香芹酚通过磷脂酰肌醇3-激酶途径诱导牙周炎牙槽骨修复的机制研究

Mechanism underlying carvacrol-induced alveolar bone repair via the phosphatidylinositol 3-kinase pathway in periodontal disease

摘要

目的 本研究旨在探究香芹酚（CV）在调节牙周炎中牙槽骨修复作用的机制。 方法 通过结扎第一磨牙并注射脂多糖（LPS）建立大鼠牙周炎模型（P组），并设立对照组（C组）。治疗模型分别接受低剂量（L组）、中剂量（M组）和高剂量（H组）的CV水凝胶。采用苏木精-伊红染色观察牙周组织的病理变化。采用免疫组织化学染色分析Ⅰ型胶原（COL1）和runt相关转录因子2（Runx2）的表达。在体外实验中，将大鼠成骨细胞分为C、P、L、M、H、CV和CV+LY294002（CV+LY）组。通过Western blot分析检测牙龈组织及体外成骨细胞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）通路相关蛋白和成骨蛋白。采用定量逆转录聚合酶链反应测定炎症因子和成骨蛋白基因的表达。使用碱性磷酸酶（ALP）显色试剂盒和茜素红S染色试剂盒评估成骨能力。通过免疫荧光（IF）检测成骨细胞中COL1的表达情况。透射电子显微镜检测细胞凋亡情况。 结果 CV水凝胶可缓解牙周症状，上调PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白和成骨蛋白的表达，增加ALP表达和钙化结节数量。同时它降低了细胞凋亡和炎症因子的水平。LY294002抑制PI3K/AKT通路，并降低成骨蛋白表达、ALP染色和钙化结节数量。 结论 CV水凝胶通过激活PI3K通路并抑制炎症诱导的骨吸收，促进牙槽骨成骨细胞的增殖和分化。本研究强调了CV在治疗牙周炎方面的潜力。

Abstract

Objective This study aims to explore the mechanism of carvacrol (CV) in regulating alveolar bone repair in periodontal disease. Methods A rat model of periodontal disease (P group) was created by ligating the first molar and injecting lipopolysaccharide (LPS). A control model (C group) was also created. The treatment models received low (L group), medium (M group), and high (H group) doses of CV hydrogel. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes in periodontal tissues. Immunohistochemical staining was employed to analyze the expression of collagen typeⅠ(COL1) and Runt-related transcription factor 2 (Runx2). In vitro, the rat osteoblast cells were divided into C, P, L, M, H, CV and CV+LY294002 (CV+LY) groups. Western blot analysis detected the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT)/glycogen synthase kinase 3 beta (GSK-3β) pathway-related and osteoblastic proteins. Quantitative reverse-transcription po-lymerase chain reaction was used to measure the expression of inflammatory factors and osteoblastic proteins. The alkaline phosphatase (ALP) colorimetric kit and alizarin red S staining kit were utilized to assess osteogenic ability. Immunofluorescence (IF) was used to detect COL1 expression in osteoblasts. Transmission electron microscopy was applied to detect cell apoptosis. Results CV hydrogel alleviated periodontal symptoms, upregulated PI3K/AKT/GSK-3β pathway-related and osteoblastic proteins, and increased the expression of ALP and the number of calcified nodules. However, it decreased cell apoptosis and inflammatory factors. LY294002 inhibited the PI3K/AKT pathway and decreased osteoblastic protein expression, ALP coloration, and calcified nodule quantity. Conclusion CV hydrogel promotes the proliferation and differentiation of alveolar bone osteoblasts by activating the PI3K pathway and inhibiting inflammation-induced bone resorption. This study emphasizes the potential of CV for the treatment of periodontal diseases.

Graphical abstract

关键词

香芹酚 / 牙周炎 / 成骨细胞 / 磷脂酰肌醇3-激酶 / 脂多糖

Key words

carvacrol / periodontal disease / osteoblasts / phosphatidylinositol 3-kinase / lipopolysaccharide

牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病，对人类的健康和生活质量造成显著影响^[1]。其病理特征表现为牙齿支持组织的进行性破坏，包括牙槽骨吸收、牙齿松动甚至脱落，并可能引发全身性不良反应^[2-3]。香芹酚（carvacrol，CV）是一种从百里香和牛至中提取的单萜类化合物，因其来源广泛、成本低廉且安全性较高而备受关注^[4]。研究^[5]表明，CV具有多种生物学特性，如抗炎、抗菌、抗氧化及骨保护作用。前期研究^[6]发现，CV对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）等牙周炎关键病原体表现出显著抑制作用，并能有效减少牙槽骨吸收。这些特性使其成为治疗牙周炎的潜在候选药物。

尽管CV在牙周炎治疗中的潜力已被初步证实，但其促进牙周组织修复的具体机制尚未完全阐明。特别是CV在调控成骨过程（如成骨细胞增殖与分化）中的作用仍需进一步研究。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路在细胞生长、增殖、迁移、代谢及存活等方面发挥重要作用^[7]，其激活可促进成骨细胞增殖与分化^[8]。此外，糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β）作为该通路下游的关键靶点，在成骨过程中亦起重要调节作用。

本研究旨在探讨CV通过抑制破骨细胞活性及增强成骨细胞功能促进牙槽骨修复的作用机制。为此，本研究构建了大鼠牙周炎模型，评估CV对牙周组织修复的影响及其潜在分子机制。旨在为牙周炎的临床治疗提供更为有效的策略。

1 材料和方法

1.1 主要药物和试剂

CV（99%纯度）（南京百慕达生物技术有限公司）；泊洛沙姆407（F127）、泊洛沙姆188（F68）、羟丙基甲基纤维素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC）（Sigma-Aldrich公司，美国）；大鼠成骨细胞ROS17/2.8（北京北纳生物公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（北京索莱宝科技有限公司）；佛罗里达压力敏感电子牙周探针（佛罗里达探针公司，美国）；CCK-8试剂（MCE公司，美国）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色试剂盒、成骨细胞矿化结节染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；LY294002（AbMole公司，美国）；高糖DMEM培养基（大连美仑生物技术有限公司）；胰蛋白酶、青霉素-链霉素（Gibco公司，美国）；一抗（沈阳万类生物技术有限公司）；二抗（武汉塞维尔生物科技有限公司）；定量聚合酶链反应引物（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 动物获取及牙周炎模型建立

本研究的方案已获得东北农业大学兽医审查委员会的批准。

使用4周龄、体重在180~200 g的雄性SD大鼠。除对照组（C组）外，所有大鼠均在麻醉状态下禁食并称重。将它们仰卧固定在实验台上。使用牙周探针在双侧上颌第一磨牙周围创建人工牙周袋。随后，用直径0.2 mm的正畸丝结扎双侧上颌第一磨牙的颈部，确保正畸丝完全埋入牙龈中。然后向牙周袋内注射20 μL LPS，通过结扎法诱导牙周炎^[9]。结扎持续4周。牙龈红肿、探诊出血和牙周袋的出现表明模型建立成功^[10]。最后一次药物干预后，检测大鼠的牙周指标，包括牙龈出血指数（sulcus bleeding index，SBI）和探诊深度（pocket depth，PD），并邀请东北农业大学动物医学院外科实验室和教学动物医院的5位有经验的临床教师检测指标和评估。

1.3 体内试验分组和药物治疗

将32只成功诱导牙周炎的大鼠模型随机分为4组（每组8只），具体如下。1）牙周炎组（P组）：无额外治疗；2）低剂量CV水凝胶组（L组）：注射2.5 μL/mL CV水凝胶；3）中剂量CV水凝胶组（M组）：注射5 μL/mL CV水凝胶；4）高剂量CV水凝胶组（H组）：注射10 μL/mL CV水凝胶。另设对照组（C组），不做任何处理，饲养条件与其他组一致。

将F127、F68和HPMC分别溶解在去离子水中，制备浓度为30%、10%和2.5%的溶液。按F127∶F68∶HPMC=7∶1∶1.5的体积比将3种试剂充分混合，获得空白水凝胶^[11]。随后，向空白水凝胶中加入不同体积的CV，制备3种剂量的CV水凝胶。本研究组前期研究^[6]已证实水凝胶的给药方法和性能是有效的药物递送方式，且注射方法对骨骼无显著损伤。考虑到动物福利，选择去掉牙周炎注射空白水凝胶组，以减少实验鼠的数量。

结扎4周后，去除正畸丝。对于除C组外的所有组，每周2次向牙周袋内注射50 μL相应药物，持续4周。每周2次测量SBI和PD。SBI评分标准^[12]为4级，具体如下。1）0分：无出血；2）1分：探诊后出现点状出血；3）2分：探诊后出现线性出血；4）3分：探诊后出现血溢出龈沟或自发性出血。使用佛罗里达压力敏感电子牙周探针进行牙周探诊，记录牙齿颊侧和腭侧的近中、中央、远中6个位点的PD值^[13]。

1.4 微计算机断层扫描（Micro-CT）扫描

从每组中随机选择4只大鼠，取其上颌牙槽骨样本在4%多聚甲醛固定液中固定，然后进行Mic-ro-CT扫描。扫描参数设置为：管电流200 μA，电压85 kV，全物体扫描，扫描分辨率10.153 741 μm，曝光时间384 ms，扫描角度180°。本实验的样本提交给上海交通大学的权威检测机构进行分析。

1.5 组织学检查

分离上颌组织，固定、脱钙和包埋，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色检测Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，COL1）与runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）。在显微镜下观察组织，并收集和分析图像^[14]。

1.6 Western blot分析

牙龈组织被研磨并用放射免疫沉淀分析缓冲液（含1%苯甲基磺酰氟和1%磷酸酶抑制剂）处理。在4 ℃条件下以12 000 r/min离心10 min。收集上清液，使用二喹啉甲酸法测定蛋白质浓度。蛋白质与上样缓冲液和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）混合后变性，在100 ℃加热10 min，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离，并转移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭2 h后，将膜在4 ℃条件下与一抗孵育过夜，然后在室温（25 ℃）下与二抗孵育2 h。电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂使蛋白条带可视化，并使用化学发光成像系统成像。Western blot检测指标：p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、β-ca-tenin和成骨相关蛋白，后者包括骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、COL1和Runx2。结果以β-actin为内参进行标准化。

1.7 定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-ti-me polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析

使用TRIzol试剂提取总RNA，微量分光光度计测定浓度后定浓，并逆转录成cDNA。采用qRT-PCR测定大鼠牙龈组织中COL1、OPN、Runx2、OPG、ALP、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的mRNA相对表达量，以β-actin作为内参。每个样本重复6次，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。qRT-PCR所需引物序列见表1。

1.8 CCK-8筛选细胞实验给药浓度

大鼠成骨细胞以密度为每毫升5×10³个接种于96孔板中（每孔100 μL），在37 ℃、5%CO₂条件下培养24 h。然后，用含有不同浓度（0、50、100、150、200、250和300 μmol/L）CV的培养基替换原培养基。24 h后，移除原培养基，加入混合有CCK-8试剂（1∶10稀释）的新鲜培养基（每孔110 μL）。在37 ℃、5%CO₂条件下培养2 h，使用酶联免疫吸附测定仪在450 nm处测量光密度（optical density，OD）值。

1.9 细胞培养分组和体外试验

大鼠成骨细胞ROS17/2.8在高糖DMEM培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%青-链霉素。

1.9.1 细胞梯度给药实验

实验分组情况如下。C组：纯培养基；P组：1 μg/mL LPS；L组：1 μg/mL LPS+50 μmol/L CV；M组：1 μg/mL LPS+100 μmol/L CV；H组：1 μg/mLLPS+150 μmol/L CV。

1.9.2 加入PI3K通路抑制剂LY294002验证CV的作用分子机制

实验分组情况如下。C组：纯培养基；P组：1 μg/mL LPS；CV组：1 μg/mL LPS+150 μmol/L CV；CV+LY组：1 μg/mL LPS+150 μmol/L CV+10 μmol/L LY294002。

1.10 ALP和茜素红S染色

细胞以密度为每孔1×10⁵个接种于6孔板中。等待细胞长至80%密度后，将原有培养基替换为成骨培养基。7 d后进行ALP染色^[15]。对于茜素红S染色，细胞培养28 d后按照说明书进行染色。

1.11 qRT-PCR和Western blot分析

qRT-PCR和Western blot的方法和指标与体内试验一致。

1.12 透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察

将对数生长期的细胞接种于培养瓶中，培养24 h后分为C、P、CV和CV+LY组。用胰酶消化细胞，收集并用PBS洗3次。然后，用2%戊二醛固定，用1%四氧化锇后固定，并包埋于Spurr树脂中。最后，将细胞切片并在TEM下观察。

1.13 免疫荧光（immunofluorescence，IF）

细胞以密度为每孔1×10³个细胞接种于24孔板中，培养12 h后分为C、P、CV和CV+LY组。细胞固定后，在室温封闭2 h，4 ℃条件下与COL1抗体（1∶200稀释）孵育过夜。PBS洗涤2次后，室温避光条件下与荧光二抗孵育2 h，再用PBS洗涤3次，DAPI染色。荧光显微镜下观察。

1.14 统计分析

采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析和绘图。数据以均值±标准差表示。采用单因素方差分析分析组间差异。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 体内试验结果

2.1.1 牙周指数检测结果

与C组相比，P组的SBI（P<0.01）和PD（P<0.01）显著增加，L组的SBI（P<0.05）和PD（P<0.01）显著增加，M组的PD显著增加（P<0.05）。与P组相比，H组的SBI（P<0.05）和PD（P<0.01）显著降低。L组、M组、H组之间SBI与PD差异均无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.1.2 Micro-CT结果

与C组相比，P组大鼠的牙槽骨吸收增加，特别是在第一和第二磨牙根部的暴露区域。P组大鼠上颌牙槽骨感兴趣区域的骨矿物质密度（bone mi-neral density，BMD）、骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）均显著低于C组（P<0.01）。相反，P组的骨表面积/骨体积（bone surface/bone volume ratio，BS/BV）和骨小梁分离度（trabecular sepa-ration，Tb.Sp）较高（P<0.01）。因此，牙周炎模型成功建立。与P组相比，H组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著增加（P<0.01），而BS/BV和Tb.Sp显著降低。与M组相比，H组大鼠BMD、BV/TV、Tb.Th均显著增加（P<0.01），BS/BV（P<0.01）和Tb.Sp（P<0.05）显著降低（图1）。

2.1.3 HE染色结果

HE染色后牙周组织组织学检查结果见图2。C组大鼠的牙槽骨相对完整，无明显牙龈组织损伤迹象。相比之下，P组的大鼠出现牙龈乳头丧失、炎性细胞浸润和牙槽骨吸收，牙槽嵴高度降低。与P组相比，H组的牙槽嵴高度有所增加（图2）。

2.1.4 IHC染色结果

与C组相比，P组的大鼠的COL1（P<0.01）和Runx2（P<0.01）蛋白水平显著降低。H组的蛋白表达水平高于P组（P<0.01）（图3、表3）。

2.1.5 Western blot结果

与C组相比，P组大鼠的通路蛋白p-PI3K/PI-3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin均显著降低（P<0.01），成骨相关蛋白OPN（P<0.01）、OPG（P<0.01）、COL1（P<0.05）和Runx2（P<0.01）的相对表达量也都有不同程度的降低。L组大鼠Runx2相较于P组表达显著增加（P<0.01），其余指标与P组间差异无统计学意义（P>0.05）。与P组相比，M组与H组通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、β-cate-nin均显著增加（P<0.01），M组Runx2（P<0.01）、OPN（P<0.05）表达量有不同程度的增加，其余成骨相关蛋白间差异无统计学意义（P>0.05），H组OPN（P<0.01）、OPG（P<0.01）、COL1（P<0.01）和Runx2（P<0.01）表达量显著增加（图4）。

2.1.6 qRT-PCR结果

2.1.6.1 成骨相关基因表达情况

与C组相比，P组的成骨相关基因表达降低，包括COL1（P<0.01）、OPN（P<0.01）、Runx2（P<0.05）和ALP（P<0.01）。与P组相比，L组ALP相对表达量增加（P<0.05），其余成骨相关基因间差异无统计学意义（P>0.05）。M组相较于P组ALP（P<0.05）、Runx2（P<0.05）、COL1（P<0.01）基因表达显著增加，OPN差异无统计学意义（P>0.05）。H组相较于P组COL1（P<0.01）、OPN（P<0.01）、Runx2（P<0.01）和ALP（P<0.01）基因表达显著增加（图5）。

2.1.6.2 炎症因子基因表达情况

与C组相比，P组COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达均显著增加（P<0.01）。相较于P组，L组COX-2、TNF-α、IL-1β基因表达显著降低（P<0.01），IL-6差异无统计学意义（P>0.05）。M组与H组相较于P组COX-2（P<0.01）、TNF-α（P< 0.01）、IL-1β（P<0.01）、IL-6（P<0.01）基因表达均有不同程度的降低（图5）。

2.2 细胞实验结果

2.2.1 CV对成骨细胞活力的影响

使用CCK-8试验评估CV的细胞毒性。50、100和150 μmol/L CV存在时，细胞活力均在90%以上。相反，浓度≥200 μmol/L时，细胞活力降低至90%以下。因此，后续实验使用50、100和150 μmol/L的CV（图6）。

2.2.2 Western blot结果

与C组相比，P组的通路蛋白如p-PI3K/PI3K（P<0.01）、p-AKT/AKT（P<0.05）、p-GSK-3β/GSK-3β（P<0.05）、β-catenin（P<0.05）均显著降低，成骨相关蛋白OPN（P<0.01）、OPG（P<0.01）、COL1（P<0.01）和Runx2（P<0.01）的表达均降低。与P组相比，L组p-GSK-3β/GSK-3β（P<0.05）蛋白表达升高，其余通路蛋白和成骨相关蛋白表达差异均无统计学意义（P>0.05）。与P组相比，M组p-PI3K/PI3K（P<0.01）蛋白表达显著增加，其余通路蛋白差异无统计学意义（P>0.05），成骨相关蛋白OPN（P<0.01）、OPG（P<0.01）、Runx2（P<0.01）表达显著增加，COL1差异无统计学意义（P>0.05）。与P组相比，H组的p-PI3K/PI3K（P<0.01）、p-AKT/AKT（P<0.05）、p-GSK-3β/GSK-3β（P<0.01）、β-catenin（P<0.05）及成骨相关蛋白如OPN（P<0.01）、OPG（P<0.01）、COL1（P<0.05）和Runx2（P<0.01）的表达均显著增加（图7）。

与CV组相比，CV+LY组的p-AKT/AKT（P<0.01）、p-GSK-3β/GSK-3β（P<0.01）、β-catenin（P<0.05）及成骨相关蛋白OPN（P<0.05）、OPG（P<0.05）、COL1（P<0.01）和Runx2（P<0.05）的表达均降低（图8）。

2.2.3 qRT-PCR结果

与C组相比，P组的成骨相关基因表达降低，包括COL1（P<0.01）、OPN（P<0.01）、Runx2（P<0.01）和ALP（P<0.01）。M组相较于P组COL1（P<0.05）基因表达显著增加，其余基因间差异无统计学意义（P>0.05）。H组相较于P组COL1（P<0.05）、OPN（P<0.05）、Runx2（P<0.01）和ALP（P<0.05）基因表达显著增加（图9）。

与CV组相比，CV+LY组的ALP（P<0.01）、OPN（P<0.01）、COL1（P<0.01）和Runx2（P<0.01）基因表达显著降低（图10）。

2.2.4 CV对大鼠成骨细胞分化的影响

高剂量（150 μmol/L）CV增加了ALP含量并促进了矿化结节的形成。CV+LY组ALP染色和矿化结节数量均显著低于CV组（图11）。

2.2.5 IF结果

C组的荧光强度显著高于P组（P<0.01），CV组的荧光强度显著高于CV+LY组（P<0.01）（图12）。

2.2.6 TEM结果

TEM结果显示，P组细胞存在凋亡小体和大量胞质内空泡，CV+LY组细胞有凋亡小体出现，而C组和CV组细胞没有发现明显的凋亡小体产生（图13）。

3 讨论

牙周炎是最常见的炎症性疾病之一，其特征为骨和附着组织的破坏^[16]。它可导致牙龈炎症、牙龈萎缩、骨质松动及骨和牙齿的丢失^[17]。传统治疗主要依赖抗生素，如甲硝唑，这些抗生素在抑制牙周炎病原菌生长和控制炎症方面起着关键作用^[18]。然而，医学研究的进步和治疗理念的演变表明，仅仅抑制细菌生长和控制炎症不足以全面恢复受牙周炎损伤的牙周组织的健康。牙周再生治疗通过诱导成骨细胞的增殖和分化，恢复牙周组织的功能和形态。此外，过度依赖抗生素治疗可能导致药物耐药性^[19]。治疗牙周炎最理想的方法是抑制牙周炎致病菌的同时修复牙槽骨。在这种治疗需求下，具有抗菌、抗氧化和成骨特性的CV^[20]可以成为未来牙周炎治疗的一个新方向。

CV是精油中的一种天然成分，因其抗菌、抗氧化、抗炎、抗凋亡和骨保护作用而得到广泛研究^[21]。CV对牙周炎病原菌表现出优异的抗菌活性。同时，CV来源广泛、价格低廉，安全性较高，具有极大的研究前景。基于这些先前的研究，本研究探讨了CV在调节受牙周炎影响的牙槽骨成骨细胞中的作用，并探索了其在牙周治疗中的潜在应用。

在本研究中，通过结扎和LPS成功在P组诱导了牙周炎，导致牙槽骨丧失。局部施用不同浓度的CV水凝胶4周后，牙周炎症状得到改善，H组相比P组显示出显著的牙槽骨修复。因此，局部应用CV水凝胶可有效治疗大鼠的牙周炎，并能修复牙槽骨。本研究证实CV能促进成骨蛋白的表达。因此，基于本课题组前期的实验结果，CV可能通过双重机制（抑制破骨细胞分化和促进成骨细胞分化）发挥骨修复和再生作用。

PI3K/AKT信号通路促进细胞存活并减少凋亡。该通路在促进骨重塑和发育方面起着核心作用。PI3K/AKT信号通路在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥着关键作用。在成骨细胞的研究中，该通路也被发现与成骨分化密切相关^[22]。因此，如果CV能调节这一通路，它就有可能促进成骨细胞的成骨分化。Xie等^[23]证实CV能增强AKT的磷酸化。

在本研究中，LPS干预后PI3K/AKT通路的磷酸化水平降低；在经过CV治疗后该通路磷酸化水平升高。Wnt/β-catenin经典信号通路与成骨相关，β-catenin是该通路中的关键蛋白，可被GSK-3β降解^[24]。PI3K/AKT通路的磷酸化会使GSK-3β磷酸化，从而防止β-catenin降解，促进其在核内积累，进而促进骨修复和再生。OPG是一种骨保护因子，能抑制破骨细胞途径中受体的结合，从而减少成骨细胞凋亡并促进其增殖^[25]。在使用LY294002阻断PI3K/AKT通路后，CV的治疗效果受到部分抑制。与CV组相比，CV+LY组的OPG、COL1、OPN和Runx2的表达降低，因此减弱了对破骨细胞的抑制。同时TEM下比较CV与CV+LY组发现，阻断PI3K信号通路促进了成骨细胞凋亡。

Western blot分析显示，CV+LY组中p-AKT、β-catenin和成骨相关蛋白的相对表达量显著低于治疗组。成骨细胞在分化后期分泌钙，形成钙化结节^[26]。钙化结节的数量可用于评估成骨能力。ALP是成骨细胞的标志物，有助于评估成骨能力^[27]。ALP表达是骨形成的早期指标，参与并在成骨细胞矿化过程的早期阶段发挥作用^[28]。因此，使用ALP和茜素红S染色试剂盒，对不同药物浓度刺激的成骨细胞进行染色。茜素红S染色可以检测到成熟成骨细胞分泌的钙化结节，验证其成骨能力。在CV+LY组中，ALP染色强度低于治疗组。茜素红S染色显示的钙化结节较少。在实验中，当使用LY294002阻断PI3K/AKT/GSK-3β通路时，CV的成骨能力受到显著抑制。这表明CV的成骨作用与调节PI3K/AKT/GSK-3β信号通路有关。牙槽骨修复是一个复杂的生物学过程，涉及成骨细胞的增殖和分化。由于CV能促进成骨细胞的成骨分化，因此它有可能在牙槽骨修复中发挥积极作用。

体内和体外结果均表明，CV水凝胶有效减轻了与牙周炎相关的炎症反应。H组相较于其他组，表现出更优的牙槽骨修复效果。CV促进大鼠成骨细胞的成骨分化；H组中PI3K/AKT通路的表达与C组没有显著性差异。加入LY294002后，CV+LY组炎症因子的mRNA水平高于治疗组。本研究采用了体内和体外共同验证的方法，但体外实验不能完全模拟体内的状态，因此可能存在一些局限性。

综上所述，CV能够对牙槽骨起到修复作用，促进成骨细胞的增殖和分化，此外，它还能减少成骨细胞凋亡和降低炎症因子的表达，这些作用可能与香芹酚激活PI3K/AKT/GSK-3β通路有关。

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基金资助

2023年黑龙江省“优秀青年”项目(YQ2023C016)