/591 C11探针进行标记；胞内游离亚铁离子（Fe²⁺）分别采用Ferroorange探针（DOJINDO）进行荧光染色。实验使用飞燕草素产品编号 PS1703，HPLC 检测纯度 >98%）购自成都普思生物科技股份有限公司。

1.2.8 细胞培养

小鼠视网膜感光细胞661W（购自上海奥禄生物科技有限公司）使用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO₂的湿润培养箱中进行培养。当细胞融合度达到80%~90%时进行传代。视网膜光损伤（RPD）模型通过定制光照系统（2，600±200 lx白光）建立，光照时长为24、48或72 h。在进行48 h光照暴露前，细胞使用2.5、5 μmol/L飞燕草素预处理30 min。

1.2.9 细胞活力检测

为评估飞燕草素对光诱导细胞毒性的影响，采用CCK-8法进行检测。将661W细胞以每孔5×10³个的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，设置不同光照时间（24、48、72 h）及不同浓度飞燕草素（1~15 μmol/L）预处理组。在2600 lx光照强度下处理相应时间后，每孔加入CCK-8试剂（Elabscience， E-CK-A362），于37 ℃孵育1 h，最后使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度值，并计算细胞相对活力。

1.2.10 细胞形态与密度观察

通过结晶紫染色和相差显微镜观察细胞形态与密度的变化。实验结束后，弃去培养液，使用4%多聚甲醛固定细胞，随后用0.1%结晶紫溶液染色。染色完成后，在显微镜下观察并采集图像，以评估细胞密度和形态学改变。同时，在药物处理及光照过程中，直接使用相差显微镜对活细胞进行实时形态学观察并记录。

1.2.11 活/死细胞染色

采用Calcein-AM/PI双染试剂盒（Elabscience）区分活细胞与死细胞。处理结束后，使用PBS轻轻清洗细胞两次，随后按照说明书配制工作液并加入孔内，在37 ℃下避光孵育30 min。孵育完成后，立即使用荧光显微镜进行观察，其中Calcein-AM可将活细胞标记为绿色荧光，PI可将死细胞核标记为红色荧光。

1.2.12 线粒体膜电位检测

使用JC-1荧光探针（Solarbio）评估线粒体膜电位的变化。收集处理后的细胞，按照说明书加载JC-1工作液，并于37 ℃孵育20 min。孵育结束后，使用PBS清洗细胞以去除未结合的染料，随后分别通过共聚焦显微镜观察荧光分布，并使用流式细胞仪进行定量分析。

1.2.13 脂质过氧化物检测

为检测光损伤诱导的脂质过氧化水平，采用BODIPY™ 581/591 C11探针进行染色。处理后的细胞经PBS清洗，随后与适当浓度的探针工作液在37 ℃下避光孵育30 min。孵育结束后，再次用PBS清洗细胞，重悬后立即通过流式细胞仪检测荧光强度的变化，以分析细胞内脂质活性氧（ROS）的水平。

1.2.14 细胞内亚铁离子检测

采用Ferroorange探针（DOJINDO）特异性检测胞内游离亚铁离子（Fe²⁺）。细胞经不同处理后，移除培养基，加入含有5 μmol/L Ferroorange探针的无血清培养基，在37 ℃培养箱中避光孵育30 min。孵育完成后，用PBS轻轻清洗，随后分别通过共聚焦显微镜进行荧光成像观察，并使用流式细胞仪进行定量分析，荧光强度与Fe²⁺浓度成正比。

1.2.15 蛋白质印迹分析

为探讨飞燕草素作用的分子机制，通过Western Blot检测关键蛋白表达。收集细胞并提取总蛋白，经BCA法定量后，进行SDS-PAGE电泳并转至PVDF膜。封闭后，膜分别与以下一抗4 ℃孵育过夜：抗GPX4抗体（#52455）、抗PTGS2抗体（#12282）和抗FTH1抗体（#3998）。随后与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，最后使用ECL化学发光试剂显影，并利用成像系统采集图像进行半定量分析。

2 结果

2.1 人群特征

在这项研究中，2237名参与者，其中视野受损的参与者有245人，未存在视野受损的参与者共1992人，表1，视野丢失平均年龄相较于未受损的参与者年纪更大，并且较高的糖化血红蛋白水平与视野丢失相关。此外，花青素总摄入及其六种单体摄入中，是否摄入飞燕草素、锦葵素与视野受损相关。

2.2 花青素及其单体摄入与视野丢失的关系

关联分析结果显示，花青素总摄入与视野丢失风险呈显著负相关（模型2：OR=0.684，P=0.045）。对不同单体的分析表明，飞燕草素在所有调整模型中均表现出最稳定且显著的负相关（模型1-3的OR值分别为0.665、0.609、0.640，均P<0.05）；锦葵素（Malvidin）同样在所有模型中保持显著负相关，而矢车菊素（Cyanidin）仅在模型2中达到统计学显著。这些结果提示，膳食花青素，特别是飞燕草素的摄入，与视野丢失风险的降低密切相关。

2.3 网络药理学分析飞燕草素防护视觉损伤

SwissADME平台、SEA服务器、TCMSP数据库获取飞燕草素的靶标共208个，我们在GENECARD数据库中，使用Visual damage为关键词，并且以“智人”作为限制，筛选相关性前2000的靶标。通过Venn Diagrams工具进行交集分析，获得共同作用靶点共53个。GO富集分析提示飞燕草素防护视觉损伤与“光刺激反应”、“氧化应激反应”、“线粒体膜电位调节”有关。

2.4 飞燕草素防护661W视网膜感光细胞光损伤

基于上述网络药理学预测的潜在机制，我们在细胞水平上进一步验证了飞燕草素对光诱导的视网膜损伤的保护作用。为探究飞燕草素对视网膜感光细胞光损伤的防护作用，我们首先利用CCK-8法检测了细胞活力。结果显示，在2600 lx光照下，661W细胞的活力随照射时间延长（24 h， 48 h， 72 h）而显著降低（图4a）；而在光照48 h的条件下，2~15 μmol/L的飞燕草素干预均能显著提升细胞活力（图4b）。形态学观察进一步证实了其保护效应：结晶紫染色与相差显微镜图像显示，光照处理导致细胞密度明显下降，而加入2 μmol/L（Dp-L）和5 μmol/L（Dp-H）飞燕草素则有效缓解了这一现象（图4g，4h）。Calcein-AM/PI荧光染色结果与此一致，光照后死亡细胞（红色）数量显著增加，而飞燕草素干预后活细胞（绿色）增多，表明其有效抑制了光诱导的细胞死亡（图4i）。在机制层面，我们发现飞燕草素的保护作用与维持线粒体功能和抑制铁死亡密切相关。JC-1染色（共聚焦显微镜观察图4c与流式检测图4k）表明，光照引起线粒体膜电位红/绿荧光强度比值下降，即发生去极化，而飞燕草素处理有效缓解了这一变化。同时，流式细胞术检测显示，光照诱导了脂质ROS的积累（图4d）和胞内游离亚铁离子水平升高（图4e），后者也经Ferroorange探针染色通过共聚焦显微镜得以直观观察到（图4j），而飞燕草素干预均能显著逆转这些异常指标。最终的Western Blot蛋白分析表明，飞燕草素能够恢复被光照抑制的GPX4蛋白表达，并上调FTH1的表达，同时抑制了PTGS2的炎症相关蛋白表达（图4f）。综上所述，这些结果证明飞燕草素能够通过维持线粒体膜电位、减少脂质ROS生成及铁蓄积，从而有效减轻光诱导的661W细胞损伤。

3 讨论

花青素，作为一类广泛存在于蓝莓、黑加仑、紫葡萄、黑枸杞、紫甘蓝等深色浆果与蔬菜中的强效天然植物色素，其在维护和提升眼部健康方面扮演着至关重要的多面手角色^{［20， 21］}。其核心价值源于其卓越的抗氧化与抗炎双重特性。在眼球这个高度代谢且易受氧化应激损伤的精密器官内，花青素能有效穿透血视网膜屏障，直接作用于视网膜组织^［22］。

本研究通过整合美国国家健康与营养调查（NHANES）数据库，分析发现飞燕草素摄入与视野丢失具有显著负相关。飞燕草素，作为花青素家族中具有独特化学结构（3'，4'，5'-三羟基取代）和卓越生物活性的重要成员，在维护与促进眼部健康方面展现出显著且多层次的保护效应^［23］。其核心优势在于极强的抗氧化与抗炎效力，尤其擅长清除活性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS），效力常优于其他花青素单体^［24-25］。飞燕草素的抗炎作用主要归因于其B环特有的邻位二羟基苯基结构，使其成为花青素家族中最有效的PTGS2抑制剂。它能同时阻断NF-κB、AP-1和MAPK（包括ERK、JNK和p38）这三大关键炎症信号通路的激活，通过抑制IκB-α降解、p65核转位和c-Jun磷酸化等多重机制，协同抑制炎症关键介质PTGS2的表达，从而发挥卓越的抗炎效果。^［26］。虽然仍需更多临床研究确证，但现有证据强烈支持 飞燕草素作为一种强效的天然植物活性成分，在防御氧化损伤、抑制病理性新生血管、保护视网膜神经元以及维护整体视觉健康方面扮演着关键角色。

为了深入解析飞燕草素的作用机制，我们采用了网络药理学方法进行预测。分析识别出53个飞燕草素作用与视觉损伤的交集靶点，并通过GO与KEGG富集分析，提示“氧化应激反应”、“线粒体膜电位调节”及“光刺激反应”可能是其发挥保护作用的核心生物学过程。基于此预测，我们在光诱导的661W感光细胞损伤模型中进行验证。实验结果不仅确认了飞燕草素能显著提升细胞活力、减少细胞死亡，更重要的是，从多个维度精准验证了网络药理学的预测，飞燕草素有效缓解了线粒体膜电位的去极化，改善光照导致的线粒体功能紊乱。其次，飞燕草素显著抑制了脂质ROS的积累和细胞内游离亚铁离子的升高，调控细胞“氧化应激反应”，并将该过程明确指向了以脂质过氧化和铁蓄积为特征的铁死亡。最终，Western Blot蛋白分析从分子层面揭示了其作用枢纽，飞燕草素通过上调关键的铁死亡抑制蛋白GPX4和铁储存蛋白FTH1，协同增强了细胞的抗氧化与铁代谢稳态能力。此外，PTGS2作为经典炎症指标，近年被确立为铁死亡的一个特异性、高诱导性的生物标志物。在铁死亡过程中，累积的脂质过氧化物会强烈诱导PTGS2的表达，其上调水平与铁死亡的活跃程度密切相关。因此，我们在实验中观察到的PTGS2表达被飞燕草素显著抑制，不仅是对其抗炎活性的验证，更是其有效遏制细胞发生铁死亡的直接证据。

本研究通过整合流行病学、网络药理学与实验验证，系统揭示了飞燕草素在视觉健康保护中的多重作用机制。基于NHANES数据库的人群分析首次确立了膳食飞燕草素摄入与视野丢失风险的显著负相关，为其视觉保护效应提供了有力的现实依据。随后的网络药理学分析精准预测了其作用的潜在靶点与通路，将机制方向指向氧化应激、线粒体功能与光刺激反应等关键生物学过程。细胞水平的验证实验不仅证实了这些预测，更深入揭示了飞燕草素通过抗铁死亡防护视网膜。具体而言，飞燕草素通过维持线粒体膜电位稳定、抑制脂质ROS生成、降低细胞内游离铁水平，并上调GPX4和FTH1等核心蛋白的表达，有效阻断了铁死亡通路。这些发现不仅为理解花青素类化合物的视觉保护机制提供了新的理论深度，也为将飞燕草素开发为预防光诱导视网膜变性的膳食补充剂或药物候选物奠定了坚实的科学基础。

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基金资助

国家自然科学基金(82073539)

成都市医学科研项目(2026093)