柚皮素调控叉头转录因子1/β-连环蛋白通路对过氧化氢诱导的人牙周膜干细胞氧化损伤的保护作用研究

Investigating the protective effect of naringenin on hydrogen peroxide induced oxidative damage of human periodontal ligament stem cells by regulating the forkhead box protein O-1/β-catenin pathway

摘要

目的 探究柚皮素（NAR）对氧化应激状态下人牙周膜干细胞（hPDLSCs）成骨潜能的保护作用及其相关机制。 方法 用过氧化氢（H₂O₂）建立hPDLSCs氧化损伤模型，然后加入不同浓度的NAR及0.5 μmol/L的叉头转录因子1（FOXO1）抑制剂AS1842856对其进行干预。利用细胞计数试剂盒法（CCK8）筛选出H₂O₂及NAR的最适作用浓度。通过碱性磷酸酶（ALP）染色和实时荧光定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组hPDLSCs中ALP、Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）的表达情况，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和活性氧荧光探针（DCFH-DA）染色检测各组hPDLSCs中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）以及乳酸脱氢酶（LDH）的表达情况。同时，使用qRT-PCR和蛋白印迹法（Western blot）分别检测各组FOXO1和β-连环蛋白（β-catenin）的基因与蛋白表达水平。 结果 H₂O₂暴露导致hPDLSCs氧化损伤增加，细胞内ROS水平上升，MDA、LDH表达升高（P<0.05）；成骨分化降低，ALP染色变浅和成骨分化相关基因ALP、RUNX2、OCN的信使核糖核酸（mRNA）表达水平降低（P<0.05）。NAR共处理可缓解H₂O₂所致的hPDLSCs氧化损伤并提升其抗氧化能力、恢复其成骨能力。FOXO1抑制剂AS1842856可下调β-catenin的表达（P<0.05），明显减弱NAR的抗氧化作用及恢复成骨的能力（P<0.05）。 结论 NAR可以通过激活hPDLSCs内的FOXO1/β-catenin信号通路从而提升hPDLSCs的抗氧化能力，减轻氧化应激损伤及其所致的成骨能力丧失。

Abstract

Objective Investigating the protective effect of naringenin (NAR) on the osteogenic potential of human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs) under oxidative stress and its related mechanisms. Methods The oxidative damage model of hPDLSCs was established using hydrogen peroxide (H₂O₂) and_{the hPDLSCs were treated with different concentrations of NAR and 0.5 μmol/L forkhead box protein O-1 (FOXO1) inhibitor AS1842856. After that, the cell counting kit-8 (CCK8) was used to determine the optimal concentrations of H2O2 and NAR. The alkaline phosphatase (ALP) staining and real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) were employed to assess the expression of ALP, runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and osteocalcin (OCN) in hPDLSCs of each group. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) staining were utilized to evaluate the expression of reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA) and lactate dehydrogenase (LDH) in hPDLSCs. Meanwhile, qRT-PCR and western blot were used to detect the expression levels of FOXO1 and β-catenin, both are pathway related genes and proteins. Results H2O2 exposure led to an increase in oxidative damage in hPDLSCs, characterized by a rise in intracellular ROS levels and increased expression of MDA and LDH (P<0.05). At the same time, the osteogenic differentiation ability of hPDLSCs decreased, as evidenced by lighter ALP staining and reduced expression levels of osteogenic differentiation-related genes ALP, RUNX2 and OCN (P<0.05). Co-treatment with NAR alleviated the oxidative damage in hPDLSCs, enhanced their antioxidant capacity, and restored their osteogenic ability. The FOXO1 inhibitor AS1842856 downregulated the expression of β-catenin (P<0.05) and significantly diminished both the antioxidant effect of NAR and its ability to restore osteogenesis (P<0.05). Conclusion NAR can enhance the antioxidant capacity of hPDLSCs by activating the FOXO1/β-catenin signaling pathway within hPDLSCs, thereby mitigating oxidative stress damage and alleviating the loss of osteogenic capacity.}

Graphical abstract

关键词

牙周膜干细胞 / 叉头转录因子1/β-连环蛋白信号通路 / 氧化应激 / 柚皮素 / 成骨分化

Key words

periodontal ligament stem cells / forkhead box protein O-1/β-catenin signaling pathway / oxidative stress / naringenin / osteogenic differentiation

牙周炎是由病原微生物及局部刺激引起的慢性炎症性疾病，可导致牙周支持组织的丧失，是引起成年人牙齿缺失的重要原因^[1]。传统的牙周治疗如龈下刮治、激光^[2]、引导性组织再生术^[3]等可在一定程度上去除牙周病原体，增加牙周附着，但这些方法并不能恢复牙周组织原来的自然形态和功能。干细胞组织工程有望成为牙周炎治疗的新方法。

然而，虽然人牙周膜干细胞（human perio-dontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有多向分化潜能，是理想的组织再生来源^[4]；但在牙周炎等炎症环境下，细胞处于氧化应激状态，其成骨能力会受损^[5]。因此，改善氧化应激状态下hPDL-SCs的抗氧化能力和成骨能力可能是牙周炎治疗获得良好效果的关键。

叉头转录因子1/β-连环蛋白（forkhead box pro-tein O-1/β-catenin，FOXO1/β-catenin）信号通路是重要的氧化防御通路，在骨代谢的调控中也起着重要的作用^[6]。叉头转录因子1（forkhead box protein O-1，FOXO1）是一种涉及一系列细胞内功能的转录因子，其可介导包括细胞的增殖、分化、凋亡、能量代谢以及氧化应激等反应^[7-8]。同时也是一种有效的氧化应激抑制剂^[9-10]。研究^[11]表明，FOXO1可通过对抗过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和氧化应激来调节成骨细胞的新骨形成。但对于FOXO1/β-catenin信号通路在牙周炎治疗中发挥的作用，目前尚不明确。

柚皮素（naringenin，NAR）是柚皮苷的苷元，属二氢黄酮类化合物，国内外药理学研究表明具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗纤维化等多种药理活性^[12]。NAR可预防肝脏的氧化应激^[13]，缓解糖尿病相关并发症^[14]，促进骨髓间充质干细胞^[15]及hPDLSCs^[16-17]的成骨分化；也可通过上调沉默信息调节因子1/叉头转录因子1（silent information regulator 1/ forkhead box protein O-1，SIRT1/FOXO1）信号通路的表达抑制氧化应激、减轻脑缺血/再灌注损伤^[18]。这提示FOXO1可能参与了柚皮素的生物调节作用。但目前对于NAR在牙周炎治疗中的作用及其潜在分子机制仍尚不明确。

因此，本研究拟通过过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）诱导构建hPDLSCs氧化损伤模型^[19]，探讨NAR对氧化应激状态下hPDLSCs的抗氧化及抗成骨损伤作用的潜在分子机制，以期为NAR在牙周炎治疗中的应用提供实验基础及理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

NAR（纯度>98%，上海思域化工科技有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶、α- MEM培养基、青-链霉素溶液、细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK8）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、乳酸脱氢酶（lacta-te dehydrogenase，LDH）检测试剂盒、BCIP/NBT碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）显色试剂盒、活性氧检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；30%H₂O₂溶液（Sigma公司，美国）；抗FOXO1兔抗体、抗β-肌动蛋白（β-actin）兔抗体、抗β-catenin兔抗体（abcam公司，美国）；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；总蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；AS1842856（MedChemExpress公司，美国）。

1.2 hPDLSCs的分离、培养及鉴定

经西南医科大学附属口腔医院伦理委员会批准（编号：20221107003），收集10~18周岁患者因正畸需要而拔除的健康前磨牙（患者及家属均知情同意）。

刮取牙根中1/3处的牙周膜组织，使用含10% FBS和1%青-链霉素的培养基于5%CO₂培养箱中培养。待原代细胞处于对数生长期时，通过有限稀释法进行纯化后扩大培养，并采用流式细胞术、成骨诱导和成脂诱导对获得的hPDLSCs进行鉴定。

1.3 实验设计

将hPDLSCs置于不同浓度的H₂O₂（0、100、200、300、400 μmol/L）中干预24 h后，利用CC-K8法筛选出最适浓度的H₂O₂用以构建hPDLSCs氧化损伤模型。

然后，使用CCK8法检测不同浓度NAR（0、5、10、25、50 μmol/L）的细胞毒性及其对氧化应激状态下hPDLSCs细胞活性的影响，筛选出适宜浓度的NAR用于后续实验。再以正常hPDLSCs为空白对照组（Control组），300 μmol/L H₂O₂干预下的hPDLSCs为阴性对照组（300 μmol/L H₂O₂组），300 μmol/L H₂O₂分别与5 μmol/L和10 μmol/L NAR共同作用下的hPDLSCs为实验组（H₂O₂+5 μmol/L NAR组、H₂O₂+10 μmol/L NAR组），检测NAR对H₂O₂所致的氧化应激状态下hPDLSCs成骨损伤的保护作用及抗氧化作用。

最后，使用0.5 μmol/L的FOXO1特异性抑制剂AS1842856进一步验证FOXO1/β-catenin信号通路在NAR减轻hPDLSCs氧化应激及保护成骨潜能中的作用。为此，将实验设计为以下4组：H₂O₂组（加入300 μmol/L H₂O₂）、H₂O₂+NAR组（加入300 μmol/L H₂O₂和10 μmol/L NAR）、H₂O₂+AS组（加入300 μmol/L H₂O₂和0.5 μmol/L AS1842856），以及H₂O₂+NAR+AS组（同时加入300 μmol/L H₂O₂、10 μmol/L NAR和0.5 μmol/L AS1842856）。

1.4 CCK8检测

取P3代hPDLSCs，以5×10³个/孔的密度接种于96孔板，每组设置5个复孔。待细胞完全贴壁后，每孔按实验分组加入各自的培养基。继续培养24 h后，每孔加入100 μL含10%CCK8试剂的完全培养基，在培养箱内避光孵育30 min后，于酶标仪上检测各孔在450 nm处的吸光度值并对其进行统计分析。

1.5 ALP染色

将P3代hPDLSCs以2×10⁵个/孔的量接种于6孔板内，待细胞融合度达80%时，根据实验分组分别加入各自的培养基继续诱导培养3 d。然后按NBT/BCIP碱性磷酸酶显色试剂（蓝色）说明书对各组细胞进行染色，光镜下观察ALP的染色情况并拍照。

1.6 实时荧光定量反转录聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative reverse transcription po-lymerase chain reaction，qRT-PCR）

将P3代hPDLSCs以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板内，待细胞融合度达80%时，根据实验分组分别加入各自的培养基。继续培养24 h，再按照PCR试剂盒说明书进行后续操作。

获得qRT-PCR数据结果后，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，采用2^-△△Ct法计算成骨相关基因ALP、Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙素（osteocalcin，OCN）以及信号通路相关基因FOXO1和β-catenin的相对表达量，并进行统计分析。所用引物序列见表1。

1.7 蛋白印迹法（Western blot）

将P3代hPDLSCs以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板内，待细胞融合度达80%时，根据实验分组分别加入各自的培养基继续培养24 h。然后提取各组细胞的总蛋白，按照BCA蛋白检测试剂盒说明书进行蛋白浓度测定，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，快速封闭液封闭20 min后，分别加入1∶2 000稀释的FOXO1、β- catenin和β-actin一抗，4 ℃孵育过夜。次日，经含Tween 20的Tris盐缓冲液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗膜后，用辣根过氧化物酶（H-RP）标记的二抗孵育1 h，TBST再次洗膜后，采用电化学发光法（electrochemiluminescence，ECL）显影，全自动化学发光图像分析系统采集图像，并应用Image J软件对所得图像进行分析。

1.8 细胞内ROS的测量

将P3代hPDLSCs以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板内，待细胞融合度达80%时，根据实验分组分别加入各自的培养基。处理细胞24 h后，加入含10 μmol/L活性氧荧光探针（DCFH-DA）的基础培养基1 mL孵育细胞20 min，荧光显微镜下观察拍照。

1.9 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

将P3代hPDLSCs以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板内，待细胞融合度达80%时，根据实验分组分别加入各自的培养基。处理细胞24 h后收集上清液和细胞裂解液，按试剂盒说明书对MDA、LDH含量进行测量。

1.10 统计学处理

采用Graph Pad Prism 6软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hPDLSCs的鉴定及H₂O₂和NAR对hPDLSCs活性的影响

分离纯化获得hPDLSCs（图1A、B）并对其进行茜素红及油红O染色，结果显示其具有良好的成骨、成脂分化潜能（图1C、D）。

流式细胞术结果显示其CD44、CD90抗原阳性表达，CD34、CD45抗原阴性表达（图2）。

用不同浓度H₂O₂处理后，当H₂O₂浓度增加到300 μmol/L时，hPDLSCs的细胞活力与0 μmol/L H₂O₂组相比明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）（图3A）。

因此，在后续的实验中，用300 μmol/L H₂O₂处理24 h诱导hPDLSCs的氧化应激。

CCK8结果显示，0~50 μmol/L的NAR处理对hPDLSCs的细胞活力无显著影响（P>0.05）（图3B），说明50 μmol/L以内的NAR对hPDLSCs无毒性。

用NAR与H₂O₂共处理24 h时，当NAR浓度在5 μmol/L时即可减弱H₂O₂的作用（P<0.05），且NAR浓度为10 μmol/L时其对细胞的保护作用较5 μmol/L时更好（P<0.05）；但NAR浓度在10~50 μmol/L时，其对细胞的保护作用无明显差异（P>0.05）（图3C）。

因此，笔者选择10 μmol/L NAR处理进行其抗氧化保护研究，并以5 μmol/L NAR处理作为低水平保护对照组。

2.2 NAR对氧化应激状态下hPDLSCs成骨潜能的保护作用及抗氧化作用

与空白对照组相比，300 μmol/L H₂O₂组成骨相关基因ALP、RUNX2、OCN的表达水平均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而H₂O₂+5 μmol/L NAR组较300 μmol/L H₂O₂组可在一定程度上提高其成骨相关基因的表达水平（P<0.05），且H₂O₂+10 μmol/L NAR组成骨相关基因的表达水平进一步提高（P<0.05）（图4A~C）。

ALP染色结果显示：300 μmol/L H₂O₂处理组ALP染色比空白对照组浅；H₂O₂+5 μmol/L NAR组与H₂O₂+10 μmol/L NAR组ALP染色均比空白对照组浅，但均深于300 μmol/L H₂O₂处理组，且H₂O₂+10 μmol/L NAR处理组深于H₂O₂+5 μmol/L NAR处理组（图4D、E）。

DCFH-DA染色结果表明，300 μmol/L H₂O₂处理组ROS水平较空白对照组明显升高，NAR处理可降低细胞内ROS水平，且H₂O₂+10 μmol/L NAR处理组ROS水平降低更为明显（图5A）。

ELISA结果显示300 μmol/L H₂O₂处理组LDH、MDA漏出率较空白对照组明显升高，其差异有统计学意义（P<0.05）；经NAR干预的细胞LDH、MDA漏出率较300 μmol/L H₂O₂处理组明显降低（P<0.05），且H₂O₂+10 μmol/L NAR处理组较H₂O₂+5 μmol/L NAR处理组降低幅度更大（P<0.05）（图5B、C）。

2.3 NAR上调hPDLSCs中FOXO1、β-catenin基因及蛋白的表达

为了探究NAR对氧化应激状态下hPDLSCs的成骨潜能保护作用及抗氧化作用的潜在机制，笔者检测了hPDLSCs中FOXO1和β-catenin的基因及蛋白表达水平。

qRT-PCR和Western Blot结果均显示，与对照组相比，300 μmol/L H₂O₂处理组FOXO1和β-

catenin的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），但NAR共处理（H₂O₂+NAR组）可增加FOXO1和β-catenin的mRNA和蛋白表达，且10 μmol/L NAR（H₂O₂+10 μmol/L NAR组）效果更为显著（图6）。

2.4 NAR通过FOXO1/β-catenin信号通路调节hPDLSCs的骨形成与氧化应激状态

qRT-PCR和Western blot结果均显示，使用FO-XO1抑制剂AS1842856后，会在一定程度上减弱NAR上调hPDLSCs中β-catenin mRNA（P<0.05）（图7A）和蛋白表达的作用（P<0.05）（图7B、C）。

FOXO1抑制剂AS1842856也可在一定程度上阻断NAR对hPDLSCs中成骨相关基因ALP、RUNX2、OCN表达的促进作用（P<0.05）（图8 A~C）；ALP染色也提示NAR可改善H₂O₂处理导致的成骨能力降低，而FOXO1抑制剂AS1842856可减弱这一上调作用（图8D、E）。

同时，NAR共处理可明显抑制H₂O₂处理导致的ROS上升，而AS1842856处理后则会减弱这一抑制作用（图9A）。

ELISA结果也显示，NAR共处理组MDA、LDH的表达低于H₂O₂组，而FOXO1抑制剂AS-1842856则可在一定程度上提高其表达水平（P<0.05）（图9B、C）。

3 讨论

牙周炎症条件下，菌斑及菌斑微生物如牙龈卟啉单胞菌^[20]等可破坏牙齿周围软硬组织，引起白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等的释放，致使多形核粒细胞的数量和活性增加，进而释放ROS，导致氧化应激状态的产生以作为宿主对感染的反应。ROS的集聚可诱导牙龈成纤维细胞的凋亡，激活破骨细胞，损伤hPDLSCs的成骨能力，最终导致牙龈组织、牙周韧带和牙槽骨的氧化损伤增加^[21]。

本研究中，笔者发现300 μmol/L H₂O₂即可导致hPDLSCs的细胞活力明显降低；且经300 μmol/L H₂O₂干预后，hPDLSCs内ROS水平、MDA及LDH的表达量均明显增加，但其成骨相关基因（ALP、RUNX2及OCN）的表达及ALP染色却均降低，证实300 μmol/L的H₂O₂可诱导hPDLSCs的氧化应激状态，且氧化应激状态可损伤hPDLSCs的成骨能力。这与其他学者^[21-22]的研究结果一致。

NAR是一种常见的植物化学物，广泛存在于各类膳食纤维（如柑橘类水果、番茄、无花果等）及中草药（如骨碎补等）中^[23]。大量研究表明，NAR具有抑制氧化应激状态，保护各种细胞及组织免受氧化损伤、抗炎和促进骨再生等作用^[24]，且毒性较低^[25]，故其在牙周炎的治疗中可能具有一定的临床应用前景。

本研究中，经NAR（5、10 μmol/L）处理后，H₂O₂所致的hPDLSCs氧化应激状态得到改善，其细胞活力和成骨能力也均得到一定程度的恢复。说明适宜浓度的NAR（0~50 μmol/L）安全无毒，且可激活细胞抗氧化系统以保护hPDLSCs免受H₂O₂诱导的氧化损伤，并有助于部分恢复H₂O₂导致的细胞成骨能力受损。上述结果提示NAR有望成为牙周炎治疗的潜在新药物。

FOXO1不仅是细胞氧化还原平衡中最主要的调控因子，可在各种由氧化应激导致的疾病中作为氧化应激的有效抑制剂^[9-10,26]；同时也对骨改建的调控起着至关重要的决定性作用^[27]。

据报道，FOXO1与氧化应激之间存在交互影响，FOXO1可通过靶向激活抗氧化相关基因进而调控细胞抗氧化因子的产生和氧化应激反应，同时FOXO1的活性又受到氧化应激相关产物（如ROS）的调节^[28]。在骨改建方面，氧化应激状态会导致FOXO1发生核转位和转录激活。进入细胞核内且处于激活状态的FOXO1一方面可直接与下游成骨分化相关基因RUNX2、ALP、OCN的启动子靶向结合，促进成骨相关基因的转录，进而发挥其促成骨分化的作用^[29]；另一方面，细胞核内的FOXO1也可作为转录阻遏因子，通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ的转录促进成骨细胞生成^[30]。

近年来，有学者^[31]发现，β-catenin不仅是细胞成骨分化所必需的关键因子，同时也是FOXO1下游的关键细胞信号调节蛋白，其对氧化应激状态下FOXO1的激活至关重要。

在氧化应激状态下，进入细胞核内的FOXO1会与TCF/LEF复合物竞争性地结合β-catenin，激活FOXO1的转录活性^[32]，促使经典的Wnt/β-catenin信号通路向FOXO1/β-catenin信号通路转变，进而对成骨分化产生抑制作用^[33]。FOXO1/β-catenin信号通路的加入使得FOXO1在骨组织的改建过程中起着重要的双向调控作用^[29]。

目前大量研究对FOXO1在氧化应激状态下骨改建中的作用进行了探索，证实FOXO1对氧化应激状态下的成骨分化具有正向促进作用。

Wang等^[34]通过实验发现FOXO1在牙周炎患者的牙周组织中低表达。Huang等^[26]也观察到过表达FOXO1可降低TNF-α诱导的炎性hPDLSCs细胞内ROS水平，增加炎性hPDLSCs的抗氧化能力。同时，上述研究均证实过表达FOXO1可促进TNF-α诱导的^[26]和牙周炎患者牙周组织来源的^[34]炎性hPDLSCs的成骨分化。王泽凤等^[35]的研究也发现，红景天苷可通过激活FOXO1/β-catenin通路增强抗氧化应激作用，进而实现对骨质疏松大鼠的保护。

与此类似，笔者在本研究中也发现，H₂O₂作用下hPDLSCs中FOXO1和β-catenin的基因及蛋白表达均降低；而NAR可上调H₂O₂所致的氧化应激状态下hPDLSCs中FOXO1和β-catenin的基因及蛋白表达；且使用FOXO1抑制剂AS1842856后，hPDLSCs中β-catenin的基因及蛋白表达降低，NAR对氧化应激状态下hPDLSCs的保护作用减弱，其成骨潜能也降低；提示NAR对氧化应激状态下hPDLSCs氧化损伤及成骨潜能的保护作用部分是通过激活FOXO1/β-catenin通路实现的。

但是，因为FOXO1和β-catenin两者均具有核转位趋势^[32]，且两者均可直接或间接参与细胞成骨分化的各个部分，并与细胞内诸多因子及信号通路之间存在交互影响，故对该信号通路在细胞成骨分化中的具体影响及深层机制仍尚有待进一步研究。

综上所述，本研究证实，NAR可抑制H₂O₂所致的hPDLSCs的氧化应激及成骨潜能的损伤，且该作用部分与FOXO1/β-catenin信号通路有关。这将在一定程度上为牙周炎的治疗以及NAR的临床应用提供新的理论参考。

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基金资助

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